专利名称：从淫羊藿中同时提取分离淫羊藿苷和淫羊藿次苷ii的方法
技术领域：
本发明涉及从淫羊藿中同时提取分离淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的方法。
背景技术：
淫羊藿，是一种传统的补益中药，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等多种功效。由于现代天然药物化学学科的发展，对淫羊藿中的单体活性成分的研究越来越多。淫羊藿苷，是从淫羊藿中提取分离的单体之一，对于改善心血管系统、调节内分泌、增强免疫力、性激素样作用以及抗肿瘤、抗肝毒等方面都有积极的疗效作用。淫羊藿次苷II，是近几年从淫羊藿中开发出的新单体，在血管内皮细胞功能改善作用中优于淫羊藿苷；在抑制脂质过氧化、总抗氧化能力和还原力方面，均具有明显的抗氧化能力；此外还同·样具有和淫羊藿苷部分相同的药理作用(健骨、性激素样等)。由于淫羊藿苷和淫羊藿次苷II突出的药理作用，已经使其在治疗骨质疏松、免疫系统、心脑血管或抗癌、防癌的药物或保健品中占据重要地位，其开发应用和研究前景更宽阔。针对淫羊藿的上述黄酮类成分，目前已有相关制备方法的报道。如专利号03141371. 4，该专利中将淫羊藿水提醇沉收，上DlOl大孔吸附树脂，并用85%乙醇进行洗脱，最终得到总黄酮含量在50%以上的淫羊藿提取物，其中，淫羊藿苷含量可达到9%左右。但，上述专利中，提取物中，淫羊藿苷的含量较低，若还需对淫羊藿苷的进一步分离纯化，后续操作更为复杂，成本较高。专利申请号CN 200710133883. 3，该专利申请中，将淫羊藿用70%乙醇提取后，经二氯甲烷脱杂、乙酸乙酯萃取后，再上DM130大孔树脂，先以碱溶液、20%乙醇冲洗除杂后，再以60%乙醇洗脱，干燥后，提取物中淫羊藿苷含量达到52%，收率达45. 11% ;该专利还指出，55%-60%乙醇对淫羊藿苷的洗脱效果最佳。该专利申请方法，有效提高了淫羊藿苷的纯度，使得后期分离纯化更为简便，但是，该方法中，需采用二氯甲烷，它是一种毒性溶剂，在高浓度时会对人体肝、肾和脑组织造成损伤，而且，它对动物有致癌作用，是人类潜在的致癌物。对于淫羊藿次苷II而言，目前多是采用将淫羊藿苷水解得到，并没有从淫羊藿中有效提纯淫羊藿次苷II的报道，虽然这种方式可以有效提纯淫羊藿次苷II，但该方法已将淫羊藿苷水解，无法同时得到淫羊藿苷，不利于药材资源的利用。目前未见采用同一分离方法直接分离提取淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种环境安全性良好、从淫羊藿中同时提取分离淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的方法。本发明的另一目的在于提供提取分离淫羊藿苷或淫羊藿次苷II的方法。本发明提供了一种从淫羊藿中同时提取分离淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的方法，它包括如下操作步骤(I)取淫羊藿药材，经水提醇沉后，将所得上清液减压浓缩，浓缩液备用；(2)取浓缩液，上非极性或中极性大孔吸附树脂柱，依次用20%_70%V/V乙醇洗脱，分别收集乙醇浓度为40%-45%V/V洗脱液I和乙醇浓度为50%-70%V/V的洗脱液II ；(3)将洗脱液I回收乙醇后，以水-乙酸乙酯系统萃取，收集乙酸乙酯层，回收溶剂后，加入50%-70%V/V乙醇溶解，过滤，滤液冷藏静置，析出固形物，即得淫羊藿苷粗品；(4)将洗脱液II回收乙醇后，以水-乙酸乙酯系统萃取，收集乙酸乙酯层，回收溶剂后，加入50%-70%V/V乙醇溶解，过滤，滤液冷藏静置，析出固形物，即得淫羊藿次苷II粗品O其中，步骤(I)所述水提醇沉过程中，乙醇浓度在60%V/V以上。
进一步地，步骤(I)所述水提醇沉过程中，乙醇浓度为60%V/V。更进一步地，步骤(I)中，所述水提的具体操作如下取淫羊藿药材，加水煎煮2次以上，合并水煎液，减压浓缩至60°C下测定的相对密度为 I. 1-1. 2。其中，步骤(2)中，所述非极性大孔吸附树脂为DlOl型、AB-8型或DM-130型；所述中极性大孔吸附树脂为DM301型。进一步地，步骤(2)的具体操作如下取浓缩液，上DM301、DM-130或AB-8大孔吸附树脂柱，依次用浓度为20%V/V、30%V/V、40%V/V、45%V/V、50%V/V、60%V/V、70%V/V乙醇进行洗脱，并分别收集乙醇浓度为40%-45%V/V的洗脱液I和乙醇浓度为50%-70%V/V的洗脱液II。更进一步地，步骤(2)中，20%V/V乙醇用量为4-5倍柱体积；30%V/V乙醇用量为3-5倍柱体积；40%V/V乙醇用量为4-6倍柱体积；45%V/V乙醇用量为3_5倍柱体积；50%V/V乙醇用量为3-5倍柱体积；60%V/V乙醇用量为4-5倍柱体积;70%V/V乙醇用量为3_6倍柱体积。其中，步骤(3)、(4)中所述乙醇的浓度为60%V/V，所述冷藏的温度为(T4°C。其中，所述淫羊藿苷粗品中，淫羊藿苷含量为45%_50%W/W ;所述淫羊藿次苷II粗品中，淫羊藿次苷II含量为58%-63%W/W。其中，所述淫羊藿选自小檗科植物淫羊藿(Epimedium brevicornu Maxim.)、朝鲜淫羊藿(Epimedium koresnum Nakai.)、箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.)、柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens Maxim.)、巫山淫羊藿(Epimediumwushanense T. (S. Ying)及其近缘替用品种。本发明还提供了一种提取分离淫羊藿苷的方法，它包括如下操作步骤(I)取淫羊藿药材，经水提醇沉后，将所得上清液减压浓缩，浓缩液备用；(2)取浓缩液，上非极性或中极性大孔吸附树脂柱，依次用20%_45%V/V乙醇洗脱，分别收集乙醇浓度为40%-45%V/V洗脱液；(3)将洗脱液回收乙醇后，以水-乙酸乙酯系统萃取，收集乙酸乙酯层，回收溶剂后，加入60%V/V乙醇溶解，过滤，滤液冷藏静置，析出固形物，即得淫羊藿苷粗品。进一步地，步骤(2)的具体操作如下取浓缩液，上DM301、DM-130或AB-8大孔吸附树脂柱，依次用浓度为20%V/V、30%V/V、40%V/V、45%V/V乙醇进行洗脱，收集乙醇浓度为40%-45%V/V的洗脱液。本发明还提供了一种分离淫羊藿次苷II的方法，它包括如下操作步骤(I)取淫羊藿药材，经水提醇沉后，将所得上清液减压浓缩，浓缩液备用；(2)取浓缩液，上非极性或中极性大孔吸附树脂柱，依次用20%-45%V/V、50%-70%V/V乙醇洗脱，收集乙醇浓度为50%-70%V/V的洗脱液；(3)将洗脱液，回收乙醇后，以水-乙酸乙酯系统萃取，收集乙酸乙酯层，回收溶剂后，加入60%乙醇溶解，过滤，滤液冷藏静置，析出固形物，即得淫羊藿次苷II粗品。进一步地，步骤(2)的具体操作如下 取浓缩液，上DM301、DM-130或AB-8大孔吸附树脂柱，依次用浓度为20%V/V、30%V/V、40%V/V、45%V/V、50%V/V、60%V/V、70%V/V 乙醇进行洗脱，收集乙醇浓度为 50%_70%V/V 的洗脱液。与现有技术相比，本发明的优点在于(I)本发明可以在同一种分离方法下，同时实现对淫羊藿苷和淫羊藿次苷II两种单体成分的提取分离，简化了两种单体成分的提取分离流程，充分利用了淫羊藿药材资源，大幅降低了生产成本；(2)本发明提取分离过程中，未使用二氯甲烷等毒性较大的有机溶剂，避免了对操作人员的健康危害，减少了对环境的污染；(3)本发明方法可以分别得到纯度较高的淫羊藿苷粗品(纯度45%_50%)和淫羊藿次苷II粗品(纯度58%-63%)，为两种单体成分的进一步纯化和医药应用提供了高含量的中间体。同时，本发明提取分离方法中，两种单体成分的收率均在80%以上，明显优于现有分离方法。
图I淫羊藿苷对照品的液相色谱图；图2淫羊藿次苷II对照品的液相色谱图；图3淫羊藿苷粗品的的液相色谱图；图4淫羊藿次苷II粗品的液相色谱图。
具体实施例方式本发明中所用淫羊藿，均参照《中国药典》2005版，选自小檗科植物淫羊藿(Epimedium brevicornu Maxim.)、車月鲜淫羊藿(Epimedium koresnum Nakai.)、箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum(Sieb. et Zucc.)Maxim.)、柔毛淫羊藿(Epimedium pubescensMaxim.)、巫山淫羊藿(Epimedium wushanense T. (S. Ying)。其近缘替用品种也可使用。实施例I本发明淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的分离方法I)取朝鲜淫羊藿(Epimedium koresnum Nakai.)药材500g同时测定淫羊藿苷，水份。2)将I)中所述药材用17倍水量浸泡15h，煎煮2h，过滤分别得到药渣和滤液。3)将2)中所得药渣用10倍水量浸泡15h，煎煮2h，过滤分别得到第二次药渣和滤液。
4)将2)和3)中所得滤液合并，两次的药渣丢弃。将合并的滤液静置9h，取其上清液在55°C -70°C段减压旋蒸，浓缩至500ml，在60°C下测定相对密度为I. 1-1. 2范围段，
得到浸膏。5)将4)中所得浸膏加95%乙醇至混合液乙醇浓度为60%，放置10h，离心，取上清液减压蒸懼至500ml。
6)预处理得到大孔树脂，预处理方法为用450g DM301树脂，5%的NaCl溶液处理上清液，再用蒸馏水清洗数次，饱和20h，备用。7)将5)中所得的药液装入6)中所得的大孔树脂柱，再预饱和22h得到饱和大孔树脂。8)用20%乙醇4倍柱体积,30%乙醇3倍柱体积,40%乙醇4倍柱体积,45%乙醇3倍柱体积、50%乙醇3倍柱体积，60%乙醇4倍柱体积，70%乙醇3倍柱体积，80%乙醇3倍柱体积处理7)中所得饱和大孔树脂，得到不同浓度洗脱液40%洗脱液、45%洗脱液、50%洗脱液、60%洗脱液、70%洗脱液。9)将8)中所得的40%洗脱液、45%洗脱液、50%洗脱液、60%洗脱液、70%洗脱液分别进行减压浓缩，回收乙醇并得到不同浓度的流浸膏。10)将9)中所得流浸膏加热，各取乙酸乙酯80ml，分别萃取IOmin弃去水层。回收乙酸乙酯。11)将经10)处理后的浸膏加60%乙醇各30ml,超声21min,过滤,滤洛弃去,滤液备用。12)将11)中所得滤液在(T4°C冷藏过夜，结晶析出沉淀。13)将12)中所得沉淀进行合并，40%_45%洗脱液合并得到46%淫羊藿苷粗品(淫羊藿苷46%，淫羊藿次苷II 2. 5%)，50%-70%洗脱液合并得到59%淫羊藿次苷II粗品(淫羊藿苷0%，淫羊藿次苷II 59%)。所得终产品纯度测定实验方法如下色谱条件Dikma C18色谱柱(4. 5 X 150mm，5 μ m);流动相乙腈(A)-水(B)梯度洗脱，0 7min，30%A，7 8min，30% 45%A，8 20min，45%A ;流速1. Oml/min ;柱温30°C ;检测波长270nm。对照品溶液的制备分别取淫羊藿苷、淫羊藿次苷II对照品适量，精密称定，加甲醇制成每Iml约各含O. Img的溶液，即得。供试品溶液的制备取终产品约O. lg，精密称定，置具塞量瓶中，加稀乙醇50ml溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法分别取上述两种溶液各10μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。测定结果见图1-4。实施例2本发明淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的分离方法I)取淫羊藿(Epimedium brevicornu Maxim.)药材500g 同时测定淫羊藿苷，水份。2)将I)中所述药材用19倍水量浸泡15h，煎煮2h，过滤分别得到药渣和滤液。3)将2)中所得药渣用11倍水量浸泡15h，煎煮2h，过滤分别得到第二次药渣和滤液。
4)将2)和3)中所得滤液合并，两次的药渣丢弃。将合并的滤液静置13h，取其上清液在55°C -70°C段减压旋蒸，浓缩至500ml，在60°C下测定相对密度为I. 1-1. 2范围段，
得到浸膏。5)将4)中所得浸膏加95%乙醇至混合液乙醇浓度为60%，放置8h，离心，取上清液减压蒸懼至500ml。 6)预处理得到大孔树脂，预处理方法为用450g AB-8树脂，5%的NaCl溶液处理上清液，再用蒸馏水清洗数次，饱和18h，备用。7)将5)中所得的药液装入6)中所得的大孔树脂柱，再预饱和24h得到饱和大孔树脂。
8)用20%乙醇5倍柱体积,30%乙醇5倍柱体积,40%乙醇6倍柱体积,45%乙醇4倍柱体积，50%乙醇5倍柱体积，60%乙醇4倍柱体积，70%乙醇6倍柱体积，80%乙醇4倍柱体积处理7)中所得饱和大孔树脂，得到不同浓度洗脱液40%洗脱液、45%洗脱液、50%洗脱液、60%洗脱液、70%洗脱液。9)将8)中所得的40%洗脱液、45%洗脱液、50%洗脱液、60%洗脱液、70%洗脱液分别进行减压浓缩，回收乙醇并得到不同浓度的流浸膏。10)将9)中所得流浸膏加热，各取乙酸乙酯100ml，分别萃取12min弃去水层。回收乙酸乙酯。11)将经10)处理后的浸膏加60%乙醇各50ml,超声18min,过滤,滤洛弃去,滤液备用。12)将11)中所得滤液在0 4°C冷藏过夜，结晶析出沉淀。13)将12)中所得沉淀进行合并，40%_45%洗脱液合并得到49%淫羊藿苷粗品，50%-70%洗脱液合并得到61%淫羊藿次苷II粗品。测定方法如实施例I。实施例3本发明淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的分离方法I)取箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum(Sieb. et Zucc. )Maxim.)药材 5OOg 同时测定淫羊藿苷，水份。2)将I)中所述药材用19倍水量浸泡15h，煎煮2h，过滤分别得到药渣和滤液。3)将2)中所得药渣用7倍水量浸泡15h，煎煮2h，过滤分别得到第二次药渣和滤液。4)将2)和3)中所得滤液合并，两次的药渣丢弃。将合并的滤液静置llh，取其上清液在55°C -70°C段减压旋蒸，浓缩至500ml，在60°C下测定相对密度为I. 1-1. 2范围段，
得到浸膏。5)将4)中所得浸膏加95%乙醇至混合液乙醇浓度为60%，放置6h，离心，取上清液减压蒸懼至500ml。6)预处理得到大孔树脂，预处理方法为用450g DM301树脂，5%的NaCl溶液处理上清液，再用蒸馏水清洗数次，饱和22h，备用。7)将5)中所得的药液装入6)中所得的大孔树脂柱，再预饱和26h得到饱和大孔树脂。8)用20%乙醇6倍柱体积,30%乙醇7倍柱体积,40%乙醇5倍柱体积,45%乙醇5倍柱体积，50%乙醇7倍柱体积，60%乙醇6倍柱体积，70%乙醇6倍柱体积，80%乙醇4倍柱体积处理7)中所得饱和大孔树脂，得到不同浓度洗脱液40%洗脱液、45%洗脱液、50%洗脱液、60%洗脱液、70%洗脱液。9)将8)中所得的40%洗脱液、45%洗脱液、50%洗脱液、60%洗脱液、70%洗脱液分别进行减压浓缩，回收乙醇并得到不同浓度的流浸膏。10)将9)中所得流浸膏加热，各取乙酸乙酯120ml，分别萃取8min弃去水层。回收乙酸乙酯。11)将经10)处理后的浸膏加60%乙醇各70ml，超声22min，过滤，滤渣弃去，滤液备用。12)将11)中所得滤液在0 4°C冷藏过夜，结晶析出沉淀。 13)将12)中所得沉淀进行合并，40%_45%洗脱液合并得到48%淫羊藿苷粗品，50%-70%洗脱液合并得到62%淫羊藿次苷II粗品。测定方法如实施例I。经测定，本发明实施例1-3的提取分离方法中，淫羊藿苷的收率约为80%，淫羊藿次苷II的收率约为85%。实施例4大孔树脂型号筛选大孔树脂预处理方法按照实施例I中同法处理，备用。静态吸附/解吸附试验取处理好的大孔树脂各lg，分别置于50ml具塞锥形瓶中，加入20ml的实施例I步骤5)所得溶液，静置24h，倾出吸附后的残液。大孔树脂用水洗涤过后，用不同浓度的乙醇溶液解吸附。按测定方法测定5)中溶液、残液及解吸液的浓度，并以淫羊藿苷及淫羊藿次苷II总量为指标，按下试计算吸附容量及解吸率，结果见表I。
权利要求
1.从淫羊藿中同时提取分离淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的方法，其特征在于它包括如下操作步骤 (1)取淫羊藿药材，经水提醇沉后，将所得上清液减压浓缩，浓缩液备用； (2)取浓缩液，上非极性或中极性大孔吸附树脂柱，依次用20%-70%V/V乙醇洗脱，分别收集乙醇浓度为40%-45%V/V洗脱液I和乙醇浓度为50%-70%V/V的洗脱液II ； (3)将洗脱液I回收乙醇后，以水-乙酸乙酯系统萃取，收集乙酸乙酯层，回收溶剂后，加入50%-70%V/V乙醇溶解，过滤，滤液冷藏静置，析出固形物，即得淫羊藿苷粗品； (4)将洗脱液II，回收乙醇后，以水-乙酸乙酯系统萃取，收集乙酸乙酯层，回收溶剂后，加入50%-70%V/V乙醇溶解，过滤，滤液冷藏静置，析出固形物，即得淫羊藿次苷II粗品。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)所述水提醇沉过程中，乙醇浓度在60%V/V以上。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(I)所述水提醇沉过程中，乙醇浓度为 60%V/Vo
4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于步骤(I)中，所述水提的具体操作如下 取淫羊藿药材，加水煎煮2次以上，合并水煎液，减压浓缩至60°C下测定的相对密度为I. 1-1. 2。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)中，所述非极性大孔吸附树脂为DlOl型、AB-8型或DM-130型；所述中极性大孔吸附树脂为DM301型。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(2)的具体操作如下 取浓缩液，上DM301、DM-130或AB-8大孔吸附树脂柱，依次用浓度为20%V/V、30%V/V、40%V/V、45%V/V、50%V/V、60%V/V、70%V/V乙醇进行洗脱，并分别收集乙醇浓度为40%_45%V/V的洗脱液I和乙醇浓度为50%-70%V/V的洗脱液II。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于步骤(2)中，20%V/V乙醇用量为4-5倍柱体积；30%V/V乙醇用量为3-5倍柱体积；40%V/V乙醇用量为4_6倍柱体积；45%V/V乙醇用量为3-5倍柱体积；50%V/V乙醇用量为3-5倍柱体积；60%V/V乙醇用量为4_5倍柱体积；70%V/V乙醇用量为3-6倍柱体积。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(3)、(4)中所述乙醇浓度为60%V/V，所述冷藏的温度为(T4°C。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的方法，其特征在于所述淫羊藿苷粗品中，淫羊藿苷含量为45%-50%W/W ;所述淫羊藿次苷II粗品中，淫羊藿次苷II含量为58%-63%W/W。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的方法，其特征在于所述淫羊藿选自小檗科植物淫羊藿(Epimedium brevicornu Maxim.)、車月鲜淫羊藿(Epimedium koresnum Nakai.)、箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum(Sieb. et Zucc.)Maxim.)、柔毛淫羊藿(Epimediumpubescens Maxim.)、巫山淫羊藿(Epimedium wushanense T. (S. Ying)及其近缘替用品种。
11.一种提取分离淫羊藿苷的方法，其特征在于它包括如下操作步骤 (1)取淫羊藿药材，经水提醇沉后，将所得上清液减压浓缩，浓缩液备用； (2)取浓缩液，上非极性或中极性大孔吸附树脂柱，依次用20%-45%V/V乙醇洗脱，收集乙醇浓度为40%-45%V/V洗脱液；(3)将洗脱液回收乙醇后，以水-乙酸乙酯系统萃取，收集乙酸乙酯层，回收溶剂后，力口入60%V/V乙醇溶解，过滤，滤液冷藏静置，析出固形物，即得淫羊藿苷粗品。
12.一种提取分离淫羊藿次苷II的方法，其特征在于它包括如下操作步骤 (1)取淫羊藿药材，经水提醇沉后，将所得上清液减压浓缩，浓缩液备用； (2)取浓缩液，上非极性或中极性大孔吸附树脂柱，依次用20%-45%V/V、50%-70%V/V乙醇洗脱，收集乙醇浓度为50%-70%V/V的洗脱液； (3)将洗脱液，回收乙醇后，以水-乙酸乙酯系统萃取，收集乙酸乙酯层，回收溶剂后，加入60%V/V乙醇溶解，过滤，滤液冷藏静置，析出固形物，即得淫羊藿次苷II粗品。
全文摘要
本发明提供了一种从淫羊藿中同时提取分离淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的方法，该方法通过大孔吸附树脂梯度洗脱，分别得到了高纯度的淫羊藿苷和淫羊藿次苷II提取物。本发明还提供了淫羊藿苷或淫羊藿次苷II的提取分离方法。本发明不仅实现了对淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的同时提取分离，简化了工艺流程，还得到了纯度较高的药物中间体，显著增加了单体成分的收率，提高了药材的利用率，降低了生产成本；同时，本发明方法未使用毒性较大的有机溶剂，保障了操作人员的安全性，实现了绿色生产，具有良好的工业应用前景。
文档编号A61P19/10GK102824394SQ20121034510
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者曾锐, 刘海萍, 瞿燕, 韦涛 申请人:西南民族大学