抗hiv-1活性的多肽cj128及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗Hiv-I活性的多肽CJ128及其应用。
【背景技术】
[0002] 人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV)是引起人类获得性免疫 缺陷综合征（Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的病原体。自 1981 年美国首 次发现以来，艾滋病在全球范围内迅速传播。2014年7月UNAIDS的最新报告显示，全球HIV 感染人数已达3500万，2013年，中国新诊断HIV感染者63498例，估计中国目前存活的HIV 感染者78万人。
[0003] 目前将几种抗病毒治疗药物联合使用的高效抗逆转录病毒治疗联合疗法（Highly Active Anti-Retroviral Therapy，HAART)，极大的降低了 HIV患者体内的病毒载量，延缓 了疾病进程。然而，截止到目前，艾滋病依然无法治愈。随着抗逆转录病毒药物的广泛应用， 耐药性问题日益凸显。而且，由于该方法不能完全清除病毒，病人需要终身服药，但长期用 药具有严重毒副作用。鉴于这些问题，研宄和开发针对新靶点的抗HIV药物就显得尤为紧 迫。
[0004] HIV全基因组约有9700个碱基，由结构蛋白基因、调控元件与调节蛋白基因和辅 助蛋白基因组成。HIV 的辅助蛋白包括 Vif (virion infectivity factor)、Nef (negative factor)、Vpr (viral protein R)与 Vpu (viral protein U)〇
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种抗HIV-I活性的多肽CJ128及其应用。
[0006] 本发明提供了一种多肽，命名为多肽CJ128,为序列表的序列1所示的多肽。
[0007] 本发明还保护多肽CJ128在制备抗HIV药物中的应用。所述HIV可为HIV-1，具体 可为HIV-IB亚型，更具体可为pNL4. 3野生株。
[0008] 本发明还保护一种抗HIV的药物，其活性成分为多肽CJ128。所述HIV可为HIV-1， 具体可为HIV-IB亚型，更具体可为pNL4. 3野生株。
[0009] pNL4. 3野生株的制备过程具体如下：将PNL4. 3质粒转染293T细胞，在CO2培养箱 中37°C培养36小时，收集上清，该上清即为病毒液。
[0010] Vpu蛋白是HIV-I所特有的辅助调节蛋白，由77-86个氨基酸组成，相对分子质量 约为9kDa，是一种跨膜蛋白。Vpu蛋白的功能主要是降解HIV受体蛋白CD4分子和细胞天然 抗病毒蛋白Tetherin因子，促进新生病毒颗粒从被感染细胞的质膜上释放。研宄显示，Vpu 蛋白变异或其功能受到抑制时，HIV-I病毒颗粒的产生会明显减少，表明Vpu蛋白对HIV-I 病毒复制至关重要。这也提示Vpu蛋白可作为抗HIV药物研发的新靶点。HIV调控蛋白必 须与特定的细胞因子结合才能发挥作用。由于HIV具有高度变异性，而细胞基因的复制相 对精确，因此本发明创造性的使用来源于Vpu蛋白的多肽，利用其竞争性的阻断Vpu与相关 细胞蛋白作用的位点，从而研宄新的抗HIV药物，并有效的防止出现耐药性。这可能为艾滋 病治愈带来新的希望。
[0011] 本发明对于艾滋病的治疗具有重大价值。
【具体实施方式】
[0012] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0013] TC50代表半数毒性浓度，即50%细胞出现毒性时的药物浓度，利用GraphPad Prism 6软件计算的得到TC50值。IC50代表半数抑制浓度，即药物抑制50%病毒复制时的 浓度，利用GraphPad Prism 6软件计算的得到IC50值。
[0014] pNL4. 3质粒：公众可以从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研宄所获 得；参考文献：Wang C, Mitsuya Y, Gharizadeh B, Ronaghi M, Shafer Rff. Characterization of mutation spectra with ultra-deep pyrosequencing:application to HIV-Idrug resistance. Genome research 2007;17:1195-201. ;pNL4.3 质粒含有 HIV-1B 亚型野生株 的全基因组序列，转染细胞并表达可以得到HIV-IB亚型pNL4. 3野生株。
[0015] HIV-IB亚型pNL4. 3野生株简称pNL4. 3病毒。pNL4. 3病毒由pNL4. 3质粒转染 293T细胞表达获得。pNL4. 3病毒的制备过程如下：用含体积百分比为10%的胎牛血清的 DMEM培养基悬浮293T细胞，得到4 X IO5个细胞/ml的细胞悬液，将细胞悬液加入6孔培养 板（每孔2ml)，在0)2培养箱中37°C培养24小时；采用Lipofectamine 2000试剂盒（按 说明书操作）将PNL4. 3质粒转染293T细胞（每孔转染4微克pNL4. 3质粒），在0)2培养 箱中37°C培养36小时，收集上清（将上清用HIV-1P24抗原检测试剂盒进行P24抗原测定， 结果为阳性），该上清即为PNL4. 3病毒的病毒液，分装后-80°C保存。
[0016] 293T细胞（人胚肾传代细胞系）：参考文献：Li H，Geng Q，Guo W，Zhuang D，Li L，Liu Y，Bao Z，Liu S，Li J. Screening for and verification of novel mutations associated with drug resistance in the HIV type lsubtype Bi in China.Plos 0ne2012 ;7:e47119.。
[0017] HIV-1P24抗原检测试剂盒：河北医科大学生物医学工程中心。
[0018] MT-2细胞（传代人T淋巴细胞系）：参考文献：刘思扬，庄道民，董如华，白 丽，李敬云.两种HIV非核苷类逆转录酶抑制剂耐药病毒株的体外选择和鉴定.药学学 报· 2010, 45(2) :241-246.。
[0019] TZM-bl细胞（也称JC57BL-13细胞，来源于HeLa细胞系）：参考文献："孙坚萍， 马丽英，黄江虹，余小玲，徐维洒，纪燕，黄洋，邵一鸣.TZM-bl细胞系检测我国HIV-I 病毒表型耐药性.中国艾滋病性病杂志.2008 ; 14(5) :439-449.。
[0020] Lysis Buffer :20ml Triton X-100、230ml 蒸馏水、250ml 甘油和 500ml Tris-HCl 缓冲液（1M, ρΗ7· 8)混合。FluorAce Working Solution :96 μ I IOOmM MUG 溶液（MUG，全称 为 4-Methylumbelliferyl β -D-galactopyranoside，分子式为 C16H1808;MUG 溶液用 DMSO 配 制）、10ml Lysis Buffer、6ml蒸馏水和15 μ 1 β -巯基乙醇混合。终止液：IM甘氨酸水溶 液，用10Μ NaOH水溶液调整pH值至14,4°C保存备用。
[0021] 实施例1、多肽的制备
[0022] 本发明的发明人设计了多肽CJ128,其氨基酸序列如下：
[0023] 多肽 CJ128 (序列表的序列 I) :MQPIIVAIVALVVAIIIAIVRRRRRRRRR。
[0024] 人工合成多肽CJ128。
[0025] 实施例2、多肽的毒性测定
[0026] 1、将Img实施例1制备的多肽CJ128溶于20 μ I DMSO,然后用DMSO进行2倍梯度 稀释，得到含有不同浓度的多肽的各个多肽稀释液。
[0027] 2、取白色透明96孔板上，加入步骤1制备的多肽稀释液（每孔1 μ 1)。
[0028] 3、用含体积百分比为10%的胎牛血清的RPMI1640培养液悬浮ΜΤ-2细胞，得到 I. 5 X IO5个细胞/ml的ΜΤ-2细胞悬液。
[0029] 4、取步骤3得到的MT-2细胞悬液，加至完成步骤2的96孔板上（每孔200 μ 1)， 瞬时离心，然后37°C、5% CO2培养72小时。
[0030] 5、完成步骤4后，取所述96孔板，每孔加入20 μ ICellTiter- Glo5 Luminescent Cell Viability Assay (CelITiter-Glos'发光法细胞活力检测试剂盒），通过 Wallac 1420 读数仪测定发光信号（ATP是活细胞新陈代谢的一个指标，通过对ATP进行定量测定来检测 培养物中活细胞数目）。
[0031] 多肽 CJ128 的 TC50 值为 34·39μΜ。
[0032] 试验结果表明，多肽对ΜΤ2细胞有一定程度的毒性。
[0033] 实施例3、多肽的抗HIV-I活性测定
[0034] 1、将Img实施例1制备的多肽CJ128溶于20 μ I DMS0,然后用DMSO进行2倍梯度 稀释，得到含有不同浓度的多肽的各个多肽稀释液。
[0035] 2、取白色透明96孔板上，加入步骤1制备的多肽稀释液（每孔1 μ 1)
[0036] 3、用含体积百分比为10%的胎牛血清的RPMI1640培养液悬浮ΜΤ-2细胞，得到 3. OX IO5个细胞/ml的ΜΤ-2细胞悬液。
[0037] 4、用含体积百分比为10%的胎牛血清的RPMI1640培养液调整pNL4. 3病毒的病毒 液中的病毒浓度，得到400TCID50/ml的病毒稀释液。
[0038] 5、将步骤3得到的MT-2细胞悬液与步骤4得到的病毒稀释液等体积混合，然后将 混合液加至完成步骤2的96孔板上（每孔200 μ 1)，瞬时离心，然后37°C、5% CO2培养72 小时，收集培养上清。
[0039] 6、用含体积百分比为10 %的胎牛血清的DMEM培养液悬浮TZM-bl细胞，得到 3X IO5个细胞/ml的TZM-bl细胞悬液。
[0040] 7、将步骤6得到的TZM-bl细胞悬液加入黑色96孔板（每孔40 μ 1)。
[0041] 8、完成步骤7后，取所述黑色96孔板，每孔加入20 μ 1步骤5得到的培养上清，瞬 时离心，然后37°C、5% CO2培养24小时。
[0042] 9、完成步骤8后，每孔加入30 μ I FluorAce Working Solution，继续孵育2小 时，然后加入10 μ 1终止液，用Wallac 1420读数仪测定β -gal基因的表达（TZM-bl细胞 被HIV-I感染后表达的Tat蛋白可以激活LTR控制下的β -gal报告基因的表达，其表达量 与感染的HIV-I的量成正比，通过检测报告基因的表达水平，就可以评价药物的抗病毒效 果）。
[0043] 多肽 CJ128 的 IC50 值为 4· 29 μ Μ。
[0044] 试验结果表明，多肽对HIV-pNL4. 3野生型病毒株具有抑制活性。
[0045] 综合实施例2和实施例3的结果，得到治疗指数，即TI值（TI = TC50/IC50)。多 肽CJ128的治疗指数为8. 025671。
[0046] 本发明提供了多肽的临床前药效数据，为其进一步研宄和上市提供参考。
【主权项】
1. 序列表的序列1所示的多肽。2. 权利要求1所述多肽在制备抗HIV药物中的应用。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述HIV为HIV-I。4. 如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述HIV为HIV-IB亚型。5. 如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述HIV为pNL4. 3野生株。6. -种抗HIV的药物，其活性成分为权利要求1所述多肽。7. 如权利要求6所述的药物，其特征在于：所述HIV为HIV-I。8. 如权利要求6所述的药物，其特征在于：所述HIV为HIV-IB亚型。9. 如权利要求6所述的药物，其特征在于：所述HIV为pNL4. 3野生株。
【专利摘要】本发明公开了一种抗HIV-1活性的多肽CJ128及其应用。本发明提供了一种多肽，命名为多肽CJ128，为序列表的序列1所示的多肽。本发明还保护多肽CJ128在制备抗HIV药物中的应用。本发明还保护一种抗HIV的药物，其活性成分为多肽CJ128。本发明对于艾滋病的治疗具有重大价值。
【IPC分类】A61P31/18, A61K38/16, C07K14/16
【公开号】CN104961810
【申请号】CN201510362895
【发明人】李林, 李敬云, 常帅, 蔡利锋, 李天一, 李韩平, 鲍作义, 刘永健, 刘思扬, 庄道民, 王晓林
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年6月26日