专利名称：一种人工肝生物反应器的制作方法
技术领域：
本发明涉及人工肝支持系统的技术领域，具体地说，涉及一种以纳米纤维材料作为肝细胞培养的人工肝生物反应器。
背景技术：
人工肝脏是借助体外机械，化学或生物性装置，暂时或部分替代肝脏功能，从而协助治疗肝脏功能不全或相关疾病。人工肝作为肝功能不全、肝衰竭或相关疾病的有效辅助治疗设备在临床中具有极大应用潜力。按照人工肝组成及性质可以分成三类:非生物型人工肝、生物型人工肝、混合型人工肝。非生物型人工肝治疗常用的方法是血液透析、血浆或全血灌流、血液置换和滤过等，主要可以实现肝脏最基本的解毒功能，该类型人工肝已在临床广泛应用。生物型人工肝则是将人或动物的肝细胞置于反应器中进行培养，同时控制细胞微环境使其尽可能接近于人体肝脏所处的环境，使肝细胞 能正常生存，实现肝脏的生化功能。混合型生物人工肝是生物与非生物人工肝技术的优化组合，更好地达到临床治疗效果。生物型人工肝和混合型人工肝目前尚处于临床验证阶段，临床应用潜力巨大。生物反应器是生物型人工肝和混合型人工肝的核心部件，其主要功能是为大量体外培养的肝脏细胞提供适宜的生长环境，促使肝脏细胞保持稳定的高水平细胞活性和肝功能表达水平。目前生物反应器的种类很多，按照细胞的培养方式可分为(I)中空纤维生物反应器；(2)平板单层生物反应器；(3)灌注床或支架生物反应器；(4)包被悬浮生物反应器。纳米纤维主要是指在三维尺度上有两维的尺寸处于纳米范围(小于0.1um)内的线(管)状材料，具有极高的比表面积、高孔隙率和相互连通的三维网格状结构，相对于传统技术制备的支架材料能够更好的模拟天然细胞外基质的结构特点，为细胞的生长提供良好的生长微环境。资料表明纳米纤维膜有利于肝细胞球状体的形成以及球状体生物活性的保持，培养在纳米纤维膜上的肝细胞其合成白蛋白、尿素的能力均大于利用传统模式培养的肝细胞。目前，人工肝生物反应器在细胞培养方面存在很多问题，诸如生物反应器内培养的肝细胞密度过低达不到人体所需的2 SXKTcells/m2，肝细胞容易从培养基质上脱落从而造成肝细胞随循环的培养液流走和在生物反应器内分布不均匀造成人工肝功能下降，以及培养液中氧气供量不足造成的肝细胞死亡等。
发明内容
本发明的目的在于克服传统细胞培养的细胞流失率高的问题，提供一种可用于大批量肝细胞培养的人工肝生物反应器。该人工肝生物反应器实现了肝细胞的大规模黏附生长，纳米纤维的类生物体蛋白纤维结构可以促进肝细胞的增殖及提高活性，从而可以在很大程度上提高肝细胞在生物反应器中的密度以及生物活性。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种人工肝生物反应器，包括外壳，所述外壳内设有中空支架和内置平板，内置平板由多层平板组成，每层平板中间开有圆孔，用于中空支架穿过固定，平板与平板之间隔开固定于中空支架上。在上述人工肝生物反应器中，所述内置平板为2 150层圆形平板，每层平板直径20mm 400 mm,厚lmm 10 mm ;平板与平板之间的层距0.5 mm 20 mm。在上述人工肝生物反应器中，所述圆孔为直径lmnT50mm的圆孔。在上述人工肝生物反应器中，所述内置平板的每层平板上雕刻有一定数量的镂空孔，小孔直径为0.1 mm^lO mm，相邻的两个小孔的圆心距为5在上述人工肝生物反应器中，整个反应器高度为50mnT2000 mm，有效体积为10mL 10000 mL。在上述人工肝生物反应器中，所述中空支架的上下两端分别设有营养液进出口。在上述人工肝生物反应器中，还设有纳米纤维膜，纳米纤维膜平铺于内置平板的表面之上。在上述人工肝生物反应器中，所述的纳米纤维膜的材料为壳聚糖、海藻酸盐、纤维素、琼脂糖、聚乳酸、聚丙烯酸、聚己内酯、多聚赖氨酸、聚乙烯醇或其混合材料。在上述人工肝生物反应器中，所述纳米纤维膜的纤维直径在30 nnT400 nm之间，孔隙率85%。在上述人工肝生物反应器中，所述中空支架的侧面上设有若干侧孔，侧孔均匀地分布在内置平板的中间部位，侧孔尺寸为长0.1 mnT50mm，宽为0.lmnT50mm，侧孔的作用是细胞加样及培养液循环出口，侧孔的长度从中空支架的上端开始逐渐减小，以保证不同压强下侧孔出液量的均一性。在上述人工肝生物反应器中，所述外壳为中空圆柱形，上端设有进气孔，孔大小为lmm-50mm ;设有取样孔，孔大小为lmm-50mm ;设有进液孔；下端设有出液孔，孔大小为1mm-10Omnin在上述人工肝生物反应器中，所述内置平板之间利用T型托架隔开，T型托架高度为lmm-30mm，可以保证两个平板之间的中空支架有一层侧孔，T型托架下端可以紧密插入平板中的圆孔。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:本发明的人工肝生物反应器该生物反应器引入纳米纤维膜，实现了利用纳米纤维膜极高的比表面积、高孔隙率和相互连通的三维网格状结构，相对于传统技术制备的支架材料能够更好的模拟天然细胞外基质的结构特点，为肝细胞的生长提供良好的微环境，利于细胞黏附、生长，可达到固定肝细胞进而提高生物型人工肝的肝细胞密度，并且有利于促进肝细胞球状体的形成。针对肝细胞生物反应器培养液供氧不足及循环的 问题，在反应器内置平板上进行镂空孔的雕刻，小孔的作用是增加细胞与培养液的接触面积及加速培养液循环速度，进一步提高肝细胞的生物活性及功能的发挥。该生物反应器的设计新颖，肝细胞在平板上分布均匀，微环境一致，且制备方法在技术上均能实现，具有广阔的应用前景。
图1为人工肝生物反应器核心器件；
图2为人工肝生物反应器核心器件剖视图，箭头方向为营养液流动方向。图3为人工肝生物反应器内置平板俯视 图4为人工肝生物反应器内置平板3D具体实施例方式如图1 一 4所不,一种人工肝生物反应器,包括外壳I,外壳I内设有中空支架2和内置平板3,内置平板3由多层平板组成,每层平板中间开有圆孔,圆孔为直径lmnT50 mm的圆孔，用于中空支架2穿过固定，平板与平板之间隔开固定于中空支架2上。多层平板3为2 150层圆形平板，每层平板直径20mnT400 mm，厚ImnTlO mm ;平板与平板之间的层距
0.5 mnT20 mm。内置平板3的每层平板上雕刻有若干镂空孔，镂空孔直径为0.1 mnTlO mm,相邻的两个镂空孔的圆心距为5 mnT50mm。镂空孔的作用是增加细胞与培养液的接触面积及加速培养液循环速度，进一步提高肝细胞的生物活性及功能的发挥。整个反应器高度为50mnT2000 mm，有效体积为10 mL 10000 ml。中空支架2的上下两端分别设有营养液进出口。利用静电纺丝技术将天然材料如壳聚糖、海藻酸盐、纤维素、琼脂糖或人工合成的聚合物如聚乳酸、聚丙烯酸、聚己内酯、多聚赖氨酸、聚乙烯醇或上述混合材料制备成纳米纤维膜4。纳米纤维膜4平放于多层平板3之上，作为细胞附着的载体。纳米纤维膜4的纤维直径在30 nnT400 nm之间，孔隙率85%。中空支架2为一直径I mnT50 mm的空心圆柱。在中空支架2的柱体侧面上还开有2 1000条纵长的侧孔5，侧孔5均匀地分布在每层平板的中间部位，侧孔5尺寸为长0.1mnT50mm，宽为0.lmm^50mm,侧孔5的作用是细胞加样及培养液循环出口，侧孔5的长度从中空支架2的上端开始逐渐减小 ，以保证不同压强下小孔出液量的均一性。外壳I为中空圆柱形，上端设有进气孔，孔大小为lmm-50mm ;设有取样孔，孔大小为lmm-50mm ;设有进液孔；下端设有出液孔，孔大小为Imm-lOOmm。内置平板3之间利用T型托架隔开，T型托架高度为lmm-30mm，可以保证两个平板之间的中空支架有一层侧孔5，T型托架下端可以紧密插入平板中的圆孔。纳米纤维膜4的制备:选择不同的溶剂将聚合物溶解制备成静电纺丝溶液。根据聚合物溶液的不同性质制定不同的静电纺丝条件(电压、接受距离、注射速度)，然后进行纺丝，在纺丝过程中通过移动接受器的位置和控制纺丝的时间对纳米纤维膜的形状和厚度进行调节。将不同材料的纳米纤维膜进行相应的改性和消毒，制备成能放置于细胞培养液中作为细胞生长基质的纳米纤维膜。实施例1:以壳聚糖和半乳糖化壳聚糖材料作为纳米纤维支架的原材料来制作此新型生物反应器。纳米纤维支架的具体制备方法:将壳聚糖和半乳糖化壳聚糖溶解在70%的甲酸溶液，浓度为3-5wt%。在搅拌条件下向上述溶液中加入10wt%(PE0/半乳糖化壳聚糖)的PE0，溶解3小时并离心除去溶液中的气泡。随后将溶液装入5ml玻璃注射器，注射器针头为6号。在微量注射泵的推动下以lml/h的速度推射溶液。在针头和收集板的两端施加15kV的电压，收集器和针头之间的距离为15cm。最终，电纺纤维被收集在生物反应器内置平板上，随后置于40°C的真空条件下干燥两天除去残留的甲酸。
实施例2:以PLGA作为纳米纤维支架的原材料来制作此新型生物反应器
纳米纤维支架的具体制备方法:将PLGA溶解在氯仿中制备成浓度为21.5%的溶液，随后将溶液充入配有6号针头的一次性注射器中。在收集板与针头之间施加10-15kV的直流电压，利用微量注射泵以lml/h的速度将溶液从注射器中推出。针头和踏板之间的距离为10-15cm。当纺丝完成后，将覆盖有PLGA电纺纤维的内置平板取下并置于真空干燥器中两天除去残留的溶剂。生物反应器的封装:将内置平板3固定于中空支架2上，整个地放入反应器外壳I内，加上盖子，即制人工肝 生物反应器。
权利要求
1.一种人工肝生物反应器，其特征在于包括外壳(I)，所述外壳(I)内设有中空支架(2)和内置平板(3)，内置平板(3)由多层平板组成，每层平板中间开有圆孔，用于中空支架(2)穿过固定，平板与平板之间隔开固定于中空支架(2)上。
2.根据权利要求1所述的人工肝生物反应器，其特征在于:所述内置平板(3)为2 150层圆形平板，每层平板直径20mnT400 mm,厚ImnTlO mm ;平板与平板之间的层距0.5 mnT20mm;所述内置平板(3) 的每层平板上雕刻有一定数量的镂空孔，小孔直径为0.1 mnTlO mm,相邻的两个小孔的圆心距为5 mnTOmm。
3.根据权利要求1所述的人工肝生物反应器，其特征在于:所述圆孔为直径lmnT50_的圆孔。
4.根据权利要求1所述的人工肝生物反应器，其特征在于，整个反应器高度为50mnT2000 _，有效体积为 10 mL 10000 mL。
5.根据权利要求1所述的人工肝生物反应器，其特征在于:所述中空支架(2)的上端为营养液进口，下端封闭。
6.根据权利要求1所述的人工肝生物反应器，其特征在于:还设有纳米纤维膜(4)，纳米纤维膜(4)平铺于内置平板(3)的表面之上。
7.根据权利要求1所述的人工肝生物反应器，其特征在于:所述的纳米纤维膜(4)的材料为壳聚糖、海藻酸盐、纤维素、琼脂糖、聚乳酸、聚丙烯酸、聚己内酯、多聚赖氨酸、聚乙烯醇或其混合材料；所述纳米纤维膜(4)的纤维直径在30 nnT400 nm之间，孔隙率85%。
8.根据权利要求1所述的人工肝生物反应器，其特征在于:所述中空支架(2)的侧面上沿等角度方向开有设有2-10个侧孔(5)，侧孔(5)均匀地分布在每层平板的中间部位，上下两层侧孔间的距离为侧孔为方形或圆形,方形的尺寸为长0.1 mnT50mm,宽为mm^50mm ;圆形的孔径为 lmm-50mm。
9.根据权利要求1所述的人工肝生物反应器，其特征在于:所述外壳(I)为中空圆柱形，上端设有进气孔，孔大小为lmm-50mm ;设有取样孔，孔大小为lmm-50mm ;设有进液孔；下端设有出液孔，孔大小为Imm-lOOmm。
10.根据权利要求1所述的人工肝生物反应器，其特征在于:所述内置平板(3)之间利用T型托架隔开，T型托架高度为lmm-30mm。
全文摘要
本发明公开了一种人工肝生物反应器，包括外壳，中空支架和内置镂空平板。肝细胞生物反应器由多层镂空平板组成，每层平板中间开有圆孔，用于中空支架穿过固定，平板与平板之间隔开固定于中空支架上。本发明的人工肝生物反应器该生物反应器引入纳米纤维膜，实现了利用纳米纤维膜极高的比表面积、高孔隙率和相互连通的三维网格状结构，相对于传统技术制备的支架材料能够更好的模拟天然细胞外基质的结构特点，为肝细胞的生长提供良好的微环境，利于细胞黏附、生长，可达到固定肝细胞进而提高生物型人工肝的肝细胞密度，并且有利于促进肝细胞球状体的形成。该生物反应器的设计新颖，肝细胞在平板上分布均匀，微环境一致。
文档编号A61M1/20GK103100119SQ20131002661
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月24日 优先权日2013年1月24日
发明者冯章启, 蒋庆 申请人:中山大学