专利名称：具有抗肿瘤活性的多肽及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的多肽及其用途，属于抗肿瘤药物研发与应用技术领域。
背景技术：
据申请人了解，癌症在全世界已成为导致人类死亡的第二大病因。恶性肿瘤是危害人类健康的最危险的疾病之一，在我国，肿瘤引起的死亡率在所有病因中高居第一位，占17.9%，且发病率呈上升趋势。寻找有效的抗肿瘤药物与方法，彻底攻克癌症，是全世界医学界最重要的研究课题之一。肿瘤的治疗强调综合治疗的原则，化疗是其中一个重要手段。近年来抗肿瘤药物的研究取得了飞速发展，出现了一些新型的抗肿瘤药物，作用于肿瘤发生发展的不同环节，有效地延长了肿瘤患者的生存时间、提高了生活质量。但同时也出现了很多问题:肿瘤耐药性不断增强，导致抗肿瘤药物的使用剂量不断增加，对机体的毒副作用大大增强。现有研究发现，化学药物的治疗效果以及肿瘤细胞耐药性的产生均与细胞内一些基因表达水平有关，控制细胞内某些基因的表达有助于抑制肿瘤细胞耐药性的产生，并大大提高化学药物的治疗效果，降低因药物对机体的毒副作用，提高患者生存质量，为更多肿瘤患者带来福曰。JWA 基因，即 ARL6IP5 基因(GenBank:AF070523.1，1998;L0CUS:AF070523，NM_006407)是本专利发明人周建伟等首先从培养的原代人气管和支气管上皮细胞中分离克隆的受全反式维甲酸(ATRA)诱导的基因，编码一种新的细胞骨架结合蛋白。本专利发明人带领课题组成员多年来一直围绕JWA基因的结构、功能及其相互关系开展研究工作，取得了一系列原创性有意义的研究成果:(I)率先证明和提出JWA基因编码的JWA蛋白是一种新的微管相关蛋白(MAPs)，该蛋`白能与微管蛋白α和β亚单位结合，并在对环境物理化学因素(如冷休克、热休克、紫杉醇等)的应答中表现出与微管蛋白α和β亚单位同步的动力学变化(聚合或解聚)；(2)发现JWA蛋白参与细胞有丝分裂过程，并对微管的动力学稳定性有调节作用；(3) JWA蛋白可以通过MAPK信号通路、微丝的解聚和重组来调节肿瘤细胞迁移。肿瘤细胞迁移是肿瘤浸润和转移的必要条件，肿瘤细胞的迁移能力也与转移潜能有关。本专利发明人经研究发现，将JWA基因表达缺陷的人或小鼠黑色素瘤细胞(Α375、B16F10)通过尾静脉注入小鼠体内后，其形成的肺转移灶明显高于空载对照鼠。同时，在体外模型研究中也发现，JWA基因表达缺陷的黑色素瘤细胞株，其迁移、侵袭、粘附能力也都明显高于载体对照的细胞。后续深入的机制研究证明，JWA基因对肿瘤细胞转移相关多种恶性表型的影响是通过负性调节核转录因子Spl的表达后、进一步抑制integrin ανβ3信号通路分子的活性而实现的。从现有JWA蛋白相关研究可知，由JWA基因表达获得的JWA蛋白具有抑制肿瘤细胞粘附、浸润、转移和抑制肿瘤血管生长等功能，规模化生产活性JWA蛋白势在必行。然而，本专利发明人在实践研究中发现，目前采用宿主表达系统难以获得纯化的JWA蛋白，通过该途径以纯化的JWA蛋白开展体内外试验的可行性差。此外，据申请人所知，整合素(integrin)是广泛存在于细胞膜表面的糖蛋白受体家族分子，主要介导细胞与细胞外基质(ECM)以及细胞与细胞之间的粘附。整合素分子是由α和β亚基通过非共价键连接构成的二聚体分子，不同的α和β亚基的组合决定了配体的特异性。其中，integrin α ν β 3的功能显得尤为重要。integrin ανβ3在许多恶性肿瘤细胞表面表达增高，而在正常组织中表达较低或者不表达，并且能够被配体分子中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(RGD)所特异性识别。许多作用靶点位于细胞内的生物大分子发挥作用的先决条件是穿透细胞膜进入细胞内，然而生物膜的生物屏障作用阻止了许多高分子物质进入细胞内，从而很大程度上限制了这些物质在治疗领域的应用。因此，如何引导这些物质穿透细胞膜是一个迫切需要解决的难题。传统的各种导向方法存在着操作复杂、效率低，具有细胞毒性或免疫原性等缺点。细胞膜穿透肽( cell penetrating peptide, CPP)是一类能以受体依赖或非受体依赖方式介导胞吞作用的短肽。CPP的这一特性使其成为一种有效的运输载体，向细胞内运送各种自身不能穿越细胞膜的大分子生物活性物质，为生物治疗提供了一个崭新的有力工具。迄今的研究提示，CPP能在体外或体内介导一系列生物活性分子如蛋白质、肽类、寡聚核苷酸、DNAs、质粒及脂质体等进入各种不同组织和细胞，发挥各自的生物学效应；其穿膜特性不仅用于细胞内外物质跨膜运输的研究，也使其作为一潜在的有效生物分子运送载体，在肿瘤治疗中发挥作用。CPP技术的发展，使我们可以避免因使用可复制的克隆分子而造成的潜在远期影响，大大加快了小分子靶向性药物研发进程。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:针对现有技术存在的问题，提供一种从JWA蛋白氨基酸序列中筛选鉴定获得的、具有抗肿瘤活性的多肽。同时，还提供该多肽用于制备抗肿瘤药物的用途。本发明的技术构思如下:本专利发明人经研究认为，由人工合成或者宿主表达系统表达JWA蛋白的途径难以实现用纯化的JWA蛋白在体内外模型中探讨该蛋白的生物学功能。这可能是因JWA蛋白结构中有3个跨膜区或其它尚不清楚的原因所致。发明人推测，JWA蛋白的生物学活性可能决定于其一级结构中连续的若干氨基酸残基构成的某种结构域，也可能决定于其一级结构中不相邻而在其高级结构中相邻的若干氨基酸残基。在此基础上发明人继续进行了深入的实践研究，终于筛选鉴定出具有抗肿瘤活性的JWA功能多肽。本发明解决其技术问题的技术方案如下:一种具有抗肿瘤活性的多肽，其特征是，所述多肽的氨基酸序列如1、I1、111、或IV所示:I:FPGSDRF ；I1: X-FPGSDRF ;II1: FPGSDRF-Z ;IV:X-FPGSDRF-Z ；其中，氨基酸S经磷酸化修饰，X、Z分别为氨基酸或氨基酸序列；X选自F、(R)9> (R)9-F、6-氨基己酸、6_氨基己酸-F、6_氨基己酸-(R)9、6_氨基己酸-(R)9-F 之一；Z选自A、(G)n-RGD、A-(G)n-RGD之一，η为大于或等于O的整数。优选地，所述η的取值范围为0-10。优选地，所述多肽的N端经乙酰化修饰、C端经酰胺化修饰。本发明还提出:上述多肽用于制备抗肿瘤药物的用途。优选地，所述肿瘤为黑色素瘤或胃癌。本发明多肽序列较短，易于实现规模化生产；在较低剂量下即显示出显著的抗肿瘤活性，与化学药物联合使用可增强化学药物如三氧化二砷(As2O3, ΑΤ0)对肿瘤细胞的毒性。本发明多肽对正常组织细胞无毒性，具有广阔的应用前景。
图1为已知JWA蛋白氨基酸序列图。下划线部分为跨膜区域，阴影区域为具体实施方式
涉及的片段部分。其中各字母代表的氨基酸如下:丙氨酸Α、精氨酸R、天冬氨酸D、谷氨酰胺Q、谷氨酸Ε、组氨酸H、异亮氨酸1、甘氨酸G、天冬酰胺N、亮氨酸L、赖氨酸K、甲硫氨酸Μ、苯丙氨酸
F、脯氨酸P、丝氨酸S、苏氨酸Τ、色氨酸W、酪氨酸Y、缬氨酸V。图2为本发明实施例2中对照组与多肽JWA-1 (10mg/kg)组的成瘤对比图。图3为本发明实施例2的瘤体积变化曲线图。JWAl、JWA2和JWA3分别代表三个JWA单肽，pep代表三个JWA单肽的等量混合肽；箭头表示给药时间，*表示P〈0.05。图4为本发明实施例2的瘤重体重比示意图。JWA1、JWA2和JWA3分别代表三个JWA单肽，pep代表三个JWA单肽的等量混合肽；*表示P〈0.05。图5为本发明实施例2的小鼠体重变化曲线图。JWAl、JWA2和JWA3分别代表三个JWA单肽，pep代表三个JWA单肽的等量混合肽。图6为本发明实施例3中对照组、无义肽组(Non-Pep)、多肽JWA-1 (10mg/kg)组的成瘤对比图。图7为本发明实施例3的瘤体积变化曲线图。箭头表示给药时间。图8为本发明实施例3的瘤重体重比示意图。图9为本发明实施例3的小鼠体重变化曲线图。图10为本发明实施例4中无义肽组、多肽JWA-1 (10mg/kg)组、多肽JWA_4( IOmg/kg)组、多肽JWA-5 (10mg/kg)组、多肽JWA-6 (10mg/kg)组的成瘤对比图。图11为本发明实施例4的瘤体积变化曲线图。箭头表示给药时间，*表示P〈0.05。图12为本发明实施例4的瘤重体重比示意图。图13为 本发明实施例4的小鼠体重变化曲线图。图14为本发明实施例5中无义肽组、多肽JWA-6 (50mg/kg)组、多肽JWA-6+RGD(10mg/kg)组、多肽JWA-6+RGD (50mg/kg)组的成瘤对比图。图15为本发明实施例5的瘤体积变化曲线图。箭头表示给药时间。图16为本发明实施例5的瘤重体重比示意图。图17为本发明实施例5的小鼠体重变化曲线图。图18为本发明实施例6各多肽对A375细胞作用24h的结果图。
图19为本发明实施例6各多肽对A375细胞作用48h的结果图。图20为本发明实施例6各多肽对A375细胞作用72h的结果图。图21为本发明实施例6各多肽对B16细胞作用24h的结果图。图22为本发明实施例6各多肽对B16细胞作用48h的结果图。图23为本发明实施例6各多肽对B16细胞作用72h的结果图。图24为本发明实施例7单独ATO处理细胞24h的结果图。林表示P〈0.01。图25为本发明实施例7单独ATO处理细胞48h的结果图。林表示P〈0.01。图26为本发明实施例7AT0 (0.5，1，2，5 μ M )与多肽JWA-1联合作用A375细胞24h的结果图。图27为本发明实施例7AT0 (0.5，1，2 μ Μ)与多肽JWA-1联合作用Α375细胞48h的结果图。图28为本发明实施例7AT0 (1，2，5 μ M )与多肽JWA-6联合作用A375细胞24h的结果图。图29为本发明实施例7AT0 (1，2 μ M )与多肽JWA-6联合作用Α375细胞48h的
结果图。图30为本发明实施例7WB检测多肽JWA-6单独及与ATO联合后处理A375细胞24h后PARP-1、caspase3表达 情况。其中，a-tublin为内参蛋白。图31为本发明实施例7WB检测多肽JWA-6单独及与ATO联合后处理B16细胞24h后PARP-1变化。其中，a-tublin为内参蛋白。图32为本发明实施例8中以10 μ M浓度的各CPP序列、JWA-6序列进入SGC7901细胞后荧光强度的时间变化曲线。图33为本发明实施例8中以不同剂量的各CPP序列、JWA-6序列作用SGC7901细胞3h进入细胞后荧光强度的比较图。图34为本发明实施例8中以不同剂量的各CPP序列作用BGC803细胞3h进入细胞后荧光强度的比较图。图35为本发明实施例8中以不同剂量的各CPP序列作用HeLa细胞3h进入细胞后荧光强度的比较图。图36为本发明实施例8中以不同剂量的各CPP序列作用GES-1细胞3h进入细胞后荧光强度的比较图。图37为本发明实施例9流式细胞术测细胞凋亡的结果图。图38为与图37对应的柱状统计图。图39为本发明实施例9以WB检测PARP-1表达水平的结果图。图40为本发明实施例9以WB检测凋亡相关分子变化图。图41为本发明实施例9以WB检测PARP-1分子变化图。
具体实施例方式下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。JWA蛋白含有188个氨基酸，其具体序列图如图1所示。本专利发明人针对JWA蛋白跨膜区域以外的部分，设计一系列随机多肽序列片段，并采用现有方法(如Fmoc法等)合成，然后进行筛选和鉴定。以下实施例是对筛选、鉴定过程的详细说明，除具有活性的多肽外选取了一些代表性的非活性多肽，并非表示研究过程中仅涉及这些多肽。实施例1多肽的设计与合成本实施例设计与合成的多肽如表I所示，其中JWA-1、JWA-2、JWA-3选取的氨基酸序列与图1中阴影部分一致。表I实施例1设计与合成的多肽序列
权利要求
1.一种具有抗肿瘤活性的多肽，其特征是，所述多肽的氨基酸序列如1、11、111、或IV所示:I:FPGSDRF ；II:X-FPGSDRF ； III:FPGSDRF-Z ；IV:x-fpgsdrf-z ； 其中，氨基酸S经磷酸化修饰，X、Z分别为氨基酸或氨基酸序列； X选自F、(R)9、(R)9-F、6-氨基己酸、6-氨基己酸-F、6-氨基己酸-(R)9、6-氨基己酸-(R)9-F 之一； Z选自A、(G)n-R⑶、A-(G)n-RGD之一，η为大于或等于O的整数。
2.根据权利要求1所述具有抗肿瘤活性的多肽，其特征是，所述η的取值范围为0-10。
3.根据权利要求2所述具有抗肿瘤活性的多肽，其特征是，所述多肽的N端经乙酰化修饰、C端经酰胺化修饰。
4.权利要求1至3 任一项所述具有抗肿瘤活性的多肽用于制备抗肿瘤药物的用途。
5.根据权 利要求4 所述的用途，其特征是，所述肿瘤为黑色素瘤或胃癌。
全文摘要
本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的多肽及其用途。该多肽的氨基酸序列如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、或Ⅳ所示ⅠFPGSDRF；ⅡX-FPGSDRF；ⅢFPGSDRF-Z；ⅣX-FPGSDRF-Z；其中，氨基酸S经磷酸化修饰，X、Z分别为氨基酸或氨基酸序列；X选自F、(R)9、(R)9-F、6-氨基己酸、6-氨基己酸-F、6-氨基己酸-(R)9、6-氨基己酸-(R)9-F之一；Z选自A、(G)n-RGD、A-(G)n-RGD之一。该多肽可用于制备抗肿瘤药物。本发明多肽序列较短，易于实现规模化生产；在较低剂量下即显示出显著的抗肿瘤活性，与化学药物联合使用可增强化学药物如三氧化二砷(As2O3，ATO)对肿瘤细胞的毒性。本发明多肽对正常组织细胞无毒性，具有广阔的应用前景。
文档编号A61K33/36GK103239710SQ201310178099
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月14日 优先权日2013年5月14日
发明者周建伟, 徐进, 李璇, 李爱萍 申请人:南京医科大学