专利名称：清开灵活性组分金银花提取物在制备抗多重耐药菌的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及金银花的一种新的医药用途，具体地说是在金银花提取物制备抗多重耐药菌药物中的应用。
背景技术：
多重耐药菌(multiple resistant bacteria)是指有多重耐药性的病原菌,即一种微生物对三类(比如氨基糖苷类、红霉素、B —内酰胺类)或三类以上抗生素同时耐药。其中最为多见的是NDM-1、MDR-TB、MDR-MRSA以及常在I⑶中出现的鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌。NDM_l(New Delhi metallo-β-lactamase-l,新德里金属 β -内酸胺酶)，又名 NDM-1 细菌，是一种耐碳青霉烯类的酶。NDM-1基因常由质粒携带，但也整合在细菌的染色体上， 易于在不同的菌株间传播和扩散，NDM-1编码的蛋白单体分子量为28kDa，它的序列和其他 MBL的序列相似性很低。NDM-1主要分布在肠杆菌科和鲍曼不动杆菌中，携带NDM-1的细菌不但包括条件致病菌，也包括致病菌，如常见的志贺氏菌、霍乱、绿脓假单胞杆菌等。它具有高度耐药性，几乎可以水解临床常用的一线抗菌药物，包括β_内酰胺类、碳青霉烯类、氟喹诺酮类、氨基糖苷等。长期以来，抗生素药物的滥用，是催生多重耐药菌的重要原因。目前，多重耐药菌感染呈现出增长趋势，但抗菌药物选择方案却很少，因此重耐药菌感染已成为全球性棘手问题。
金银花(忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.、红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、山银花 Lonicera confusa DC.或毛花柱忍冬 Lonicera dasystyla Rehd.的干燥花蕾或带初开的花)为清热解毒复方中药清开灵注射液的主要原料药，具有宣散风热、清解血毒的功效，对各种热性病，如身热、发疹、发斑、热毒疮痈、咽喉肿痛等证具有显著治疗效果。开发和研究金银花更多更好的医 药功效，是许多中医药学领域的重要研究课题之一。发明内容
本发明的目的就是要开发金银花提取物的新医药用途，同时为临床提供一种可有效拮抗多重耐药菌的药物。
本发明的发明人经长期研究发现金银花提取物对含NDM-1耐药基因细菌具有显著地抑制作用，且与药物浓度成正比，从而发明了金银花提取物的一种新的医药用途，即完成了金银花提取物在制备抗多重耐药菌药物中的应用。
本发明所述的金银花提取物可按照常规的中药提取方法进行。
本发明在此提供的方法如下
(I)取金银花适量，加水煮沸两次，过滤，合并两次滤液；
(2)所得滤液浓缩至原药材I 2倍量体积，加乙醇，冷藏，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，加水稀释，调节PH值为至弱酸性，过滤；
(3)将所得滤液上大孔吸附树脂，依次用水、乙醇洗脱，收集洗脱液，过滤，减压回收乙醇至无醇味，得金银花提取物，冷藏。
其中，步骤(I)中加水煮沸，第一次加水10倍量，煮沸I小时，第二次加水8倍量， 煮沸O. 5小时；步骤(2)中加乙醇使含醇量达80%，冷藏2 4天，加水稀释至相对密度为1. 05 1. 2 (60°C)，所述pH值是5 ;步骤(3)中，洗脱剂水的用量是6 8倍量柱体积，乙醇是10 12倍量柱体积的20%乙醇。
本发明中所述金银花提取物，可按照现有技术所述方法制备成金银花颗粒、金银花冲剂、金银花注射剂、金银花胶囊等药物制剂。
本发明中所述的多重耐药菌是指含有NMD-1基因的多重耐药菌，包括乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii, A. baumannii)、嗜麦芽寡养窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)或含 NDM-1 耐药基因大肠杆菌(Escherichia coli)。
上述含NDM-1耐药基因检测菌 株为革兰氏阴性菌，具有较强的致病性和抗生素耐药性。其中，乙酸钙不动杆菌和鲍曼不动杆菌可引起肺部感染、伤口及皮肤感染、泌尿生殖系统感染、菌血症菌血症、脑膜炎等，麦芽寡养窄食单胞菌能引起严重的呼吸系统感染等， 含NDM-1耐药基因大肠杆菌可引发对肠道感染且对抗生素具有抗药性。
更进一步地，本发明还提供了金银花提取物在制备抗乙酸钙不动杆菌的药物中的应用，即金银花提取物在制备治疗和/或预防乙酸钙不动杆菌引起的疾病的药物中的应用。
更进一步地，本发明还提供了金银花提取物在制备抗鲍曼不动杆菌的药物中的应用，即金银花提取物在制备治疗和/或预防鲍曼不动杆菌引起的疾病的药物中的应用。
更进一步地，本发明还提供了金银花提取物在制备抗嗜麦芽寡养窄食单胞菌的药物中的应用，即金银花提取物在制备治疗和/或预防嗜麦芽寡养窄食单胞菌引起的疾病的药物中的应用。
更进一步地，本发明还提供了金银花提取物在制备抗含NDM-1耐药基因细菌的药物中的应用。
更进一步地，本发明还提供了金银花提取物在制备抗含NDM-1耐药基因大肠杆菌的药物中的应用，即金银花提取物在制备治疗和/或预防含NDM-1耐药基因大肠杆菌引起的疾病的药物中的应用。
本发明所述金银花制剂可用于治疗上述由含NDM-1耐药基因多重耐药细菌引发的疾病，如含NDM-1耐药基因多重耐药细菌引发的肠道感染、呼吸系统感染、伤口及皮肤感染、泌尿生殖系统感染、菌血症菌血症、脑膜炎等，尤其是适用于治疗由乙酸钙不动杆菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽寡养窄食单胞菌或含NDM-1耐药基因大肠杆菌引发的疾病。
本发明所述药物制剂在作为本发明的用途使用时，其具体用量时可根据临床实验以及患者的具体情况确定。具体实施方案
以下通过实施例和试验例来进一步阐述本发明所述药物的有益效果。
实施例1
金银花提取物的制备方法
(I)取金银花适量，加水煮沸两次，第一次加10倍量的水，煮沸I小时，第二次加8 倍量的水，煮沸O. 5小时，过滤，合并两次滤液；(2)所得滤液浓缩至原药材I 2倍量体积时，加乙醇使含醇量达80%，冷藏2 4天，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，加水稀释到相对密度为1. 05 1. 2 (60°C)，调节pH值为5，过滤；(3)将所得滤液上大孔吸附树脂，依次用 6 8倍量柱体积的水洗脱、10 12倍量柱体积的20%乙醇洗脱，收集洗脱液，过滤，减压回收乙醇至无醇味，得金银花提取物，冷藏。
药效学试验
试验例I
金银花提取物对含NDM-1耐药基因细菌的抑菌效果研究
本药效学试验所采用的检测菌株乙酸I丐不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus, A.calcoaceticus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii, A.baumannii)和嗜麦芽寡养窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia, S. maltophilia),均含有 blaNDM-Ι 耐药基因；pGEX-4T-NDMl_DH5 α 是含 NDM-1 重组质粒的大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli) ；pGEX-4T-NDM-l-BL21 (在大肠杆菌 BL21 中表达 NDM-1)是含NDM-1重组质粒的大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)，其质粒上带有GST 标签。上述菌株均由中国人民解放军疾病预防控制所提供。
配制LB琼脂培养基，高压冷却至60°C时，取金银花提取物，按1:9 (药物LB，V/ V)比例配制不同 浓度药物(O. lg/ml、0. 2g/ml、0. 3g/ml)平板，琼脂厚度3_4mm，制备药物平板，备用。
研究金银花对含NDM-1耐药基因细菌讲行抑菌实验:
将4株含NDM-1基因耐药菌株乙酸钙不动杆菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽寡养窄食单胞菌及大肠杆菌PGEX-4T-NDM1-DH5 α分别接种于含16 μ g/ml亚胺培南的LB液体培养基中，37°C、200rpm培养过夜，次日菌液用无菌PBS缓冲液稀释10倍后，分别吸取2 μ I接种于药物琼脂平板表面或采用划线法接种，平板置于37°C孵育24h左右，观察各菌株生长状况， 得金银花提取物的抑菌性测定结果，见表I。
采用琼脂稀释法对金银花提取物的最小抑菌浓度(MIC)进行测定，将耐药菌株接种于不同药物浓度的琼脂平板上，37°C孵育24h左右，观察各菌株生长状况，抑制菌株不能生长的最小药物浓度(MIC值)分别为乙酸钙不动杆菌O. 2g/ml、鲍曼不动杆菌O. 2g/ml、嗜麦芽寡养窄食单胞菌 O. lg/ml、pGEX-4T-NDM-l-BL21 O. 2g/mL·
实验结果表明金银花对耐药菌株均有抑制作用，随着药物浓度的增加，抑制作用明显增强，说明金银花对含NDM-1耐药基因耐药菌都有抑制作用，且抑菌效果明显；药物对不同检测菌株的抗菌能力不同，MIC也有所差异，具有较强的广谱抗含NDM-1耐药基因耐药菌的能力。
表I金银花提取物浓度对菌株的影响
权利要求
1.金银花提取物在制备抗多重耐药菌的药物中的应用。
2.金银花提取物在制备抗含NDM-1耐药基因细菌的药物中的应用。
3.金银花提取物在制备抗乙酸钙不动杆菌的药物中的应用。
4.金银花提取物在制备抗鲍曼不动杆菌的药物中的应用。
5.金银花提取物在制备抗嗜麦芽寡养窄食单胞菌的药物中的应用。
6.金银花提取物在制备抗含NDM-1耐药基因大肠杆菌的药物中的应用。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的应用，其特征在于，所述金银花提取物是由金银花药材加水煮沸两次，过滤，合并两次滤液，所得滤液浓缩后加乙醇使含醇量达80%，冷藏，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，加水稀释到相对密度为1. 05 1.2 (60°C)，调节pH值为5，过滤，将所得滤液上大孔吸附树脂，依次用6 8倍量柱体积的水洗脱、10 12倍量柱体积的20%乙醇洗脱，收集洗脱液，过滤，减压回收乙醇至无醇味，即得。
全文摘要
本发明涉及清开灵活性组分金银花提取物用对乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii，A.baumannii)、嗜麦芽寡养窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)及含NDM-1耐药基因大肠杆菌(Escherichiacoli)具有抑制作用，因此它可用于抑制这些细菌病并用于治疗和/或预防这些细菌引起的疾病。
文档编号A61K133/00GK102988456SQ201210549678
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者刘军锋, 袁静, 张状年, 黄留玉, 李 东, 王雪松, 姜海 申请人:河北神威药业有限公司