延龄草苷在制备用于治疗和/或预防小胶质细胞介导的疾病的药物中的用途的制造方法与工艺

本发明涉及医药技术领域，具体地涉及延龄草苷在制备用于预防和/或治疗小胶质细胞介导的相关疾病、尤其是神经免疫炎症性疾病的药物中的用途，尤其是涉及延龄草苷在制备用于预防和/或治疗脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、多发性硬化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、艾滋病相关痴呆、疯牛病等免疫相关疾病的药物中的用途。另外，本发明还涉及包含延龄草苷的药物组合物及其用途。

背景技术：
小胶质细胞(microglia)是中枢神经系统的神经胶质细胞中的一种，其体积最小，胞体呈杆状或椭圆，表面有许多棘突。小胶质细胞的作用主要与巨噬细胞相似，作为中枢神经系统中参与免疫反应的主要效应细胞，在神经系统原发性疾病或感染引起的炎症中参与免疫应答。中枢神经系统疾病往往伴有神经元细胞的大量坏死以及凋亡，而这些坏死病灶周围聚集大量激活的小胶质细胞，并且可以检测到其分泌的NO、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)等细胞因子，因此其介导的炎症反应在这些疾病进程中的作用逐渐被人们所重视。某些自身免疫性神经系统疾病与小胶质细胞相关，小胶质细胞可通过提呈抗原激活T细胞而使神经系统损伤。目前，这种小胶质细胞介导的炎症反应被认为是多种神经系统疾病发生或恶化的可能机制，因而引起人们的广泛关注。阿尔茨海默病又称为早老性痴呆，是一种神经退行性疾病，主要病理表现为大脑皮质神经元广泛死亡，造成大脑萎缩，但是很少累及运动神经元。随着研究的不断深入，人们发现：通过对阿尔茨海默病死亡患者脑组织的解剖，除了可以观察到广泛的神经元纤维绞扭成团及大量坏死的神经元细胞，还可以在其附近发现被激活的小胶质细胞及其表达产物，例如TNF-α、IL-6等。这表明阿尔茨海默病与小胶质细胞的激活有关。帕金森病主要表现是基底节的黑质细胞进行性变性，属于慢性疾病。人们发现帕金森病患者的脑内有大量被激活的小胶质细胞、炎症因子等物质，提示帕金森病的进程与小胶质细胞介导的炎症反应有关(参见许玲等人的小胶质细胞介导的炎症反应与中枢神经系统疾病，现代免疫学，2011年，第31卷，第2期：160-163页)。近几年来，随着研究的不断深入，发现小胶质细胞(microglia)的异常激活在脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、多发性硬化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、艾滋病相关痴呆、疯牛病等疾病中都发挥重要作用，是上述疾病病理发展过程中造成神经损伤的主要病因之一。小胶质细胞是中枢神经系统免疫细胞，在脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤等疾病的病理状态下，微环境的微小变化即可激活小胶质细胞，使其从静息状态快速转向活化状态。整个活化过程呈现瀑布效应：分化、增殖，免疫分子表达或表达上调，迁移至损害部位，发生形态、免疫显性和功能改变等。其形态上体积增大、胞体变圆并具有变形、吞噬作用；功能上开始大量表达一些与抗原识别和提呈有关的膜表面分子，如表达主要组织相容性复合物Ⅱ(MHC)等；超表达基质蛋白酶9(MMP9)，降解血脑屏障。更重要的是，显著上调许多细胞因子的分泌水平，其中少部分如GDNF促进神经元存活，而大部分如肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)等具有神经元损害作用，还有趋化因子如单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、不规则趋化因子(Fractalkine)、巨噬细胞炎性蛋白1(MIP-1)等介导白细胞趋化；还产生一氧化氮(NO)、活性氧簇(ROS)和类花生酸类(如前列腺素E2)等，导致继发性脑损害。小胶质细胞不仅是天然免疫效应细胞，同时参与启动和调节获得性免疫，参与多发性硬化发病。因此，抑制小胶质细胞的过度活化，平衡其分泌的各种促炎因子，可以有效预防和治疗脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、多发性硬化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、艾滋病相关痴呆、疯牛病等疾病。以往的文献或专利也表明，耐勒克松(naloxone，JPharmacolExpTher2000,293：607-617)、右美沙芬(dextromethorphan，JPharmacolExpTher2003，305：212-218)、四氢异喹啉衍生物(CN101553229A，中国专利申请号200780045274.0，公开日2009年10月7日)、雷公藤氯内酯醇T4(CN101332200A，中国专利申请号200810071485.8，公开日2008年12月31日)等可以通过抑制小胶质细胞活化防治脑部炎症相关疾病。

技术实现要素：
本发明人发现了延龄草苷可用于预防和/或治疗小胶质细胞活化介导的疾病、特别是小胶质细胞介导的神经毒性作用所引起的神经免疫炎性疾病，更特别地所述疾病选自：脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、多发性硬化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、艾滋病相关痴呆、疯牛病。基于上述发现，完成了本发明。本发明还提供了包含延龄草苷的药物组合物，以及包含延龄草苷的药物组合物在制备用于预防和/或治疗小胶质细胞活化介导的疾病、特别是小胶质细胞介导的神经毒性作用所引起的神经免疫炎性疾病中的用途，更特别地所述疾病选自：脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、多发性硬化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、艾滋病相关痴呆、疯牛病。本发明的第一方面提供下式的延龄草苷在制备用于预防和/或治疗小胶质细胞活化介导的疾病的药物中的用途，在一个实施方案中，所述疾病是小胶质细胞介导的神经毒性作用所引起的神经免疫炎性疾病。在另一个实施方案中，所述疾病选自：脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、多发性硬化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、艾滋病相关痴呆、疯牛病。在一个实施方案中，所述药物给予有需要的对象的每日剂量以延龄草苷计为0.01-1000mg/kg体重，优选为0.1-100mg/kg体重，更优选为1-100mg/kg体重。在另一个实施方案中，延龄草苷是以延龄草苷单体的形式提供的，或者是以包含延龄草苷的植物提取物的形式、优选以包含延龄草苷的蒺藜粗皂苷的形式提供的。优选地，所述植物包括但不限于：蒺藜(Tribulusterrestris)、延龄草(Trilliumtschonoskiimaxim)。更优选地，所述植物提取物、优选蒺藜粗皂苷按重量计包含30％以上、优选为60％以上、更优选为90％以上的延龄草苷。本发明的第二方面提供一种用于预防和/或治疗小胶质细胞介导的疾病的药物组合物，其含有预防和/或治疗有效量的延龄草苷、或者包含延龄草苷的植物提取物、优选包含延龄草苷的蒺藜粗皂苷，任选的其他药物以及任选的药学可接受的载体。优选地，所述小胶质细胞介导的疾病为小胶质细胞介导的神经毒性作用所引起的神经免疫炎性疾病。特别地，所述小胶质细胞介导的疾病选自：脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、多发性硬化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、艾滋病相关痴呆、疯牛病。在一个实施方案中，基于所述药物组合物中活性成分的总重量，所述延龄草苷的含量为1-99％；优选为20-80％；更优选为40-60％；所述其他药物的含量为99-1％；优选为80-20％；更优选为60-40％。在一个优选实施方案中，所述其他药物选自：左旋多巴、卡比多巴、司立吉林、苯海索、苯扎托品、金刚烷胺、溴隐亭、培高利特、他克林、石杉碱甲、加兰他敏、占诺美林、盐酸多奈哌齐、酒石酸卡巴拉汀、盐酸美金刚、吡拉西坦、甲磺酸双氢麦角碱、己酮可可碱、麦角溴烟酯、阿司匹林、退黑素、姜黄素、去铁敏、艾地苯醌、甲磺酸替拉扎特和维生素C。在一个实施方案中，药学可接受的载体选自溶剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂、和抗氧化剂。优选地，所述药物组合物为单位剂量的制剂形式，该单位剂量的制剂形式中包含0.001mg-5000mg、优选为0.1mg-1000mg、更优选为1mg-100mg的延龄草苷。特别地，所述药物组合物的剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、丸剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、散剂、细粒剂、小丸剂、酏剂、注射剂、药用滴剂、软膏剂、洗剂、凝胶剂、乳膏、喷雾剂、栓剂、贴剂。本发明的延龄草苷一般以药物组合物的形式使用，这种组合物含治疗有效剂量的作为活性成分的延龄草苷和可药用辅料。含有延龄草苷的药物组合物可通过口服、注射或粘膜给药，可以制成片剂、胶囊、粉剂、颗粒、锭剂等剂型供临床应用。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。本申请提供了中药单体延龄草苷具有以下功能：减少活化小胶质细胞NO、TNF-α等细胞毒性炎症介质的产生。从而为延龄草苷应用于脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、多发性硬化等脑部免疫炎症相关疾病的防治提供了直接有力的实验依据和理论基础，既有很强的科学性和创新性，又有很高的开发应用价值。如本文所用的，术语“延龄草苷”也称为地索苷或延年草甙。延龄草苷的分子量为576.76，分子式为C33H52O8，CAS号为14144-06-0。本发明所用的延龄草苷是根据例如中国专利申请CN201110187744.5制备的，或者也可以是由商业上获得的。根据本发明，所用的延龄草苷还可以是以包含延龄草苷的植物提取物的形式、优选以包含延龄草苷的蒺藜粗皂苷的形式提供的。如本文所用的，术语“小胶质细胞介导的疾病”包括小胶质细胞介导的神经毒性作用所引起的神经免疫炎性疾病。特别地，小胶质细胞介导的疾病选自：脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、多发性硬化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、艾滋病相关痴呆、疯牛病。如本文所用的，术语“脑卒中”在中医上也称为中风，是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病。如本文所用的，术语“阿尔茨海默病”又称为早老性痴呆，是一种神经退行性疾病，主要临床表现为隐袭的、缓慢进展的健忘和短期记忆丧失，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍。如本文所用的，术语“帕金森病”是一种中老年人常见的运动障碍性疾病，又称震颤麻痹，其主要病理改变为中脑黑质多巴胺能神经元变性坏死和脑内路易小体的形成，临床主要表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓等症状。如本文所用的，术语“脑外伤”是指外力造成的脑部创伤。如本文所用的，术语“多发性硬化”是一种由自身免疫异常所致的中枢神经系统炎症性脱髓鞘性疾病，病程中缓解-复发是重要特点。如本文所用的，术语“肌萎缩性脊髓侧索硬化症”是一种渐进和致命的神经退行性疾病，累及上运动神经元，又影响到下运动神经元及其支配的躯干、四肢和头面部肌肉的一种慢性进行性变性疾病。如本文所用的，术语“艾滋病相关痴呆”是指艾滋病毒所引起的一种退行性神经系统疾病，临床主要表现为痴呆。如本文所用的，术语“疯牛病”又称为牛海绵状脑病，是由传染因子引起的牛的一种进行性神经系统的传染性疾病，是一种传染性海绵状脑病。该病的主要特征是牛脑发生海绵状病变，并伴随大脑功能退化，临床表现为神经错乱、运动失调、痴呆和死亡。如本文使用的，术语“治疗”具有其一般含义，并且在本文特别地是指对已经罹患小胶质细胞介导的疾病特别是本发明所述的小胶质细胞介导的疾病的动物个体采用本发明的药物进行处理，以期对所述疾病产生治疗、治愈、缓解、减轻等作用。类似地，如本文使用的，术语“预防”具有其一般含义，并且在本文特别地是指对可能罹患本发明所述小胶质细胞介导的疾病或者对本发明所述小胶质细胞介导的疾病具有罹患风险的动物个体采用本发明的药物进行处理，以期对所述疾病产生防止、预防、阻止、隔断等作用。可采用制剂领域中的常规技术，通过药品生产中常用的提取分离纯化手段得到本发明药物组合物的原料的有效成分，与一种或更多种药学可接受的载体混合，然后形成所需的剂型，来制备本发明的药物组合物。如本文所用的，“药学可接受的”表示当以通常用药剂量使用时没有实质的毒性作用，从而可被政府或与其相当的国际组织批准或者已被批准用于动物，更特别地用于人，或者被登录在药典上。本发明药物组合物中可用的“药学可接受的载体”可以是药物制剂领域中任何常规的载体，特定载体的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学可接受的载体包括药学领域常规的溶剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、粘合剂、润滑剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂、和抗氧化剂等。必要时，还可以在药物组合物中加入香味剂、防腐剂和甜味剂等。如本文使用的，术语“有效量”是指本发明所述活性成分的量，该量足以对本发明所述的小胶质细胞介导的疾病进行有效的治疗和/或预防。如本文使用的，术语“药物组合物”具有其一般含义。此外，本发明的“药物组合物”还可以以保健品、功能性食品、食品、食品添加剂等形式存在或提供。可采用制药领域特别是制剂领域中的常规技术，通过药品生产中常用的提取分离纯化手段得到本发明的药物组合物的原料的有效成分，任选地与一种或更多种药学可接受的载体混合，然后形成所需的剂型，来制备本发明的药物组合物。根据本发明的药物组合物，其为可以适用于口服给药、胃肠外给药或局部给药、外用给药的药物制剂。本发明的药物组合物可以制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。具体地说，根据本发明的药物组合物，所述的药物剂型包括但不限于：片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、注射液、注射用粉剂、透皮贴剂、软膏剂、凝胶剂、栓剂、口服溶液、口服混悬液、注射用乳剂、口服乳剂等、缓释片剂、控释片剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。用于口服施用的剂型可包括例如片剂、丸剂、硬或软胶囊剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、散剂、粉剂、细粒剂、颗粒剂、小丸剂、酏剂等，并不限于此。除了活性成分外，这些制剂还可包含稀释剂(例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和甘氨酸)、润滑剂(例如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其镁盐、钙盐和聚乙二醇)。片剂还可包含粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷。必要时，其还可包含药用添加剂，例如崩解剂(如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐)、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂等。片剂可根据常用的混合、造粒或包衣的方法制备。用于肠道外施用的剂型可包括例如注射剂、药用滴剂、软膏剂、洗剂、凝胶剂、乳膏、喷雾剂、混悬剂、乳剂、栓剂、贴剂等，并不限于此。根据本公开的药物组合物可口服或非肠道例如经直肠、经局部、经皮肤、经静脉内、经肌内、经腹膜内或经皮下施用。如本文使用的，术语“个体”或者“动物个体”具有其一般含义，并且在本文中可以指罹患或可能罹患本发明所述小胶质细胞介导的疾病的个体或动物个体，还可以指为了某种目的例如为了科学研究目的而使用的个体或动物个体。具体地说，所述的个体例如是动物个体，特别是哺乳动物个体，例如人、猪、狗、猫、牛、羊、马、大鼠、小鼠、家兔、豚鼠、猴等。更具体地说，本发明所述的个体是人。活性成分的药学可接受的剂量，即施用剂量，可以根据待治疗对象的年龄、性别和体重、待治疗的具体疾病或病理状态、疾病或病理状态的严重程度、施用途径和诊断者的判断而改变。考虑这些因素确定施用剂量在本领域技术人员的水平范围内。一般的剂量可以是0.01-1000mg/kg/日，具体地1-100mg/kg/日。然而，本公开的范围不以任何方式受限于所述施用剂量。附图说明为了更清楚地说明本发明，下面将对附图作简单地介绍，其中：图1：延龄草苷对小胶质细胞细胞活力的影响。BV-2细胞加入延龄草苷(1、5、10μmol/L)孵育24h后，弃上清，加入CCK-8，继续孵育0.5h，于450nm波长处测定吸光度。图2：延龄草苷对激活小鼠小胶质细胞系BV-2产生炎症介质(NO)水平的影响。不同浓度的延龄草苷(1、5、10μmol/L)预孵育BV-2细胞0.5h，然后加入细菌细胞壁脂多糖(Lipopolysaccharide，以下简称为LPS)(0.1μg/mL)进行刺激。培养24h后收集细胞培养上清液，Greiss法检测NO的浓度。#p＜0.05，与对照组相比；*p＜0.05，与模型组比较。图3a-3d：分别示出延龄草苷对小胶质细胞IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2mRNA表达的影响。小鼠小胶质细胞系BV-2加入延龄草苷(10μmol/L)预孵育0.5h，然后加入LPS(0.1μg/mL)进行刺激8h。用PBS洗1次，以Trizol试剂提取细胞总RNA。采用TaqManReverseTranscriptionReagents试剂盒将总RNA(1.5μg)反转录为cDNA(20μl体系)。取1μl的cDNA产物用作定量PCR扩增的模板。看家基因GAPDH作为内参。值用均数+标准差(mean+SD)表示，n＝3。#p＜0.05，与对照组相比；*p＜0.05，与模型组比较。图4：延龄草苷对激活小胶质细胞系BV-2产生炎症介质TNF-α水平的影响。延龄草苷(10μmol/L)预孵育BV-2细胞0.5h，然后加入LPS(0.1μg/mL)进行刺激。培养24h后收集细胞培养上清液，Elisa法检测细胞因子TNF-α含量。值用均数+标准差(mean+SD)表示，n＝3。#p＜0.05，与对照组相比；*p＜0.05，与模型组比较。具体实施方式中枢神经系统中的小胶质细胞来源于胚胎期的骨髓单核细胞，是脑内免疫反应的抗原递呈细胞和主要的免疫效应细胞，在中枢神经系统免疫反应过程中发挥着非常关键的作用。正常情况下，脑内的小胶质细胞处于静止状态。在脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、多发性硬化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、艾滋病相关痴呆、疯牛病等神经退变性疾病发病过程中，小胶质细胞异常激活，它的作用除了吞噬清除变性死亡的神经元之外，还分泌促炎因子和神经营养因子，可能参与炎症反应和神经元的修复与再生。小胶质细胞的形态具有可塑性，在静止状态为分支状，接受损伤信号刺激后细胞体积增大，突起伸长、增多，成为高度分支化的小胶质细胞，这是介于静止和激活之间的一种中间状态，它们很快演变为激活的小胶质细胞和脑吞噬细胞，所以可以根据形态的改变协助判断小胶质细胞是否处于激活状态。在LPS作用下，NO形成和释放量明显增加。NO可抑制线粒体复合体I的活性，使线粒体合成ATP减少，细胞由于能量耗竭而死亡。NO还可以与超氧离子发生反应形成毒性更大的亚硝酸盐自由基，直接攻击细胞的核酸、蛋白质、脂质等生物大分子，引起细胞死亡。除了NO之外，激活的小胶质细胞还会分泌多种细胞因子例如TNF-α、IL-1α、IL-1β、IFN-γ、IL-6、表皮生长因子等，而细胞因子与炎症反应的发生和神经元的损伤修复、再生密切相关。其中TNF-α在炎症反应过程中具有非常重要的作用。LPS能刺激小胶质细胞分泌TNF-α，TNF-α可促进星形胶质细胞和小胶质细胞合成集落刺激因子(colonystimulatingfactor，CSF)。CSF可以作为白细胞趋化因子吸引血液循环中的粒细胞和巨噬细胞到达中枢神经系统的炎症部位，参与炎症反应，从而放大了炎症。TNF-α还可诱导神经元MHCI表达上调，使它们易受MHCI限制性细胞毒性T细胞攻击。此外，TNF-α可干扰神经元和星形角质细胞的电生理特性，体外研究发现TNF-α可影响细胞膜电位、细胞内Ca2+平衡和长时程增强，因此与炎症过程中的细胞功能异常有关(参见周慧芳等人的帕金森病炎症/免疫异常细胞模型的建立，中华神经医学杂志，2003年，第2卷，第1期：48-51页)。下面将结合附图，以具体实施例的方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中所用的实验材料和方法，如无特别说明，均为常规材料和方法。制备实施例1：制备延龄草苷片剂根据常用方法混合以上成分并制成片剂。制备实施例2：制备延龄草苷胶囊根据常用方法混合以上成分并装入明胶胶囊中。制备实施例3：制备本发明药物组合物的片剂根据常用方法混合以上成分并制成片剂。制备实施例4：制备本发明药物组合物的胶囊根据常用方法混合以上成分并装入明胶胶囊中。实施例1：延龄草苷对小胶质细胞细胞活力的影响BV-2细胞(购自协和医科大学细胞库)加入延龄草苷(1、5、10μmol/L)培养24h后，弃上清，加入CCK-8，继续孵育0.5h，于450nm波长处测定吸光度。结果如表1所示。表1：延龄草苷对小胶质细胞细胞活力的影响相应的结果也示于图1中。如图1中所明确地示出的，延龄草苷不能抑制细胞活力，不引起细胞死亡。实施例2：延龄草苷对小胶质细胞分泌炎性介质的影响Greiss法的基本原理：生物系统中的NO释放后很快转变为NO2-和NO3-，后两者性质稳定，因此可以通过测定NO2-或NO3-来间接反映NO生成量。NO2-在酸性环境下与对氨基苯磺酸其加成反应，其产物与N-(1-萘基)-乙二胺发生反应，反应产物在548nm处有吸收峰。完全DMEM培养基(购自invitrogen公司)培养小鼠小胶质细胞系BV-2及原代培养的大鼠小胶质细胞。调整细胞浓度为4×105/mL，接种到48孔培养板内过夜，加入不同浓度的延龄草苷(终浓度为1、5、10μmol/L)预孵育0.5h，然后加入内毒素(LPS，终浓度0.1μg/mL)进行刺激。实验分组：正常对照组、LPS组、阳性对照组米诺环素(Mino)和延龄草苷加LPS组。用Greiss法检测NO的浓度。表2：延龄草苷对小胶质细胞分泌炎性介质的影响结果：阳性对照米诺环素(Mino)可以抑制LPS引起的NO的释放。延龄草苷干预也能明显抑制LPS引起的NO的释放，并在1-10μmol/L浓度范围内呈剂量依赖性，见图2。实施例3：延龄草苷对小胶质细胞IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2mRNA表达的影响。小鼠小胶质细胞系BV-2，种于12孔培养板内过夜，加入延龄草苷(10μmol/L)预孵育0.5h，然后加入LPS(0.1μg/mL)进行刺激8h。用PBS洗1次，以Trizol试剂(购自invitrogen公司)提取细胞总RNA。取样品进行波长为260nm和280nm的紫外检测，分析总RNA的度并进行定量。采用TaqManReverseTranscriptionReagents试剂盒(由AppliedBiosystems公司出售)和oligod(T)16引物(购自AppliedBiosystems公司)将总RNA(1.5μg)反转录为cDNA(20μl体系)。1μl的cDNA产物用作定量PCR扩增的模板。PCR扩增反应采用SYBRGreenPCRMasterMixreagentkits试剂盒(AppliedBiosystems公司)和相应特异引物。。表3：延龄草苷对小胶质细胞IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2mRNA表达的影响组别IL-1βmRNAIL-6mRNAiNOSmRNACOX-2mRNA正常对照组1.0091.0161.0271.075LPS组133.041100.53018.15514.791LPS+延龄草苷组5.5707.9236.8942.745结果：LPS可以显著地增加BV-2细胞IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2mRNA的表达；而延龄草苷显著降低了LPS诱导的IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2mRNA表达，见图3。实施例4：延龄草苷对激活小胶质细胞系BV-2产生炎症介质TNF-α水平的影响Elisa法基本原理：用特异性单抗包被的酶标板吸附待测抗原，再顺次将生物素标记的单抗、结合辣根过氧化物酶的链酶卵白素连接于待测抗原，加底物TMB显色，波长450nm处测吸光度。完全DMEM培养基(含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)培养小鼠小胶质细胞系BV-2及原代培养的大鼠小胶质细胞。调整细胞浓度为4×105/mL，接种到48孔培养板内过夜，加入延龄草苷(终浓度10μmol/L)预孵育0.5h，然后加入内毒素(LPS，终浓度0.1μg/mL)进行刺激。实验分组：正常对照组、LPS组和延龄草苷加LPS组。培养24h收集各处理组细胞培养上清液，用Elisa法检测细胞因子TNF-α含量。操作步骤按试剂盒说明书(R&DSystems公司)完成。表4：延龄草苷对激活小胶质细胞系BV-2产生炎症介质TNF-α水平的影响组别TNF-α(pg/ml)正常对照组-46.458LPS组2104.578LPS+延龄草苷组342.138结果：在正常情况下小胶质细胞BV-2培养上清中TNF-α含量极低，当用0.1μg/mLLPS刺激后，TNF-α的含量显著增高。而延龄草苷干预能明显抑制LPS引起的TNF-α的释放，见图4。综上所述，延龄草苷不仅能够减少活化小胶质细胞NO、TNF-α等细胞毒性炎症介质的产生，而且能够显著降低LPS诱导的IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2mRNA的表达。这表明延龄草苷可以用于防治小胶质细胞活化介导的疾病，尤其是小胶质细胞介导的神经毒性作用所引起的神经免疫炎性疾病，例如脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、多发性硬化等。