任意三个或以上氨基酸残基构成的多肽表位及其相关抗体的诱导的制作方法

任意三个或以上氨基酸残基构成的多肽表位及其相关抗体的诱导的制作方法
【专利摘要】一种含有不同多肽混合物的疫苗，其中各多肽在一些位置有固定的相同氨基酸残基而在另一些位置则是随机数的氨基酸残基，其随机化的程度可以根据需要进行设计。对于一些用现有技术难以诱发抗体的原决定簇，本发明的肽疫苗已显示能够诱导针对这些抗原决定簇的具有高度特异性的抗体，例如针对HIV-1中gp120的V3GPG三肽。
【专利说明】任意三个或以上氨基酸残基构成的多肽表位及其相关抗体的诱导
[0001]与申请相关的交叉引用
[0002]本申请要求美国临时申请的优先权，该美国临时申请的申请号为61/535，988，于2011年9月17日递交。通过引用，其全部内容都包含于此。
【技术领域】:
[0003]本发明与免疫【技术领域】相关。该发明致力于通过多肽疫苗设计和免疫原设计诱导针对任何氨基酸残基构成的表位抗体，而且该方法能诱导出在体外很难以被诱导的抗体。
【背景技术】:
[0004]多肽治疗的进步引起了人们对多肽疫苗的新的兴趣。合成多肽疫苗与以往传统的灭活或减毒疫苗相比有以下优势:容易制备，高安全性，很少甚至没有类似于灭活或减毒微生物疫苗对免疫系统带来的危害。多肽免疫原已被广泛的应用于针对已知特异性表位的抗体诱导。免疫优势表位的氨基酸残基和侧翼氨基酸残基决定特异性表位抗体的诱导。这些优势表位存在于高度突变的病毒如:艾滋病病毒(human immunodeficiency virus, HIV),丙型肝炎病毒(h印atitis C virus，HCV)，由于它们通常都是高度突变位点，所以针对这些优势表位的抗体通常很少具有治疗价值。
[0005]在HIV-1的感染过程中，gpl20可变区通常作为一个诱饵去诱导主要的抗体反应，但病毒通过突变能够有效地逃逸抗体的中和作用。但这些区域即使突变后，HIV-1仍然具有复制能力，感 染新的细胞。Gpl20的保守区域通常不是优势表位，因此也很难诱导出很强的抗体反应。然而有研究表明针对保守表位的抗体能很好的抑制病毒的感染。之前的研究显示在实验室T细胞适应(T-cell-line-adapted，TCLA)的HIV_lgpl20中的第三个可变区(the third variable, V3)是主要的抗体中和区域(principal neutralizingdeterminant, PND);然而该区域的氨基酸序列高度可变,使得诱导的抗体仅具有识别相同序列的特异性，难以获得广谱中和抗体，病毒亦能够轻易逃逸V3特异性中和抗体的抑制；PND区域的这些性质极大地限制了其作为疫苗靶标的可能性，因此在疫苗的研究策略里，PND只能成为有限的潜在靶标。在PND顶端的四个氨基酸残基中，只有三个氨基酸残基是高度保守的，第四个氨基酸是可突变的。前三个氨基酸残基分别是甘氨酸，脯氨酸和甘氨酸(glycine, proline and glycine, GPG)。通过比较 2000 多份 HIV-1 膜蛋白序列发现，95% 以上的V3区的PND顶端含有GPG，然而第四个氨基酸残基在不同病毒中由不同的氨基酸残基构成。其中精氨酸(arginine, R)出现的频率为34%,谷氨酰胺(Glutamine, Q)出现的频率为54%，赖氨酸(lysine，K)出现的频率为4%。GPG均为非极性、疏水氨基酸残基，而第四位氨基酸均为极性或碱性亲水氨基酸残基。功能研究显示PND为HIV-1噬性的主要决定区，而且该区域的单个氨基酸残基的突变都能终止HIV-1感染Suptl和CEM细胞的活性；这些研究显示特定序列的保守氨基酸残基在病毒的功能中发挥着至关重要的作用。多年的抗HIV-1疫苗研究一直致力于诱导识别保守区的广谱中和抗体，但目前只筛选到特异性结合V3区顶端的至少四个氨基酸残基的抗体，没筛选到只特异性结合顶端高度保守的三个氨基酸残基(GPG)的抗体。用于诱导该区域抗体的免疫原多种多样，有病毒样颗粒(virus likeparticle, VLP),重组gpl20，多肽或混合多肽库；免疫的策略也有很多种，像鸡尾酒多肽法，构建人鼻病毒的(human rhinovirus, HRV)嵌合病毒库免疫法,连续的V3多肽免疫法等等；但是这些免疫原和免疫策略都未能成功的诱导出特异性广谱中和抗体，或针对GPG的抗体。虽然像HIV的GPG这种重要的保守表位在抑制病毒感染过程中可能发挥很重要的作用，但是至今为止未能有很好的免疫原和免疫策略能诱导出针对类似GPG这种高度保守但弱免疫原性的表位抗体。综上所述我们急需一种全新的免疫原或免疫策略去诱导针对像GPG这种高度保守但弱免疫原性的功能表位抗体。

【发明内容】

[0006]本发明第一个目标是通过新型理念设计的多肽免疫原所诱导的具有治疗意义的保护性抗体，这些抗体能够抑制像HIV类型的高度突变病毒的感染。
[0007]本发明的第二个目标是通过新型的多肽疫苗诱导出治疗性抗体应用于感染者体内治疗。
[0008]本发明的第三个目标是诱导出能特异性结合三个氨基酸残基的抗体；这三个氨基酸残基所构成的表位可以是由连续的三个氨基酸残基构成，也可以是被其它氨基酸间隔开来的三个不连续的氨基酸构成。本发明中一个特殊的代表事例是诱导特异性结合gpl20的V3区GPG残基的HIV-1广谱中和抗体。
[0009]本发明中所有目标将通过应用基序免疫原来实现。基序免疫原是一个混合的多肽文库，由固定的氨基酸残基和随机的氨基酸残基构成。固定的氨基酸残基存在于多肽库中任意一条多肽中的固 定位置；随机的氨基酸残基随机的出现在多肽链中任意位置。固定的氨基酸残基可以是连续的或者是间断的出现在多肽链中。固定的氨基酸残基通常是依据目标表位的氨基酸残基来设计。取决于所要诱导的抗体及其应用目的，所选的固定氨基酸残基也可以是人为构建的序列。基序免疫原中固定的氨基酸残基通常位于多肽链中间，侧翼由随机氨基酸构成。基序免疫原多肽的最合适的长度为15个氨基酸残基；10-50个氨基酸残基构成的基序免疫原多肽也能诱导出特异性的抗体。实际上该发明适用于任何长度的基序免疫原的抗体诱导。基序免疫原可以通过常规的方法合成，也可以让厂家商业合成；因此基序免疫原的合成方法不是该发明的保护目标。
[0010]本发明不依赖于以往的特定的理论，而是建立在自身的科学假设上。该发明的科学假设是(I)氨基酸残基的随机化能够屏蔽免疫优势表位(2)氨基酸残基的随机化能够帮助固定氨基酸残基成为免疫优势表位；固定氨基残基所构成的表位存在于所有的基序免疫原多肽文库中的所有多肽链中，但是由随机氨基酸残基所构成表位只能随机的存在于极少量的多肽链中；从统计学上分析在基序免疫原的多肽文库里，由固定氨基酸所构成表位的数量将显著性的大于由随机氨基酸残基所构成表位的数量。通过基序免疫原文库策略，文库中没有任何表位的数量能够与固定氨基酸残基构成的目标表位的数量形成竞争，因此即使目标表位的免疫原性非常弱，但因为目标表位的数量在基序免疫原的文库中远远高于其它表位的数量，目标表位在基序免疫原中也将能成为优势表位。综上所述因为基序免疫原能让免疫系统集中在特定的目标优势表位，所以基序免疫原能够诱导出特异性抗体结合由任意氨基酸残基构成的表位，还能诱导出在人体内或正常的动物体内的血液中不存在的特异性抗体。这里必须强调的是侧翼氨基酸的随机化程度将依据使用者的不同目的做出相应调整，从而影响随机化氨基酸序列的组成。随机的氨基酸残基可以是天然的，也可以是非天然的或经人工修饰的；在一些特定的位置减少随机化程度或改变随机化序列中某些特定氨基酸的组成，也能影响固定序列的递呈，从而诱导出所需的抗体。在本发明的代表事例中，由20种天然的氨基酸构成随机氨基酸。其实通过使用少于20种的随机天然氨基酸或者添加一些其它的人造氨基酸也能达到增强目标表位的抗原性同时减弱随机氨基酸构成的竞争表位的抗原性，最终达到让目标表位成为优势表位的效果。如果多肽链中的I个位置上的残基是由20种随机氨基酸构成的，那么这个多肽文库将含有201=20种多肽链；如果多肽链中的2个位置上的残基是由20种随机氨基酸构成的，这个多肽文库将含有202=400种多肽链；如果多肽链中的3个位置上的残基是由20种随机氨基酸构成的，那么这个多肽文库将含有203=8000种多肽链；依次类推，如果多肽链中的10个位置上的残基是由20种随机氨基酸构成的，那么这个多肽文库将含有2010=1.024x1013种多肽链。在特定的条件下，使用常规的技术去改变特定氨基酸残基在多肽合成原料中的比例从而改变随机多肽库的组成和免疫原性进而去诱导不同的免疫反应和特异性的抗体。通过常规技术可以偶联糖基到一个或多个固定的氨基酸残基上，从而合成糖肽再去诱导特异性针对糖肽的线性抗体或构象抗体；也可以通过磺基化等手段去修饰特定的氨基酸残基去诱导相应的特异性抗体。引入非常规的氨基酸到多肽链中的随机氨基酸区域，能够显著的增加多肽的稳定性，进而提高抗体的诱导和治疗效果。出于同样的原因，这个固定的氨基酸残基也不是绝对的。因为在多肽文库中特定的位置出现一定比例的氨基酸残基会让这些氨基酸残基足够的优势去达到优势表位；所以在整个多肽文库中固定的位置，出现100%的氨基酸残基就将会达到更好的免疫效果。综上所述，该发明的应用不受限于随机氨基酸残基的随机化程度和固定的氨基酸残基的固定化程度以及氨基酸残基的类型。本发明的理论依据是通过随机化氨基酸残基去凸显固定的氨基酸残基的免疫优势区或抗原性去诱导抗体；本发明可以依据实际需去调整固定氨基酸残基和随机化氨基酸的随机程度。
[0011]作为本发明的一个代表，GPG基序多肽疫苗被应用在哺乳动物体内诱导特异性针对GPG表位的抗体，这类抗体在以前的研究中从未被报道过。这个多肽文库中的多肽链由15个氨基酸残基构成，序列为:XXXXX XGPGX XXXXC(图9)。该多肽疫苗在本发明中被命名为V3M01。我们通过常规的技术免疫多肽疫苗，在Balb/c小鼠体内诱导了高滴度的针对GPG基序的抗血清。通过单克隆杂交瘤技术，获得了多株杂交瘤单克隆细胞，该细胞能分泌特异性针对GPG表位的单克隆抗体。在HIV假病毒中和试验中，该GPG表位依赖的单克隆抗体能中和任何在HIV V3区的顶端含有GPG表位的HIV假病毒。除此之外，还可以通过类似的方法，运用基序多肽疫苗去诱导针对弱抗原性表位的特定治疗性相关抗体。
[0012]本发明也提供一些在病毒感染者体内，该多肽疫苗治疗的方法和治疗的效果。
[0013]本发明提供特异性结合三个氨基酸残基构成的表位的抗体，并且该抗体的结合特异性不受这三个氨基 酸残基的侧翼氨基酸残基的影响。例如特异性针对GPG表位的抗体，在阻止HIV感染中起到很重要的作用。在权利诉求中，阐述了本发明的各种不同的创新性。为了更好的理解本发明和发明的操作优势以及发明的特定目标，图表和相关的描述将会在后面继续列出，图表和文字将会继续解释该发明的代表实例。【专利附图】

【附图说明】:
[0014]图1，依据本发明，鉴定基序免疫原V3M01免疫小鼠所获得5免后抗血清。AiElisa检测抗血清的滴度，M01-M06对应的为免疫小鼠的编号，blank-serum指未接受免疫的小鼠的空白血清。X轴显示的数值乘以1000倍为小鼠血清梯度稀释的倍数；B:小鼠抗血清结合不同HIV亚型的gpl20 (#，指血清和gpl20结合值与血清和阴性对照的牛血清白蛋白的结合值相比有显著性，存在统计学差异)。
[0015]图2，图中的标示与图1类似，该图显示通过免疫原V3M01免疫新西兰大白兔免疫所获得的抗血清的滴度，RO1-03中的R为兔子的英文简写，01-03为兔子的编号。(将免疫原作为抗原)。
[0016]图3，第五次免疫后兔抗血清结合基序多肽(A，B和C分别是3只兔子抗血清的结合反应);第五次免疫后兔抗血清结合gpl20 (D, E和F分别指3只兔子抗血清的结合反应)。
[0017]图4，鉴定NJU009结合基序多肽(A)，HIV多肽(B)，HIV蛋白(C，D)。D为NJU009在浓度为100ug/ml时结合蛋白的柱状图。
[0018]图5，NJU009单克隆抗体中和各种不同亚型的假病毒。
[0019]图6，鉴定依据本发明免疫含有V2序列中部分氨基酸残基的V2M01免疫原所诱导的兔抗血清(A)和Protein G亲和纯化的多克隆抗体(B)。
[0020]图7，V2M01诱导的多克隆抗体R182，R183, R184(分别为A, B, C)与gpl20的结合 反应。
[0021]图8，鉴定依据本发明免疫原设计的针对gp41序列中部分氨基酸残基所设计的gp41M01免疫原所诱导的第五次免疫后兔抗血清(A) ,Protein G亲和纯化的多克隆抗体(B)和多克隆抗体与gp41中的T20反应。
[0022]图9，显示本发明中特殊代表实例中所设计多肽疫苗的氨基酸序列。X:代表随机的任意氨基酸残基，其它的字母代表氨基酸残基的英文单字母简写。
[0023]图10，来自不同克隆的膜蛋白相关信息，以及在假病毒实验中，广谱中和抗体对假病毒的中和敏感性。抗体的浓度为通过Protein G亲和纯化抗血清或腹水所获得的总抗体浓度。Nab concentrat1n or titer是指在病毒感染细胞达到50%抑制率时的抗体浓度或血清的稀释度。阴性对照是指抑制MuLv假病毒的感染。ND:是指由于血清不够没做相关检测。
[0024]图11，依据本发明，针对流感病毒，丙型肝炎病毒和鸡卵清白蛋白分别设计HAMOI, EMOl和0VAM01，图中显示这些免疫原所诱导的相应抗血清的滴度鉴定。
[0025]图12，V2M01是依据FYXXD基序设计的，固定的氨基酸残基FY与D间隔2个随机氨基酸残基，以X表示；本图中显示抗体与V2M01疫苗多肽的结合反应。
[0026]图13，Gp41M01是依据LDXW基序设计的，固定的氨基酸残基LD与W间隔I个随机氨基酸残基，以X表示；本图中显示抗体与gp41M01疫苗多肽的结合反应。
【具体实施方式】
[0027]免疮原构律
[0028]免疫原基序多肽文库(新型多肽疫苗)的序列是依据本发明以图一的特殊代表实例来设计和说明的；x代表除半胱氨酸以外的任意随机氨基酸残基。基序多肽文库由上海吉尔生化有限公司合成。在多肽的羧基端，用下划线标示的半胱氨酸(cysteine，C)是为了方便偶联载体蛋白。每条多肽免疫原被偶联至匙孔血蓝蛋白，为了方便酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunesorbent assay, ELISA)检测，V3M01 被偶联至牛血清白蛋白。
[0029]免疫小鼠和新西兰大白兔
[0030]免疫原溶于磷酸盐缓冲液(PBS, pH7.4)，浓度为lmg/ml。在第O周进行初免，每只小鼠取100ullmg/ml的免疫原溶液与10ul弗氏完全佐剂进行充分乳化，形成油包水的乳浊液，进行多点腹部皮下注射免疫，免疫6只小鼠。分别在第2周、5周、8周、11周加强免疫4次，每次每只小鼠免疫50ullmg/ml的多肽溶液与50ul弗氏不完全佐剂的乳浊液；第6周、9周、12周采血。
[0031]免疫新西兰大白兔，在第O周进行初免，每只取500ullmg/ml的多肽溶液与500ul弗氏完全佐剂进行充分乳化，形成油包水的乳浊液，进行多点背部皮下注射免疫，免疫3只新西兰大白兔。分别在第2周、5周、8周、11周加强免疫4次，每次每只免疫500ullmg/ml的多肽溶液与500ul弗氏不完全佐剂的乳浊液；第6周、9周、12周采血。小鼠和兔的抗血清通过Protein G/A亲和纯化获得抗体。
[0032]单克隆抗体的制备
[0033]最后一次免疫后I周内，将小鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0)和免疫小鼠的脾细胞按常规PEG方法融合，有限稀释法克隆细胞，间接ELISA筛选特异性抗体，阳性细胞连续亚克隆2次，克隆化后的细胞株经传代确定为稳定的细胞株后，液氮保存。将获得的单克隆细胞株注射至腹腔，制备腹水，亲和纯化获得单克隆抗体，单克隆抗体检测试剂盒鉴定所获得单克隆抗体的亚型。
[0034]酶联免疫吸附实验检测抗血 清效价
[0035]酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunoassay, ELISA)检测板以 10ug/ml 的浓度包被，每孔100ul，4°C孵育过夜后，用4%BSA封闭，每孔200ul，37°C孵育lh，洗涤4次，每孔加入梯度稀释的抗血清10u (I对照为正常小鼠血清)，37°C孵育lh，洗涤4次，每孔加入1:1000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠二抗100ul，37°C孵育lh，洗涤5次后，加10ulP-NPP底物，37°C孵育15min，50ul2M的NaOH中止反应，测定样品在405nm波长下的光密度值(optical density405nm, 0D405nm)。Elisa检测血清的效价规定为在405nm的光密度值为空白对照(即不包被检测原，图中标记为Neg) 2倍以上的最高稀释倍数。
[0036]克隆全长膜蛋白基因和包装假病毒
[0037]从感染者体内未培养的外周血单核细胞的前病毒DNA中PCR扩增全长的膜蛋白基因。PCR设定的条件是预变性94oC2分钟，运行35个循环参数设置如下:94°C 15秒，55°C 30秒，68°C 4分钟；最后延伸68°C 10分钟。不同亚型的引物序列依据已公开的保守亚型序列来设计。PCR扩增的片段被克隆至英俊公司的pcDNA3.1表达的质粒载体，通过直接测序鉴定。通过共同转染表达膜蛋白质粒和表达骨架的pNL43R-E-Luc if erase质粒至293细胞产生膜蛋白依赖的假病毒。对照的假病毒为表达HIV-1HXB2，SF162或JRFL的表面膜蛋白的假病毒以及兼噬性鼠源白血病假病毒。48小时后收集转染后的细胞上清，测定荧光值，标准化假病毒在后续功能分析中的用量。
[0038]抗血.清和单克隆抗体的假病毒中和试验[0039]收集的血清，纯化的抗体以及购买的广谱中和抗体4E10，447_52D，bl2同时被用来做假病毒中和实验分析。所有的血清样品在检测前都经过56°C I小时的热灭活。200TCID50的假病毒与血清或抗体在96孔板内，重复3个孔，37 °C孵育一个小时；加入IX 14个GH0ST(3)X4/R5细胞悬液于每个孔中，37°C 5%C02培养48hr。通过检测荧光素酶的活性来判定中和活性。计算中和抑制率与中和滴度，抑制率=[1-(样品组的RLU均值一细胞对照组CC的RLU均值)/ (病毒对照组VC的RLU均值一细胞对照组CC的RLU均值)]X100%。中和滴度(ID5tl)表述为50%抑制率时的稀释度的倒数。
[0040]V3M01杭血清滴度测定
[0041]2免以后，6只小鼠(M01-06)均被成功诱导出特异性针对免疫原的抗血清(M01-06srm);在五次免疫以后，6只小鼠的抗血清ELISA滴度都大于10，000，空白血清不与免疫原反应(blankSM)，且各小鼠的抗血清效价无显著差异(图.LA)。ELISA血清学分析显示，该抗血清能识别HIV-1囊膜蛋白(gpl20ADA和gpl20IIIB)，但不与阴性对照蛋白BSA (不含GPG表位)结合(图.1.B)。综上所述6只小鼠都能被诱导出高滴度的针对免疫原的抗血清，并能与含有该表位的来源于不同毒株的膜蛋白有很强的结合反应。
[0042]N.TU009单克隆抗体中和活性的鉴定
[0043]NJU009为根据单克隆杂交瘤技术筛选出的单克隆抗体中的中和活性较强的广谱中和抗体。
[0044]假病毒中和体系检验NJU009的中和活性；假病毒由11个初级分离株和2个实验室适应株构成。其病毒亚型有B、B'、C、B'C、CRF07_BC> CRF08_BC、CRF01_AE等不同亚型的假病毒。13株 中的11株假病毒能被NJU009很好的中和，其50%的中和浓度(50%Neutralizat1n Dose, ND50)的范围为抑制 B' C 亚型 CNE16 的 3.7ug/ml 到抑制 C 亚型CNE58的20.5ug/ml;与此同时NJU009不能中和假病毒CNE6和CNElI。JR-FL假病毒为CCR5依赖的毒株，结合V3的抗体向来对该毒株没有很强的中和活性。NJU009中和JR-FL假病毒毒株的ND5tl为27.8ug/ml,针对CXCR4依赖的HXB2假病毒毒株的ND50为34ug/ml.[0045]NJU009能中和几乎所有不同亚型的HIV-1毒株，中和曲线紧密的聚拢在一起说明NJU009的中和活性不受GPG侧翼氨基酸残基变化的影响。其中CNE6和CNEll (均为B’亚型)对NJU009的中和作用完全不敏感，序列比对发现在V3PND区，2个病毒的V3PND区均为极其罕见的序列，CNE6为GLG，而CNEll为GQG，二者均不是常见的GPG序列。该结果说明，NJU009的中和活性是由GPG序列特异性介导的。
[0046]假病毒中和实验中，我们以不依赖CD4受体和辅助受体的MuLv假病毒为阴性对照，我们以鉴定出免疫学性质的广谱中和抗体作为阳性对照抗体，选取的广谱中和抗体有447-52D，bl2和4E10 ;这些阳性抗体的中和活性在本实验中的中和效果与其它文献检测效果基本一致，证明本发明的假病毒中和实验重复性很好。447-52D是迄今为止在针对V3的中和表位(GPGR)中，中和广谱性最广的单克隆抗体；针对HXB2和JR-FL两个毒株的ND5tl分别为0.737ug/ml和19ug/ml。447-52D能很好的中和CFR07_BC亚型的CNE40假病毒毒株，该毒株是我们这个假病毒中和系统里是最容易被中和的毒株。447-52D抑制CNE40的ND5tl为0.14ug/ml。然而447-52D不能中和其它的毒株。bl2为针对⑶4结合表位的特异性抗体，能中和13株假病毒毒株中的7株，ND50的范围为抑制HXB2的0.119ug/ml到抑制CNE5的23.07ug/ml。4E10是针对gp41近膜区表位的广谱中和抗体，能中和所有的13株假病毒。[0047]表位鉴定
[0048]为确定NJU009的广谱中和活性完全是由GPG所介导而不是由周边的氨基酸残基所参与的，我们对NJU009与抗原反应的特异性进行了分析。当将GPG3个氨基酸残基突变为3个丙氨酸(Alanine，A)时，NJU009完全不与突变的多肽结合(图2)说明NJU009对V3的识别是高度GPG特异性，这与假病毒中和活性的观察一致。该结果同时也说明GPG三个残基可能均是NJU009靶位的直接组成部分。NJU009能结合来自不同亚型的V3多肽和含有GPG的不同亚型gpl20，像gpU0.(B亚型)、gpl20BC (BC亚型)和gpl20IIIB (B亚型)。这些结果都说明NJU009是GPG表位依赖的不受侧翼氨基酸残基影响的单克隆抗体。通过RT-PCR我们测得了 6个单克隆抗体的Fv区的氨基酸序列。其中NJU001，NJU003, NJU005三个单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列完全一致，NJU007，NJU008和NJU009的轻链可变区序列也是一致。这些结果显示NJU001，NJU003, NJU005很可能来源于同一个前体杂交瘤细胞；NJU007，NJU008和NJU009将是来源于另一个前体杂交瘤细胞。这些克隆之间的主要差异序列是位于互补决定区和轻链可变区羧基端序列。
[0049]NJU009和447-52D均能识别V3区的顶端的氨基酸序列。447-52D竞争NJU009结合V3多肽的竞争ELISA结果显示竞争结合曲线呈二相曲线(b1-phasic)，在447-52D浓度小于6.25ug/ml时，随着447-52D浓度的提高，NJU009结合gpl20的量依次减弱，最高减少85%的结合。然而结合在gpl20上剩下15%的NJU009需要被多达15倍浓度的447-52D去竞争掉(图2)。这些结果说明NJU009与447-52D的抗体表位有交叉。有大约10%NJU009的结合活性不易受高浓度447-52D影响。
[0050]基序免疫原的可诱导性和动物特异性
[0051]为了鉴定V 3M01的免疫效果是否具有种属特异性，3只新西兰大白兔(R01-03)通过类似小鼠的免疫策略接种V3M01免疫原。结果诱导出了具有相似特异性的血清抗体，5免效价为42，000 (图2)。所有血清抗体均能识别gpl20IIIB和gpl20ADA，和gpl20B’c。这些血清同样具有类似的中和活性和GPG表位依赖性。这些结果说明该免疫原诱导抗体不受动物种属的限制，能在任何种属的动物体内诱导出类似的广谱中和抗体。
[0052]基序免疫方法的广泛应用
[0053]为了说明本发明中的基序免疫靶向诱导抗体不仅适用于诱导针对GPG表位的多肽，还能被应用于其它表位的靶向抗体诱导，我们选择了 gpl20上一些其它序列作为靶向诱导的表位；这些表位是已知有免疫原性的表位，但通过常规的免疫方法很难诱导出针对该表位的抗体。HIV膜蛋白表面的第一个可变区(Variable Reg1nl，Vl)和第二个可变区(Variable Reg1n2, V2)介导广谱交叉中和活性,但很少有针对这些结构域的抗体被诱导出来。我们在V2的顶端选择了 FYXXD作为靶向表位，原因如下:(1)最近从感染者体内分离了两个广谱的中和抗体，PG9和PG16，这两个抗体表位在V2和V3区；氨基酸点突变发现，将第176位苯丙氨酸(Phenylalanine，F)残基突变为A时，两个抗体的抑制病毒感染的IC5tl分别增加了 5000倍和7000倍；(2)第180位的天冬氨酸(Aspartic acid, D)是整合素α4β7结合序列LDL中的氨基酸残基，而整合素α 4β 7是结合外周T细胞的肠粘膜看家受体；(3)第178位的赖氨酸(Lysine，K)和第179为的亮氨酸(Leucine，L)在HIV毒株中不是高度保守，在V2顶端只有F176，Y177和D180是高度保守的，其保守率分别是93%，91%和96%。因此这三个氨基酸残基被构建在针对V2的基序免疫原中。通过化学合成15个氨基酸残基的多肽文库，在多肽文库中Y177和D180被间隔两个氨基酸残基，多肽文库被命名为V2M01。在新西兰大白兔皮下免疫V2M01，5次免疫后，抗血清的ELISA滴度大于80000 (图9和图12)。该抗血清与不同亚型的gpl20蛋白(分别是8?120湯4?12(^和gpl20IIIB)有很强的结合反应，还能结合重组的V2糖蛋白；然而这些抗体没有显示很强的中和活性。Gp41近膜区(Membrane Proximal External Reg1n, MPER)是一个广谱中和表位，针对该表位的广谱中和抗体有4E10和2F5。这两个抗体都是从感染者体内筛选得到，有大量的试验去试图诱导针对该表位的类似于4E10和2F5抗体，但都未能成功。2F5的抗体表位是ELDKWA，这个表位中高度保守的氨基酸残基是L663，D664, W666 ;其保守率分别为98%，97%和99%。因此我们设计了含有这些氨基酸残基，LDXff,的15个氨基酸的多肽文库去诱导抗体，所诱导的抗体能很好的结合T20 (图9和图13)。
[0054]基于以上结果，通过本发明中的靶向抗体诱导技术能够诱导出未知表位和任意氨基酸所构成的表位抗体。我们设计了三个多肽文库，分别为HAM01，OVAMOI, EMOl ;它们分别来源于流感病毒，丙型肝炎病毒和鸡卵清白蛋白。HAMOl中三个固定的连续氨基酸为HHP，这三个氨基酸位于流感病毒HAl蛋白的第199位到201位，是三个高度保守的氨基酸，存在于流感病毒的不同亚型毒株中；目前仅有一个流感病毒的广谱中和抗体S139/1的表位含有HHP。EMOI含有的三个连续的固定氨基酸残基为HRM，这三个氨基酸残基位于丙型肝炎病毒El蛋白的第316位至318位，它们也是高度保守的氨基酸。0VAM01含有的固定氨基酸是位于鸡卵清白蛋白第276位至278位的ERK。这三条多肽文库均诱导出了高滴度的抗体(图 11)。
[0055]不作为本发明的一部分，只是作为本发明的假设；我们的假设认为，本发明的策略是通过最小化侧翼氨基酸序列对选定表位的影响来让选定的表位凸显出来，易于让免疫系统识别。目前我们所获的针对GPG表位的抗体是唯一的；至今为止，从感染者体内没有筛选到任何针对GPG表位的 抗体，只有部分针对GPGR和GPGQ表位的抗体。这些结果说明GPG表位在天然的病毒感染过程中，很难被免疫系统识别或者说只有少量的B细胞克隆能够识别GPG表位，但是在克隆扩增时，该类B细胞克隆可能被丢失。机制研究表明与GPG表位相t匕，GPGR，GPGQ或者GPGK在克隆扩增时都是优势表位，因此在天然感染过程中，针对GPG表位的克隆最终会被丢失。核磁共振通常被用来研究V3多肽和一序列相关抗体的相互作用。
0.5 β是个典型的特异性针对V3的抗体，能够结合到V3多肽的16个氨基酸残基。447-52D是针对V3表位最为广谱的中和抗体，能够通过结合GPGR位点的氨基酸残基与V3多肽发生相互作用；而与0.5β直接结合的氨基酸残基更多，最终在与V3多肽结合时也显示了的更高的亲和力和结合刚性度。因为NJU009只结合V3顶端的三个氨基酸残基，且结合活性不受这三个氨基酸残基周边的氨基酸的影响，所以NJU009在与V3多肽的结合过程中，具有更好的柔性。这或许也是NJU009中和活性最为广谱的原因之一。
[0056]综上所述，本发明将在多肽疫苗应用于临床治疗的过程中具有重要意义。除此之外，根据本发明我们还可以将任意的序列嵌合至多肽或蛋白中作为检测或纯化的标签。
[0057]V2M01 和 gp41M01 的杭血清
[0058]图6A和8A显示V2M01和gp41M01免疫新西兰大白兔后的抗血清能特异性的结合基序免疫原。而且V2M01的抗血清能与不同亚型的gpl20反应。gp41的多肽T20含有基序中的固定氨基酸LDXW ；Gp41M01诱导的抗血清也能很好的结合T20。[0059]本发明的基本创新点已按照应用的代表实例被描述出来。在代表实例中各种不同的省略，替换和改变都是依据本发明的思想来执行的。本发明不只限制于以上所提到代表实例的应用；以上提到的代表实例仅仅是一个为了方便说明的例子而已。实际上该发明还能像附页里专利权利诉求里提到的那样，可以运用各种不同方式的修饰；虽然没有提及具体的例子，但本 发明是有很强的实用价值。因为本发明中所使用的都是常规的实验技术，但发明中的思想，思路和观点是创新的。一旦本发明的思想，思路和观点被阐述出来，该发明就能很简单的应用在常规的【技术领域】去起得创新的成果。
【权利要求】
1.一种多肽疫苗包含一个多肽库其多肽在一些位置会有相同固定的氨基酸残基,而在另一些位置则为随机的氨基酸残基。
2.权利要求1中的多肽疫苗其中固定氨基酸残基的个数为3个。
3.权利要求2中的多肽疫苗其中固定氨基酸残基是在连续的位置上。
4.权利要求2中的多肽疫苗其中固定氨基酸残基可以不在连续位置上，而是被一个或者多个随机氨基酸残基隔开。
5.权利要求1中的多肽疫苗其中固定氨基酸残基的侧翼由随机氨基酸残基构成。
6.权利要求1中的多肽疫苗，其中随机氨基酸的个数可以是5个到50个之间。
7.权利要求6中的多肽疫苗，其中随机氨基酸残基的个数为11个。
8.一种治疗病毒感染的方法，其中使用多条疫苗是一个多肽混合物，这个多肽混合物是一个多肽文库；该多肽文库含有多个固定的氨基酸残基和多个随机的氨基酸残基。
9.权利要求8方法中所提到的病毒感染是指被HIV引起的。
10.权利要求9方法中所提到的病毒感染是指在人体内。
11.权利要求10方法中含有上述多肽疫苗的制作方法和上述多肽疫苗对人体治疗效 果。
12.权利要求8方法中所说的混合物多肽中至少含有400种类别。
13.权利要求12方法中所说的混合物多肽中至少含有8000种类别。
14.一个抗体能特异性识别仅由三个氨基酸构成的表位，并且不会受表位氨基酸的侧翼氨基酸残基影响；上文中所提到的3个氨基酸残基在被诱导的抗体识别时也不会受侧翼氨基酸的影响。
15.权利要求14中的抗体，所提到的3个氨基酸残基是指GPG.
16.权利要求14中的抗体，所提到的抗体是抗血清。
17.权利要求14中的抗体，所提到的抗体是多克隆抗体和单克隆抗体。
18.权利要求1中的多肽疫苗，多肽文库含有至少400种不同类别的多肽。
19.权利要求18中的多肽疫苗，多肽文库含有至少800种不同类别的多肽。
【文档编号】A61K38/17GK104039350SQ201280045106
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年9月17日 优先权日:2011年9月17日
【发明者】吴稚伟, 吴喜林 申请人:苏州纳奥新材料科技有限公司