酰化的glp-1化合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及在相对于序列GLP-1(7-37)(SEQ?ID?No1)的位置7和/或8上具有至少一种非蛋白质源性氨基酸残基修饰的新的长效GLP-1化合物及其治疗用途。
【专利说明】酰化的GLP-1化合物
[0001]本申请是申请号为200680006674.6、申请日为2006年3月20日、发明名称为“酰化的GLP-1化合物”的中国发明专利申请的分案申请。
发明领域
[0002]本发明涉及治疗性肽领域，即涉及新的长效GLP-1化合物。
[0003]发明背景
[0004]—系列不同方法已经用于修饰胰高血糖素样肽I (GLP-1)化合物的结构以便提供体内更长的作用持续时间。
[0005]W096/29342公开了其中亲本肽激素已经通过在C-端氨基酸残基或在N-端氨基酸残基引入亲脂性取代物而修饰的肽激素衍生物。
[0006]W098/08871公开了其中亲本肽的至少一个氨基酸残基连接有亲脂性取代物的GLP-1衍生物。
[0007]W099/43708公开了具有连接至C-端氨基酸残基的亲脂性取代物的GLP-1 (7-35)和GLP-1 (7-36)衍生物。
[0008]W000/34331公开了酰化的GLP-1类似物。 [0009]W000/69911公开了用于注射进患者中的活化的促胰岛素肽，据认为在患者中它们与血液成分反应形成缀合物，从而据说提供体内更长的作用持续时间。
[0010]W002/46227公开了融合至人血清白蛋白以便延长体内半衰期的GLP-1和毒蜥外泌肽-4类似物。
[0011]许多糖尿病患者尤其是2型糖尿病患者患有所谓的“针-恐怖症”，即十分恐惧他们自己注射。在2型糖尿病患者中，多数患者使用口服降血糖药治疗，并且自从期望GLP-1化合物是这些患者将施用的首选注射产品，对注射的恐惧可能会成为广泛使用这种临床上非常有希望的GLP-1化合物的严重障碍。因此，需要开发能够每天施用少于一次，例如每两天或每三天一次优选为每周一次，同时保持可接受的临床特性的新的GLP-1化合物。
[0012]发明概述
[0013]本发明提供了相对于序列GLP-1 (7-37) (SEQ ID Nol)在位置7和/或8具有至少一个非-蛋白质源性(non-proteogenic)氨基酸残基修饰的GLP-1类似物,其在位置26的赖氨酸残基处用一个部分酰化，并且其中所述的部分包含至少两个酸性基团，其中一个酸性基团在末端连接。
[0014]本发明还提供了包含根据本发明化合物的药物组合物，以及提供了根据本发明的化合物用于制备治疗疾病的药物的用途。
[0015]本发明提供了用于增加GLP-1类似物在患者中的作用时间的方法，其特征在于在所述GLP-1类似物的位置26的赖氨酸残基上，用如在任意先前的权利要求中公开的B-U’部分酰化所述的GLP-1类似物。
[0016]发明描述
[0017]在本说明书中，下列术语具有指定的含义:[0018]如此处使用的，术语“多肽”和“肽”表示由至少5个通过肽键连接的组成氨基酸组成的化合物。组成氨基酸可以来自由遗传密码编码的氨基酸并且它们可以是不通过遗传密码编码的天然氨基酸，以及合成的氨基酸。不通过遗传密码编码的天然氨基酸是例如Y -羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成氨基酸包括通过化学合成产生的氨基酸，即由遗传密码编码的氨基酸的D-异构体，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib (0-氨基异丁酸)、八1311 (^-氨基丁酸)、116 (叔丁基甘氨酸)、丙氨酸、3-氨甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸。
[0019]22种蛋白质源性氨基酸是:
[0020]丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。
[0021]因此，非蛋白质源性氨基酸是可以通过肽键整合进肽的部分，但不是蛋白质源性氨基酸。实例是Y-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-氨基酸例如D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成的非蛋白质源性氨基酸包括通过化学合成产生的氨基酸，即通过遗传密码编码的氨基酸的D-异构体例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib ( α -氨基异丁酸)、Abu ( α -氨基丁酸)、Tle(叔丁基甘氨酸)、3_氨甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸、脱氨基-组氨酸、氨基酸的β类似物例如β -丙氨酸等、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β -羟基-组氨酸、高组氨酸(homohistidine)、Ν°-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α -甲基-组氨酸、3-吡啶丙氨酸、2-吡啶丙氨酸或4-吡啶丙氨酸、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸或(1-氨基环辛基)羧酸；
[0022]如此处使用的，涉及多肽的术语“类似物”表示经修饰的肽，其中所述肽的一个或多个氨基酸残基已经由其它氨基酸残基取代和/或其中一个或多个氨基酸残基已经从肽中删减和/或其中一个或多个氨基酸残基已经从肽中删减和或其中一个或多个氨基酸残基已经加入至肽中。这种氨基酸残基的加入或缺失可以在肽的N-端和/或肽的C-端发生。通常用一个简单的系统来描述类似物:例如[Arg34]GLP-l (7-37)Lys指其中在位置34天然存在的赖氨酸已经由精氨酸取代并且其中一个赖氨酸已经加入至末端氨基酸残基，即加至Gly37的GLP-1 (7_37)类似物。旋光异构体未说明的所有氨基酸应该理解为表示L-异构体。在本发明的实施方案中，最多17个氨基酸已经受到修饰。在本发明的实施方案中，最多15个氨基酸已经受到修饰。在本发明的实施方案中，最多10个氨基酸已经受到修饰。在本发明的实施方案中，最多8个氨基酸已经受到修饰。在本发明的实施方案中，最多7个氨基酸已经受到修饰。在本发明的实施方案中，最多6个氨基酸已经受到修饰。在本发明的实施方案中，最多5个氨基酸已经受到修饰。在本发明的实施方案中，最多4个氨基酸已经受到修饰。在本发明的实施方案中，最多3个氨基酸已经受到修饰。在本发明的实施方案中，最多2个氨基酸已经受到修饰。在本发明的实施方案中，I个氨基酸受到修饰。
[0023]如此处使用的，有关肽的术语“衍生物”表示经化学修饰的肽或其类似物，其中至少一个取代基不存在于未经修饰的肽或其类似物中，即表示已经经共价修饰的肽。典型的修饰是酰胺、糖类、烷基、酰基、酯等。GLP-1 (7-37)衍生物的实例是Ne26- ((4S)_4_ (十六烧酰基氨基)-羧基 _ 丁酰基)[Arg34, Lys26] GLP-1-(7-37)。[0024]如此处使用的，术语“GLP-1 肽”表示 GLP-1 (7-37) (SEQ ID Nol)、GLP-1 (7-37)类似物、GLP-1 (7-37)衍生物或GLP-1 (7-37)类似物的衍生物。在一个实施方案中，GLP-1肽是促胰岛素剂。
[0025]如此处使用的，术语“促胰岛素剂”表示是人GLP-1受体激动剂的化合物，即刺激cAMP在含有人GLP-1受体的合适培养基(在下文中公开一种这样的培养基)中形成的化合物。促胰岛素剂的效力通过从如下面描述的剂量-反应曲线计算EC5tl值测定。
[0026]将表达克隆的人GLP-1受体的幼仓鼠肾(BHK)细胞(BHK-467-12A)在加入100IU/mL 青霉素、100 μ g/mL 链霉素、5% 胎牛血清、0.5mg/mL 遗传霉素 G-418 (Life Technologies)的DMEM培养基中生长。在磷酸盐缓冲液中洗涤细胞两次并用Versene收获。在缓冲液I(20mM HEPES-Na, IOmM EDTA,pH7.4)中通过用Ultraturrax均化从细胞制备质膜。在4°C下以48，OOOx g离心匀浆15分钟。通过均化使沉淀物悬浮于缓冲液2(20mM HEPES-Na,0.1mMEDTA, pH7.4)中，随后在4°C下以48，OOOx g离心15分钟。再次重复洗涤步骤。将最终的沉淀物悬浮于缓冲液2中并直接用于检测或在-80°C下储存。
[0027]功能性受体测定法通过测量作为对促胰岛素剂刺激的反应的环磷腺苷(cAMP)来完成。形成的 cAMP 通过 AlphaScreen? cAMP Kit (Perkin Elmer Life Sciences)定量。孵育在半区(half-area) 96-孔微量滴定板中在50 μ L总体积的缓冲液3 (50mM Tris-HCl,5mMHEPES, IOmM MgCl2, ρΗ7.4)中完成并加入:lmM ATP、I μ M GTP、0.5mM3_ 异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX),0.01%吐温20、0.1%BSA、6 μ g膜制备物、15 μ g/mL受体微珠、用6nM生物素基-cAMP预孵育的20 μ g/mL供体微珠。将要检测激动剂活性的化合物溶解并稀释于缓冲液3中。对每个试验新鲜制备GTP。将平板在室温下于黑暗中缓慢搅动孵育3小时，随后将其在 Fusion?仪(Perkin Elmer Life Sciences)中计数。使用 Prism ν.4.0 用 4 参数 logistic模型(GraphPad, Carlsbad, CA)绘制每种化合物的浓度_反应曲线并估计EC5tl值。 [0028]如此处使用的，涉及多肽的术语“DPP-1V保护”指这样一种多肽，该多肽已经经化学修饰以便使所述化合物能够抗血浆肽酶二肽氨基肽酶-4 (DPP-1V)。已知血浆中的DPP-1V酶参与多种肽激素如GLP-1、GLP-2、毒蜥外泌肽_4等的降解。因此，正在做出相当大的努力来开发易受DPP-1V介导的水解作用影响的多肽的类似物和衍生物以便减小DPP-1V降解速率。在一个实施方案中，DPP-1V保护的肽比GLP-1 (7-37)或毒蜥外泌肽-4 (1-39)更能抗DPP-1V0
[0029]肽对二肽氨基肽酶IV降解的抗性可通过下面的降解测定法测定:
[0030]在37 °C下于100 μ L、0.1M ρΗ7.4的三乙胺-HCl缓冲液中，将肽的等分样品(5nmol)用相当于5mU酶活性的I μ L纯化的二肽氨基肽酶IV孵育10-180分钟。通过加入5 μ L10%的三氟乙酸终止酶促反应，并使用HPLC分析法分离和定量肽降解产物。用于实施该分析的一种方法是:根据 Siegel 等 Regul.Pept.1999 ；79:93-102 和 Mentlein 等.Eur.J.Biochem.1993 ；214:829-35,将混合物上样至 Vydac C18widepore(30nm 小孔，5 μ m 微粒)250x4.6mm柱并使用0.1%三氟乙酸中的乙腈线性阶式梯度(0%的乙腈3分钟，0-24%的乙腈17分钟，24-48%的乙腈I分钟)以Iml/分钟的流速将其洗脱。肽和它们的降解产物可通过它们在220nm (肽键)或280nm (芳香族氨基酸)处的吸光度监控，并通过它们相对于标准品的峰面积积分来定量。在引起少于10%的肽受到水解的孵育时间下估计二肽氨基肽酶IV水解肽的速率。[0031]如此处使用的术语“Cu-烷基”指具有1-6个碳原子的饱和的、分支的、直链或环烃基团。代表性实例包括，但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戍基、异戍基、新戍基、叔戍基、正己基、异己基、环己烧等。
[0032]如此处使用的，术语“可药用”指适合于正常的药学应用，即在患者中未产生有害事件等。
[0033]如此处使用的，术语“赋形齐『指通常加入至药物组合物的化合物，例如缓冲剂、张度剂(tonicity agent)、防腐剂等。
[0034]如此处使用的，术语“有效量”指与不治疗相比对患者的治疗足够有效的剂量。
[0035]如此处使用的，术语“药物组合物”指包含活性化合物或其盐加之药物赋形剂(如缓冲剂、防腐剂和任选张度调节剂和/或稳定剂)的产品。因而，药物组合物在本领域也称为药物制剂。
[0036]如此处使用的，术语“疾病的治疗”指治疗和看护已经患有疾病、病症或障碍的患者。治疗目的是对抗疾病、病症或障碍。治疗包括施用活性化合物以消除或控制疾病、病症或障碍以及减轻与疾病、病症或障碍相关的症状或并发症。
[0037]在另一方面，本发明涉及同时结合白蛋白和GLP-1受体的酰化的GLP-1类似物。
[0038]在另一方面，本发明涉及在存在2%白蛋白的情况下，以低于ΙΟΟηΜ，优选低于30nM的亲和力结合GLP-1 受体的酰化的GLP-1类似物。
[0039]在另一方面，本发明涉及酰化的GLP-1类似物，当存在非常低的浓度(例如0.005%至0.2%)的人白蛋白时的亲和力与存在2%的人白蛋白时的亲和力比较时，所述GLP-1类似物对GLP-1受体的亲和力只是部分地减小。在这些条件下亲和力的改变小于50倍，优选小于30倍并更优选小于10倍。
[0040]如此处使用的，术语“白蛋白结合部分”表示非共价结合人血清白蛋白的残基。连接至治疗性多肽的白蛋白结合残基通常具有对人血清白蛋白低于10 μ M的亲和力并且优选低于I μ Μ。在末端具有酸性基团的含有4-40个碳原子的直链和支链亲脂性部分中已知了一系列的白蛋白结合残基。
[0041]如此处使用的，术语“亲水性连接物”表示分开肽和白蛋白结合残基的间隔物，所述的间隔物具有包含至少5个非氢原子且其中30-50%的这些非氢原子是N或O的化学部分。
[0042]如此处使用的，术语“酸性基团”表示在生理pH下完全或部分带负电荷的有机化学基团。这种基团的PKa值小于7，优选小于5。这包括但不限于羧酸、磺酸、磷酸或在生理学PH时完全或部分带负电荷的杂环体系。
[0043]在下面的结构式II中，U部分是可以以两种不同方式连接末端基团B和肽中的赖氨酸的氨基的双基(d1-radical)。在本发明的实施方案中，式II中的U与烷基链一端的基团B和另一端的肽连接。
[0044]在下面的式中，连接基团的端键应该认为是连接键并且不以亚甲基结尾，除非另外说明。
[0045]在下面的式中[0046]
【权利要求】
1.在相对于序列GLP-1(7-37) (SEQ IDNol)的位置7和/或8上具有至少一种非蛋白质源性氨基酸残基的修饰的GLP-1类似物，所述的类似物在位置26的赖氨酸残基处用部分进行酰化，并且其中所述的部分包含至少两个酸性基团，其中一个酸性基团在末端连接。
2.根据权利要求1的GLP-1类似物，其中在位置26连接的部分包含亲水性连接物。
3.根据权利要求2的GLP-1类似物，其中所述的亲水性连接物包含至少5个非氢原子，其中30-50%的这些非氢原子是N或O。
4.根据任一上述权利要求的GLP-1类似物，其中在位置26处连接的部分包含通过亲水性连接物与肽隔开的白蛋白结合部分。
5.根据权利要求4的GLP-1类似物，其中白蛋白结合部分是在末端具有酸性基团的含有4-40个碳原子的直链或支链的亲脂性部分。
6.根据任一上述权利要求的GLP-1类似物，其中酰化的部分是B-U’， 其中U’选自
7.GLP-1类似物，所述的类似物是式I (SEQ ID N0.2)的化合物: Xaa7-Xaa8-Glu-Glv-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-
8.根据权利要求6-7的GLP-1类似物，其中U’选自
9.根据权利要求6-8的GLP-1类似物，其中B-U’ -是
10.根据权利要求9的GLP-1类似物，其中 其中 I 是 14、15、16、17 或 18，
P 是 1、2、3、4 或 11，
s是0、1或2，
t是O或I。
11.根据权利要求6-10任一项的GLP-1类似物，其中s是I。
12.根据权利要求6-10任一项的GLP-1类似物，其中I是16。
13.根据权利要求6-10任一项的GLP-1类似物，其中P是3或4。
14.根据权利要求6-10任一项的GLP-1类似物，其中η是I。
15.根据权利要求7-14任一项的GLP-1类似物，其中 Xaa7是His或脱氨基-组氨酸；
Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie、Lys 或 Aib ；
Val ；
Xaa18 是 Ser ；
Xaa19 是 Tyr ；
Xaa20 是 Leu ；
Xaa22 是 Gly、Glu 或 Aib ；
Xaa23 是 Gln 或 Glu ； Xb&25 AIb ；
Xaa27 是 Glu ；
Xaa30 是 Ala 或 Glu ； XBB33 V&1 ;
Xaa34 是 Lys 或 Arg ；
Xaa35 是 Gly 或 Aib ；
Xaa36 是 Arg 或 Lys ； Xaa37是Gly、酰胺或缺失。
16.根据权利要求15的GLP-1类似物，其中 Xaa7 是 His
Xaa8 是 Gly 或 Aib ；
Val ；
Xaa18 是 Ser ；
Xaa19 是 Tyr ；
Xaa20 是 Leu ；
Xaa22 是 Glu 或 Aib ；
Xaa23 是 Gln ； Xb&25 AIb ；
Xaa27 是 Glu ； Xb&3o AIb ； Xb&33 Val ;
Xaa34 是 Lys 或 Arg ；
Xaa35 是 Gly 或 Aib ；
Xaa36 是 Arg ；
Xaa37 是 Gly0
17.根据权利要求1-15任一项的GLP-1类似物，其中所述的GLP-1类似物包含在GLP-1 (7-37)序列位置7的N-端L-组氨酸的修饰。
18.根据权利要求17的GLP-1类似物，其中所述的GLP-1类似物包含咪唑并丙酰基7、α -羟基-组氨酸7或N-甲基-组氨酸7、D-组氨酸7、脱氨基-组氨酸7、2_氨基-组氨酸7、β -羟基-组氨酸7、高组氨酸7、Na-乙酰基-组氨酸7、a -氟甲基-组氨酸7、a -甲基-组氨酸'3-吡啶丙氨酸7、2_吡啶丙氨酸7或4-吡啶丙氨酸7。
19.根据权利要求1-18任一项的GLP-1类似物，其中所述的GLP-1类似物包含用另一种氨基酸残基对GLP-1 (7-37)序列位置8的L-丙氨酸的取代。
20.根据权利要求19的GLP-1类似物，其中所述的GLP-1类似物包含Aib8、Gly8、Val8、1168、1^118、3虹8、1111'8、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸或(1-氨基环辛基)羧酸。
21.根据权利要求20的GLP-1类似物，其中所述的GLP-1类似物包含Aib8。
22.根据上述权利要求任一项的GLP-1类似物，其中所述的GLP-1类似物与GLP-1 (7-37) (SEQ ID N0.1)比较包含不超过15个已被交换、加入或缺失的氨基酸残基。
23.根据权利要求22的GLP-1类似物，其中与GLP-1(7-37) (SEQ ID N0.1)比较有不超过10个已被交换、加入或缺失的氨基酸残基。
24.根据权利要求23的GLP-1类似物，其中所述的GLP-1类似物与GLP-1(7-37) (SEQID N0.1)比较包含不超过6个已被交换、加入或缺失的氨基酸残基。
25.根据任意上述权利要求的GLP-1类似物，其中所述的GLP-1类似物包含不超过3个不是由遗传密码编码的氨基酸残基。
26.根据上述权利要求任意一项的GLP-1类似物，其中所述的GLP-1类似物只包含一个赖氨酸残基。
27.根据任意上述权利要求的GLP-1类似物，所述的GLP-1类似物是
Aib8, Arg34-GLP-1 (7-37)，
Aib8’22，Arg34-GLP-1 (7-37)，
Arg34-GLP-1 (7-37)， [3-(4-咪唑基)丙酰基 7，Arg34]GLP-1-(7-37)肽，
Gly8, Arg34-GLP-1 (7-37)，
Aib8, Arg34, Pro37-GLP-1 (7-37)，
Aib8’22’27’30’35，Arg34, Pro37-GLP-1 (7-37)酰胺， 它们都在位置26由B-U’取代。
28.根据上述权利要求任意一项的化合物，所述的化合物选自
29.用于增加GLP-1类似物在患者中的作用时间的方法，所述方法的特征是在所述GLP-1类似物位置26的赖氨酸残基上用如在任意上述权利要求中公开的B-U’酰化所述的GLP-1类似物。
30.用于增加GLP-1类似物在患者中的作用时间至长于约40个小时的方法，所述方法的特征是修饰GLP-1 (7-37)肽或其类似物的位置7和8的至少一个氨基酸残基，并且在所述GLP-1类似物的位置26的赖氨酸残基上，用如任意上述权利要求中公开的B-U’-酰化所述GLP-1类似物。
31.一种药物组合物，所述的药物组合物包含根据权利要求1-28任意一项的化合物和可药用赋形剂。
32.根据权利要求31的药物组合物，所述的药物组合物适合肠胃外施用。
33.根据权利要求1-28任意一项的化合物在制备药物中的用途。
34.根据权利要求1-28任意一项的化合物的用途，其中所述的化合物用于制备治疗或预防高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、I型糖尿病、肥胖症、高血压、X综合征、血脂障碍、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾病、中风、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡的药物。
35.根据权利要求1-28任意一项的化合物的用途，其中所述的化合物用于制备延缓或预防2型糖尿病发展的药物。
36.根据权利要求1-28任意一项的化合物的用途，其中所述的化合物用于制备减少食物摄取、减少细胞凋亡、增加细胞功能和细胞量和/或恢复细胞的葡萄糖敏感性的药物。
【文档编号】A61P9/10GK104017062SQ201310534370
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2006年3月20日 优先权日:2005年3月18日
【发明者】J·劳, F·Z·多沃尔德, H·斯蒂芬森, P·布洛克, T·K·汉森, K·迈德森 申请人:诺和诺德公司