延缓慢性神经病理性疼痛发作的调配物和方法
【专利摘要】一种用于含有治疗性剂量的位点1钠通道阻滞剂的调配物的给药方案，其中所述给药方案提供了延长的神经阻滞并且呈有效量以在施加所述神经阻滞的部位且优选地区域(例如整个肢体)处将如痛觉过敏和/或痛觉异常的神经病理性疼痛的发作延缓至少一周且优选地更长。所述位点1钠通道阻滞剂优选地是蛤蚌毒素(STX)，优选地与皮质类固醇、优选地地塞米松组合。在一个优选实施例中，脂质体以控制释放系统形式包括于所述调配物中，产生延长的阻滞持续时间而无全身性毒性。如由实例所证实，将STX囊封于如脂质体的控制释放系统中，优选地还包括皮质类固醇，且以适合的给药方案投予以实现延长的神经阻滞而无全身性毒性会延缓痛觉过敏的发作。
【专利说明】延缓慢性神经病理性疼痛发作的调配物和方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明大体上涉及延缓慢性神经病理性疼痛发作的方法和组合物。
[0002] 政府支持
[0003] 本发明在政府支持下在由美国国家卫生研究院（National Institutes of Health)授予的授权号R01GM073626下进行。政府拥有本发明中的某些权利。
【背景技术】
[0004] 由神经系统的原发性病变或功能障碍引起的疼痛被定义为神经病理性疼痛，其中 神经创伤、糖尿病、多发性硬化症、HIV感染和不同形式的恶性病是一些常见的病因。仅在 美国中就报导了约375万例慢性神经病理性疼痛。R. N.哈顿（R. N. Harden)，"慢性神经 病理性疼痛：机制、诊断和治疗（Chronic Neuropathic Pain:Mechanisms, Diagnosis, and Treatment)"，神经学家（The Neurologist), 11: 111 (2005)。除了患者发病率之外，慢性神 经病理性疼痛的管理对医疗保健开支施加了显著的负担。
[0005] 尽管有包括类鸦片、NSAID和三环化合物在内的数种药物可供使用，但显著数量的 患者的疼痛控制不能令人满意，且可能经历不希望的副作用。已在慢性疼痛的各种动物神 经损伤模型中一致地报导了神经元活性增强，一种显要的神经病理性疼痛特征。参见例如 科格索尔（Coggeshall)等人，"A纤维感觉输入引发成年大鼠脊髓的背角中的神经元细 胞死亡（A-fiber sensory input induces neuronal cell death in the dorsal horn of the adult rat spinal cord)"，比较神经学杂志（J. Comp. Neurol), 435:276-282(2001); 戈夫林-李普曼（Govrin-Lippmann)等人，"隔断的神经中的进行中的活性：来源和随时 间的变化（Ongoing activity in severed nerves: source and variation with time)，'， 脑研究（Brain Res. ),159406-410 (1978);吴（Wu)等人，"在邻近神经纤维损伤之后未受 损伤的C纤维伤害感受器中自发活性的早发（Early onset of spontaneous activity in uninjured C-fiber nociceptors after injury to neighboring nerve fibers),y,神经科 学杂志（Journal of Neuroscience), 21: RC140 (2001)。
[0006] 有人认为，响应于损伤诱发的异常神经元脉冲而释放的兴奋性神经传递素（如 谷氨酸盐）会在背根神经节（DRG)和脊髓层面引起钙介导的兴奋性毒性和后续的细胞损 伤。参见例如D. W蔡（D.W. Choi), "|丐和兴奋毒性神经兀损伤（Calcium and Excitotoxic Neuronal Injury)"，纽约科学院年鉴（Ann. N.Y. Acad. Sci. ),747:162-171 (2006); 科格索尔等人，"A纤维感觉输入引发成年大鼠脊髓的背角中的神经元细胞死亡"， 比较神经学杂志，435:276-282 (2001) ;C. J.伍尔夫（C. J. Woolf)，"神经元可塑 性：增加疼痛增量（Neuronal Plasticity: Increasing the Gain in Pain)"，科学 (Science)，288:1765-1768(2000)。
[0007] 然而，使用短期神经传导阻滞剂（如利多卡因（Iidocaine)和布比卡因 (bupivacaine))微球尝试阻滞损伤诱发的神经元放电基本上已失败。温（Wen)等人，"坐 骨神经中的神经传导阻滞在大鼠保留神经损伤模型中预防但并不逆转脊髓微神经胶质中 p38 丝裂原活化蛋白激酶的活化（Nerve Conduction Blockade in the Sciatic Nerve Prevents but Does Not Reverse the Activation of p38Mitogen-activated Protein Kinase in Spinal Microglia in the Rat Spared Nerve Injury Model)，'，麻酉卒学（Ane sthesiology), 107:312-321 (2007);苏特（Suter)等人，"外周神经阻滞并不预防大鼠保留 神经损伤模型中的神经病理性疼痛发展（Development of neuropathic pain in the rat spared nerve injury model is not prevented by a peripheral nerve block)，'，麻酉卒 学，99 (6) : 1402-8 (2003)。实际上，已知氨基-酰胺局部麻醉剂本身（如布比卡因和利多卡 因）会引起神经毒性。戈尔德（Gold)等人，"来自大鼠的原发性传入神经元中的利多卡因毒 性（Lidocaine toxicity in primary afferent neurons from the rat)，'，药理学与实验 治疗学杂志（J. Pharmacol. Exp. Ther.)，285 (2) : 413-21 (1998);拉德温（Radwan)等人，"局 部麻醉剂对生长神经元的神经毒性：利多卡因、布比卡因、甲哌卡因和罗比卡因的比较研究 (The neurotoxicity of local anesthetics on growing neurons:a comparative study of lidocaine, bupivacaine, mepivacaine, and ropivacaine)，'，麻酉卒与镇痛(Anesth. Analg.)，94:319-24 (2002)。长期神经阻滞和其对神经病理性疼痛发作和维持的作用有待 确定。
[0008] 研发由单次注射提供延长的镇痛的局部麻醉剂已遇到三个主要的挑战：（1)作用 持续时间不足；（2)全身性毒性；以及（3)不良的局部组织反应。
[0009] 多种多样的控制释放技术已用于延长神经阻滞持续时间，但大多数这类系统与未 囊封的药物相比充其量使持续时间延长数倍。囊封协同药物组合的方法已实现持续许多 天的神经阻滞。举例来说，布比卡因和地塞米松共囊封在聚合微球中产生持续四天以上的 神经阻滞。德尔格（Drager)等人，麻醉学，89(4) :969-979(1998)。位点1钠通道阻滞剂 (其阻滞外表面上位点1处的钠通道）与常规局部麻醉剂的共囊封也大大延长了坐骨神经 阻滞。加入地塞米松将大鼠中的坐骨神经阻滞延长到九天以上（小羽（Kohane)等人，疼 痛（Pain)，104(1-2):415-421 (2003))。
[0010] 然而，对这类调配物的组织反应已成问题。常规局部麻醉剂本质上具肌肉毒性 (帕代拉（Padera)等人，麻醉学，108(5) :921-928(2008);佩蕾（Pere)等人，局部麻醉（ RegAnesth)，18(5) :304-307(1993))。其在从广泛范围的传递系统释放时，即使在传递系统 本身具最低限度毒性时，其也具肌肉毒性（帕代拉等人，麻醉学，108(5) :921-928(2008); 吉亚（Jia)等人，生物材料（Biomaterials)，25(19) :4797-4804(2004))。布比卡因的肌肉 毒性经延长的暴露持续时间显著增加（帕代拉等人，麻醉学，108(5) :921-928(2008)),表 明肌肉毒性可能是这类化合物持续释放的不可避免的后果。
[0011] 常规局部麻醉剂还具神经毒性（齐默（Zimmer)等人，麻醉师（A naesthesist)，56(5):449-453(2007);山下（Yamashita)等人，麻醉与镇 痛，97(2) :512-519(2003))。粒子本身的存在会增强体内局部麻醉剂肌肉毒性（帕代 拉等人，麻醉学，108(5) :921-928(2008))，且可在神经处引起可能比阻滞持续时间显 著更久的炎性反应（小羽等人，疼痛，104(1-2) :415-421 (2003);帕代拉等人，麻醉 学，108(5) :921-928(2008);和小羽等人，生物医学材料研究杂志（J Biomed Mater Res. )，59 (3):450-459 (2002))。
[0012] 小羽等人的美国专利第6, 326, 020号针对延长的神经阻滞持续时间公开了 含有天然存在的位点1钠通道阻滞剂与其它药剂（如局部麻醉剂、血管收缩剂、糖皮 质激素或肾上腺素药物）的组合的组合物。位点1钠通道阻滞剂并不引起肌肉或神 经毒性（巴内特（Barnet)等人，疼痛 110 (1-2) : 432-438 (2004);樱（Sakura)等人， 麻醉与镇痛，81 (2) : 338-346 (1995))，这使得其为延长释放调配物所需。美国专利第 6, 326, 020号公开了在含有肾上腺素的载液中仅含有TTX (在0. 1 %理论负载下）的 聚（乳酸_乙醇酸）微球，其产生持续约六小时的神经阻滞与一小时以上的发作。无肾 上腺素的TTX已展示出产生坐骨神经阻滞，但在大多数有效剂量下具有相当大的毒性 (小羽等人，麻醉学，89(1) :119-131 (1998))。采用仅TTX的聚合微球的小羽等人，疼 痛，104 (1-2) : 415-421 (2003)的研究展示出，TTX是致死性的（在0. 1 % w/w下）或对于神 经阻滞是低效的（在0. 05% w/w下），产生0分钟的中值阻滞。
[0013] 另外，将这些极强力的局部麻醉剂有效囊封在聚合物粒子中是极其困难的，因为 其是亲水性的且由其初始快速释放引起的全身性毒性是剂量限制性的（巴内特等人，麻醉 与镇痛，101(6) :1838-1843(2005);小羽等人，麻醉学，89(1) :119-131 (1998))。这使得完 全基于这类化合物（即不包括常规局部麻醉剂）的微粒系统的研发极其困难。
[0014] 需要一种预防或延缓如痛觉过敏或痛觉异常的神经病理性疼痛发作的调配物和/ 或方法。
[0015] 本发明的一个目的是提供一种预防或延缓如痛觉过敏或痛觉异常的神经病理性 疼痛发作的调配物。
[0016] 本发明的另一个目的是提供一种预防或延缓如痛觉过敏或痛觉异常的神经病理 性疼痛发作的方法。
【发明内容】
[0017] 本文中描述了一种用于含有治疗性剂量的位点1钠通道阻滞剂的调配物的给药 方案。所述给药方案提供了延长的神经阻滞并且在神经阻滞结束之后，通道阻滞剂以有效 量存在以在施加神经阻滞的部位且优选地区域（例如整个肢体）处将如痛觉过敏和/或痛 觉异常的神经病理性疼痛的发作延缓一周、优选地两周且优选地更长。
[0018] 调配物含有位点1钠通道阻滞剂，优选地蛤蛘毒素 （saxitoxin ;STX)，其以快速 神经阻滞、改进的效能和功效以及无局部毒性用作局部麻醉剂。在一个优选实施例中，将 脂质体用于调配物以便增大位点1钠通道阻滞剂的负载，产生延长的阻滞持续时间且无 全身性毒性。在一个实施例中，组合物仅含有位点1钠通道阻滞剂。在另一个实施例中， 组合物含有与皮质类固醇组合的位点1钠通道阻滞剂。在一个优选实施例中，位点1钠 通道阻滞剂是蛤蛘毒素，优选地与皮质类固醇组合，其中优选的皮质类固醇是地塞米松 (dexamethasone)。然而，除了脂质体之外，还可以使用替代控制释放调配物，如胶束、聚合 微米粒子或聚合纳米粒子。
[0019] 如由实例所证实，将STX囊封于脂质体中，优选地还包括皮质类固醇，且以适合的 给药方案投予以实现延长的神经阻滞而无全身性毒性会延缓痛觉过敏的发作。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1A、B和C是以下各项的图式：与在保留神经损伤（SNI)之后不接受治疗的大鼠 (空心圆）相比，来自被投予一个0. 3ml剂量的含有I. lmg/ml STX的脂质体（在此被称为 "STX-L"）作为神经阻滞注射的大鼠（深色圆）的脂质体内STX含量g/ml)和平均脂质 体大小（微米）（图1A)，随缩回潜伏期（秒）而变的感觉阻滞（图1B)和随伸肌体位推力 (g)而变的运动阻滞持续时间（天）（图1C)。数据是平均值与标准偏差（n = 5)。
[0021] 图2是比较不接受治疗（"未经治疗肢体"）与投予一个0. 3ml剂量的STX-L作为 神经阻滞注射的大鼠的M波和H波的图式。提供M波和H波潜伏期（ms)和M波幅度（mV)。 数据是平均值与标准偏差（n = 5)。
[0022] 图3A和B是与未经治疗大鼠（仅SNI)(深色圆）相比在SNI之后投予1个剂量 的STX-L的大鼠（SNI+STX脂质体）（空心圆）的经治疗（同侧肢体）（图3A)和未经治疗 肢体（对侧肢体）（图3B)随时间推移（数天）的缩回阈值（g)的图式。神经阻滞的持续 时间是7. 0天±1. 1天）。数据以平均值与标准偏差形式提供（n = 5)。
[0023] 图4A、B、C和D是经治疗（同侧肢体）（图4A)和未经治疗肢体（对侧肢体）（图 4B)随时间推移（数周）的缩回阈值（g)的图式；经治疗（同侧）肢体随时间推移（数天） 的缩回潜伏期（秒）（图4C);以及与未经治疗大鼠（仅SNI)(深色圆）相比在SNI之后投 予三个0? 3ml剂量的STX-L的大鼠（SNI+STX脂质体）（空心圆）随时间推移（数周）的体 重（g)。神经阻滞的持续时间以灰色方框形式描绘在图4A中（18. 1±3. 4天）。数据以平 均值与标准偏差形式提供（n = 5)。
[0024] 图5A和B是在两个时间段（操作后第5天和操作后第60天）从以下三组的SNI 大鼠收集的腰脊髓中绿色纤维酸性蛋白（GFAP)阳性面积％ (星形胶质细胞活化的指示） 的条形图：无 SNI但投予单独脂质体（无 STX)的大鼠（"媒剂（白色条柱）；有SNI但无 治疗的大鼠（"SNI"）（黑色条柱）；和有SNI且用STX-L治疗的大鼠（"SNI+STX脂质体"） (灰色条柱）。图5A展示同侧肢体的结果；且图5B展示对侧肢体的结果。数据以平均值与 标准偏差形式提供（n = 5)。
【具体实施方式】
[0025] I ?定义
[0026] 如本文中所用，位点1钠通道阻滞剂是在称为"位点1"的位置处结合钠通道的外 部开口的分子。在一个优选实施例中，位点1钠通道阻滞剂是天然存在的毒素或其衍生物。
[0027] 如本文中所用的术语"其衍生物"包括与非衍生的位点1钠通道阻滞剂具有实质 上相同功能性质（如生物学和/或药理学，即，有效阻滞钠通道）的位点1钠通道阻滞剂的 任何衍生物。
[0028] 如本文中所用的术语"痛觉过敏"意指增大的对疼痛刺激物的反应。
[0029] 如本文中所用的术语"痛觉异常"意指对通常无害的刺激物的疼痛反应。
[0030] II.组合物
[0031] 组合物被设计成用于延长局部麻醉剂阻滞的持续时间，且无全身性毒性。组合物 含有单独位点1钠通道阻滞剂或与皮质类固醇的组合，其以有效延长局部麻醉剂阻滞的持 续时间且无全身性毒性的量在医药学上可接受的载剂中投予。组合物在待阻滞神经的部位 以调配物形式、优选地以悬浮液形式局部投予。
[0032] 在优选实施例中，载剂是脂质体，然而，可以使用其它控制释放系统，如胶束、微米 粒子或纳米粒子。
[0033] A.位点1钠通道阻滞剂
[0034] 位点I钠通道阻滞剂包括河豚毒素 （tetrodotoxin ;TTX)、蛤蛘毒素、脱氨甲酰基 蛤蛘毒素、新蛤蛘毒素（neosaxitoxin)和膝沟藻毒素（gonyautoxins)(本文中统称为"毒 素"）。优选毒素是STX。
[0035] 蛤蛘毒素（一种由某些藻类天然产生的神经毒素）通过特异性地结合于神经元电 压门控钠通道的位点1以产生神经传导阻滞来抑制神经元活性。蛤蛘毒素首先是从阿拉斯 加奶油蛤（butterclam，大石房蛤（Saxidomus gigantcus))中提取出来的，其中其存在于 膝沟藻属的藻中。所报导的化学式是C10H15N7032HC1。人们认为，所述毒素具有其中并有 两个胍盐部分的全氢嘌呤核。蛤蛘毒素毒性太大以致无法单独用作局部麻醉剂。
[0036] 已从在菲律宾群岛发现的芋螺属（genus Conus)的捕鱼鸡心螺（fish hunting cone snail)的麻痹性毒液中分离出大量多肽。已发现这些命名为"芋螺毒素（conotoxin)" 的多肽会影响离子通道功能。麻痹性a、m和w芋螺毒素分别阻滞烟碱乙酰胆碱受体、钠通道 和电压敏感性钙通道（综述于奥利韦拉（Olivera)等人，科学，249:257-263(1990)中）。 阻滞钠通道的那些可以与河豚毒素和蛤蛘毒素相同的方式使用。
[0037] 1?给药方案
[0038] 优选地，适合的给药方案用于在投予第一剂量的脂质体之后提供延长的神经阻 滞，即持续时间长于7天、优选地长于8天、优选地长于10天、最优选地约18天。优选地， 与在未施加神经阻滞时相比，给药方案还适于提供延长的痛觉过敏发作延缓。在一些实施 例中，与在未施加神经阻滞时相比，给药方案适于延缓痛觉异常发作。
[0039] 囊封在载剂中的STX的剂量范围是在28微克与I. 5mg之间，优选地以在0. 1重 量％与90重量％之间、更优选地在5%与75%之间的负载位于载剂（优选地脂质体）中。
[0040] B?皮质类固醇
[0041] 适用于延长体内神经阻滞的皮质类固醇包括常规地经口或通过注射投予的 糖皮质激素，如地塞米松、可的松（cortisone)、氢化可的松（hydrocortisone)、强的 松（prednisone)等。其它糖皮质激素包括倍氯米松（beclomethasone)、倍他米松 (betamethasone)、氟尼缩松（flunisolide)、甲基强的松、帕拉米松（para methasone)、 泼尼松龙（prednisolone)、曲安西龙（triamcinolome)、阿氯米松（alclometasone)、安 西奈德（amcinonide)、氯倍他索（clobetasol)、氟氢可的松（fludrocortisone)、二氟松 二乙酸盐（diflurosone diacetate)、氟新诺龙丙酮（fluocinolone acetonide)、氟米 龙（fluoromethalone)、氟氢缩松（flurandrenolide)、哈西奈德（halcinonide)、甲轻松 (medrysone)和莫米松（mometasone)和其医药学上可接受的盐和混合物。不同皮质类固醇 的相对强度是众所周知的且描述在例如古德曼和吉尔曼（Goodman and Gilman's)中。
[0042] 这些皮质类固醇通常以在0. 05与Img地塞米松/mg之间、或基于糖皮质激素强度 的等效量（较弱需要较多，较强需要较少）投予。优选地，糖皮质激素以脂质与糖皮质激素 在10:0.0001到1:0.0001范围内、优选地6:0. 0001的摩尔比并入载剂（优选地脂质体） 中。优选地，糖皮质激素是地塞米松。
[0043] 含有蛤蛘毒素的脂质体已展示出产生延长的神经阻滞而无局部毒性，且在大多数 调配物中无全身性毒性。尽管这些脂质体不需要协同化合物，如布比卡因和地塞米松，但阻 滞持续时间通过其的使用而大大延长。参见美国公开申请案第2012-00342096号。举例来 说，并入地塞米松产生持续七天以上的阻滞而无任何可由神经行为测试方法和临床检查检 测到的全身性毒性（小羽等人，疼痛，104(1-2) :415-421(2003))。
[0044] C?载剂
[0045] 调配物可包括可以受控制的方式传递位点I钠通道阻滞剂的任何医药学上可接 受的载剂，以便提供持续时间如大于7天、大于8天、大于10天、大于15天或约18天的延 长的神经阻滞。适合的载剂包括（但不限于）脂质体、胶束、微米粒子和纳米粒子。位点I 钠通道阻滞剂可使用适合的配体连接于载剂，或可囊封在载剂中。
[0046] 在优选实施例中，载剂是脂质体，以干粉形式储存在小瓶中，或悬浮于水溶液中 以便注射。脂质体（LP)是球形囊泡，由被水性隔室间隔开的同心磷脂双层组成。LP具 有粘附于细胞表面并在细胞表面上形成分子膜的特征。脂质体是由围封水性内部的同 心磷脂双层组成的脂质囊泡（格雷戈里亚季斯（Gregoriadis)等人，国际药理学杂志 (Int J Pharm) 300:125-302005 (2005);格雷戈里亚季斯和赖曼（Ryman),生物化学杂志 (Biochem J)，124:58P(1971))。脂质囊泡包含由一个（单层）或数个（多层）磷脂双 层划定界限的一个或数个水性隔室（赛普拉（Sapra)等人，当代药物传递（Curr Drug Deliv)，2:369-81 (2005))。临床中脂质体的成功已归因于其调配物中所用的脂质的无毒性 质。脂质体的脂质双层和水性内部核心均可起到治疗的作用。
[0047] 脂质体已作为毒素的用于增强其在较低剂量下的功效的载剂被充分研究（阿 拉姆（Alam)等人，分子细胞学与生物化学（Mol Cell Biochem) 112, 97-1071992;哈 伊姆-马加什（Chaim-Matyas)等人，生物技术与应用生物化学（Biotechnol Appl Biochem) 17 (Pt 1),31-61993 ;德派瓦（de Paiva)和多利（Dolly),欧洲生物化学学会联 合会快报（FEBS Lett) 277, 171-4(1990);弗雷塔斯（Freitas)和弗勒扎尔（Frezard), 毒素（Toxicon) 35, 91-100 (1997);曼达勒（Mandal)和李（Lee),生物化学生物物理学报 (Biochim Biophys Acta)1563,7-17(2002))。
[0048] 脂质体已作为多种化学治疗剂的药物载剂被广泛研究（关于所述主题已 公开了约25, 000篇科学论文）（格雷戈里亚季斯，新英格兰医学杂志（N Engl J Med) 295, 765-70 (1976);格雷戈里亚季斯等人，国际药理学杂志300, 125-30(2005))。 水溶性抗癌物质（如阿霉素（doxorubicin))可以被保护在由磷脂双层定界的脂质体 的水性隔室内部，而脂溶性物质（如两性霉素（amphotericin)和辣椒素（capsaicin)) 可以被整合到磷脂双层中（阿布-法德勒（Aboul-Fadl),当今医药化学（Curr Med Chem) 12, 2193-214(2005);亚吉（Tyagi)等人，泌尿科学杂志（J Urol) 171，483-9(2004))。 使用脂质体传递化学治疗剂会引起药物动力学改进以及毒性概况减少（格雷戈里亚季 斯，生物技术趋势（Trends Biotechnol) 13, 527-37(1995);格雷戈里亚季斯和艾利森 (Allison),欧洲生物化学学会联合会快报（FEBS Lett)45, 71-41974;赛普拉（Sapra)等 人，当代药物传递，2:369-81 (2005))。
[0049] 1 ?磷脂
[0050] 优选的磷脂是天然存在的磷脂，如1，2二肉豆蘧酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (DMPC)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3磷酸胆碱（DSPC)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷 脂酰甘油钠盐（DSPG)和1，2-二肉豆蘧酰基sn-甘油-3-磷酸甘油钠盐（DMPG)。在优选实 施例中，脂质体用DMPC和DMPG、或DSPC和DSPG制造 （DMPC = 1，2-二肉豆蘧酰基-sn-甘 油-3-磷酸胆碱，DMPG = 2-二肉豆蘧酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油，DSPC = 1，2-二硬脂酰 基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，DSPG = 1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰甘油）。基于其 相转变温度（Tm)，用DMPC制得者被称为"液体"脂质体；用DSPC制得者被称为"固体"。
[0051] 2?医药学上可接受的载剂
[0052] 组合物可提供在任何医药学上可接受的载剂中以便注射，如注射用水，无菌水、盐 水、右旋糖溶液、羧甲基纤维素、甘露糖醇和缓冲溶液。对于表面施用的调配物，使用适用于 表面施用的载剂。
[0053] III?投药方法
[0054] 组合物可通过所属领域的技术人员已知的用于投予局部麻醉剂的任一种方法投 予。组合物可被调配成用于表面麻醉、浸润麻醉、区域阻滞麻醉、神经阻滞麻醉、静脉内区域 性麻醉、脊髓麻醉和硬膜外麻醉。
[0055] 优选地，组合物被调配成用于神经阻滞麻醉。典型的调配物适于注射或表面投予。
[0056] IV?用途
[0057] 本文中描述的给药方案可用于治疗、预防或延缓患者的慢性疼痛（如幻肢痛、神 经病变、神经病理性疼痛和/或反射性交感神经失养症）的发作。
[0058] 将通过参考以下非限制性实例进一步理解本发明。
[0059] 实例
[0060] 实例1:由含STX的脂质体延长的受损神经中神经元活性抑制对保留神经损伤 (SNI)模型中慢性疼痛发作的作用
[0061] 脂质体制备
[0062] 脂质体是使用1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3磷酸胆碱（DSPC)和1，2-二硬脂酰 基-sn-甘油-3-磷脂酰甘油（DSPG)和胆固醇通过薄脂质膜技术制造的。将DSPC:DSPG:胆 固醇：地塞米松（3:1:2:0. 0001摩尔比）溶解于温热氯仿和甲醇的混合物（9: lv/v)中。脂 质混合物在60°C下在旋转蒸发器（瑞士的步琦实验室设备有限公司（BUCHI Labortechnik AG, Switzerland))中干燥，获得薄脂质膜层。将旋转蒸发器内的真空压力在480托下维持 20分钟且接着经30分钟的时间逐渐降低到20托。使用温热的叔丁醇来复原脂质膜，之后 立即浸没在液氮中。接着，将脂质混合物冻干至少24小时，且所得脂质饼用温热的250mM硫 酸铵缓冲液水合，所述缓冲液含有〇. 6mM蛤蛘毒素二盐酸盐（来自马里兰州科利奇帕克的 美国食品药物管理局的谢伍德霍尔博士（Dr. Sherwood Hall, FDA, College Park, MD))。月旨 质体悬浮液使用高剪切实验室混合器（希尔巴森机器公司（Silverson Machines Inc.)) 以10, OOOrpm均质化，之后进行反复的冷冻-解冻循环。脂质体接着在50kD截止透析管中 对着在4°C下的0. 9%盐水透析48-74小时，得到不含游离STX的最终脂质体调配物。
[0063] STX脂质体（STX-L)含有I. Img STX/ml调配物且以0. 3ml的剂量投予。
[0064] 脂质体性质
[0065] 脂质体的大小使用Multisizer 3Coulter Counter (贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter Inc)测定。在使用布莱（Bligh)和拽尔（Dryer)方法（E. G?布莱（E.G. Bligh)，W. J?拽尔（W.J. Dyer),总脂质提取和纯化的快速方法（A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification), (1959))分离脂质部分之后，测定脂质体内STX含量。STX 含量的测定是基于先前由贝茨（Bates)等人，"蛤蛘毒素的化学分析.改进和修改（A chemical assay for saxitoxin. Improvements and modifications)，'，农业与食品化学杂 志（J.Agric. Food Chem. )26:252-254 (1978)公开的方法。
[0066] 动物照护
[0067] 这一研究是使用由在马萨诸塞州技术研究所（Massachusetts Institute of Technology)的动物照护委员会（Committee for Animal Care)根据 IASP 指南（M?齐 默尔曼（M.Zimmermann), "关于有意识的动物中实验性疼痛研究的道德指南（Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals)，'，疼 痛，16:109-110(1983))批准的方案进行的。将称重400-425克的成年雄性史泊格-多利 (Sprague-Dawley)大鼠（查尔斯河实验室（Charles River laboratories))成对圈养，允 许随意取用标准大鼠膳食和水，并按上午7点到下午7点光/暗循环维持。将动物随机分 成接受脂质体治疗和/或神经_损伤手术的组。将接受假手术的动物用作对照。大鼠在脂 质体治疗和/或神经-损伤手术之后在第5天或第60天通过吸入二氧化碳来安乐死。
[0068] 保留神经损伤（SNI)
[0069] 大鼠通过吸入2%异氟醚与98%氧气来麻醉。
[0070] 从左侧大转子到膝关节施加3-4cm皮肤切口。分离肌肉层以暴露坐骨神经。鉴别 坐骨神经的三根分叉部，且腓总和胫骨分支暴露且用5-0丝质缝合线结扎，同时应特别小 心以避免对腓肠神经的损伤。从两个分支横切结扎线下方约2_神经节段。在这一研究中， 每一组（对照组和STX-脂质体治疗组）测试5只大鼠。对照组接受皮肤切开和肌肉层分 离，但无神经损伤。脂质体治疗组中的大鼠在手术之后立即接受0.3ml STX调配物作为与 SNI程序同侧的神经阻滞注射。未接受脂质体STX的动物不接受任何其它形式的治疗。所 有神经阻滞注射均使用23号针执行。针从后内侧引入大转子，指向前内侧的方向。在与骨 接触时,针回撤约Imm且注射0. 3mL脂质体调配物。
[0071] 对于触觉和热反应的行为测试
[0072] 对所有动物测量对冯-弗雷长丝（Von-Frey filament ;伊利诺斯州伍德戴尔的 斯托汀公司（Stoelting Co, Wood Dale，IL))的后肢触觉反应，一周至少2-3次，持续60 天。如先前山卡拉帕（Shankarappa)等人，"强制运动延缓实验性糖尿病中的神经病 理性疼痛：对电压活化I丐通道的作用（Forced-exercise delays neuropathic pain in experimental diabetes:effects on voltage-activated calcium channels)，'，神经化 学杂志（J.Neurochem. ),118:224-236(2011)中所述，在适应具有铁丝网底部的罩壳之后， 将经校准的塞姆斯温斯坦单丝（Semmes Weinstein monofilament ;伊利诺斯州伍德戴尔的 斯托汀公司）施加到大鼠的外侧足底表面。将长丝以足以使单丝略微弯曲的力个别地施加 到每一后肢持续8秒的时间。长丝选择的模式是基于迪克森（Dixon)的上下法（Up-Down method)，其中测试用2g长丝开始，之后分别取决于阳性或阴性爪反应用较低或较高重量 的长丝（参见查普兰（Chaplan)等人，"大鼠爪中触觉痛觉异常的定量评估（Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw)，'，神经科学方法杂志（Journal of Neuroscience Methods), 53:55-63(1994))。在8秒刺激持续时间内反射性缩爪或藤脚被 视为阳性反应。引发50%阳性反应率所需的长丝质量被定义为缩回阈值且如先前所述（查 普兰）计算。在测试期的过程中研究者对各组保持不知情。
[0073] 为了测定STX-脂质体诱发的神经阻滞的持续时间，如由小羽等人，"针对延长的 持续时间局部麻醉再检查河豚毒素 （A re-examination of tetrodotoxin for prolonged duration local anesthesia)"，麻醉学，89:119-131(1998)先前所报导，使用经修改的热 板评估对热刺激的行为反应。简单来说，将毛巾约束的大鼠保持在56°C预加热的热板（加 利福尼亚州伍德兰希尔斯的IITC公司（IITC Inc. ,Woodland Hills, CA)上，且将后爪的足 底表面依序置于加热的板上。动物回缩其脚所需的时间被记录为缩回潜伏期。在12秒之 后不缩回其脚的动物由实验者从热板移出以防止热介导的损伤。缩回反应为6秒以上（最 大撤回潜伏期的50% )被视为神经阻滞。测量重复三次，且在每次测试之间暂停10秒。 [0074] 关于具体的大鼠接受什么治疗，实验者是不知情的。
[0075] 热伤害感受性阻滞的持续时间被计算为热潜伏期从较高值回到7秒值所需的时 间；7秒是成年大鼠约2秒的基线热潜伏期与12秒最大潜伏期之间的中点。
[0076] 为了测试经STX-脂质体治疗的非SNI动物的运动阻滞，通过以下方式测试每一动 物的伸肌体位推力：将每一后爪依序放在数字称重秤上且测量动物在其脚踝不触碰称重表 面的情况下可承载的最大重量的量。运动阻滞的持续时间被定义为从最大阻滞（<20g重量 承载）回到正常一半的重量承载所需的时间（参见小羽1998)。每一大鼠的中间点被定义 为[(任一腿承载的最高重量）_ (经阻滞的腿承载的最低重量）]/2+ (经阻滞的腿承载的最 低重量）。
[0077] 神经传导测量
[0078] 为了评估STX-脂质体对神经功能的作用，测量如通过热缩爪测试（STX-脂质体治 疗后第4天）来表征的在神经阻滞峰值时来自坐骨神经的诱发复合肌肉动作电位潜伏期和 振幅（参见山卡拉帕2011)。简单来说，大鼠通过吸入含2%异氟醚的氧气进行麻醉，且借 助于加热垫维持体温。使用超大矩形脉冲（24. 9mA，0. 05ms，IHz)经由针电极在脚踝或坐骨 切迹处刺激坐骨神经，同时将记录电极放置于脚的跖肌中。记录诱发的反应。神经近端和 远侧节段中的传导通过测量M和H波潜伏期来评估。
[0079] 实时 PCR
[0080] 总DRG RNA样品用Superscript III (英杰公司（Invitrogen))按照制造商的程序 进行逆转录。根据制造商的说明书在Taqman基因表达分析（应用生物系统公司（Applied Biosystems))中使用IOOng cDNA-式两份地运行每一样品的实时PCR反应。实时PCR 使用应用生物系统公司的Step One设备和程序执行。特异性扩增的cDNA的相对量使用 S-CT法计算（凡德瑟姆派尔（Vandesompele)等人，基因组生物学（Genome biology) ，3(7) :RESEARCH0034-l-0034. 11(2002);霍贝克（Hoebeeck)等人，实验室研究；技术方 法和病理学杂志(Laboratory investigation ；A Journal of Technical Methods and Pathology), 85(1) :24-33(2005))。所用应用生物系统公司引物如下：GAPDH :Rn99999916_ 31，0-肌动蛋白：此〇〇667869_1111;63(1(145〇:1?11〇〇577〇49_111141卩3 :1?11〇〇563784_1111;Cacna2dl ：Rn01442580_ml；Smagp ：Rn00788145_gl〇
[0081] 统计
[0082] 数据呈现为平均值土标准偏差（n = 5)。为了顾及多重比较，所有统计比较均使用 InStat软件（加利福尼亚州圣地亚哥的图板公司（GraphPad, San Diego CA))用图克-克 拉默检验（Tukey-Kramer test)进行。P值〈0.05被视为指示统计显著性。
[0083] 结果
[0084] 如图IA中所示，平均脂质体大小被测定为5. 2±1. 3微米，且平均脂质体内STX含 量（Ug/ml)被测定为 27±4(iig/ml)。
[0085] 当投予大鼠单次0. 3ml剂量的蛤蛘毒素脂质体时，脂质体产生高达6天的运动和 感觉神经阻滞且不产生局部神经损伤。（参见图1B，感觉阻滞持续时间和图1C，运动阻滞持 续时间）。
[0086] 来自经STX-L治疗和未经治疗的肢体的坐骨神经的染色切片证实无炎症或损伤 的迹象，而透射电子显微镜成像证实响应于STX-L治疗的正常神经形态（数据未示出）。
[0087] STX-L产生完全局部的神经传导阻滞。在髋部电刺激时，用STX-L治疗的大鼠的神 经传导记录证实'M'和'H'波的完全丢失，而在脚踝处的电刺激仅导致不存在'H'波，表明 在髋部区域极其局部的神经阻滞。
[0088] 图2中的表展示出STX-L治疗并不影响阻滞远端的神经节段的功能。
[0089] 如图3A和B中所示，单次剂量的STX脂质体调配物在预防或延缓SNI模型中的神 经病理性疼痛发作时是低效的，其中神经阻滞的持续时间是约7天。投予单次剂量STX-L 的SNI大鼠在神经阻滞逐渐减弱之后立即出现同侧后肢敏感性，而对侧肢体未展示出响应 于STX-L治疗的作用。
[0090] 与图3A中的数据对比，用于产生约18天显著更久神经阻滞的给药方案足以延缓 SNI大鼠中的神经病理性疼痛发作。这通过图4A中的日期突出显示。持续时间约18天的 延长的神经阻滞通过投予三个0. 3ml剂量的STX-L来获得。每一剂量在先前剂量的作用展 示出减弱迹象之后投予。神经阻滞持续时间使用图4C中的数据计算。
[0091] 如图4A中所示，STX-L将同侧后肢的触觉超敏（痛觉过敏）的发作延缓4周（灰 色条柱指示如由图4C计算的神经阻滞的持续时间）。图4B展示出在对侧肢体中，投予3个 连续剂量的STX-L彻底地预防触觉超敏的发作。
[0092] 图4D展示了接受STX-L的大鼠的体重增量在STX-L治疗期间展示出适度减小，但 之后很快恢复。
[0093] 图5A和B中的数据展示STX-L治疗减弱腰脊髓中神经病理性疼痛相关的星形胶 质细胞反应。
[0094] 从SNI动物收集的腰脊髓展示出绿色纤维酸性蛋白（GFAP)的表面积增大，这是星 形胶质细胞活化的指示，而经STX-L治疗的SNI动物证实了在同侧肢体中在操作后第5天 和第60天反应减弱。图5A和B中的条形图提供从图像分析技术获得的定量结果。
[0095] 实时 PCR
[0096] 为了进一步评估在注射后5天和第一次注射后2个月（60天）存在或不存在 神经损伤，使用来自接受神经阻滞的动物（每一组中n = 5)的背根神经节的RNA，使用 实时PCR来研究以下基因的表达：Gadd45a (贝福特（Befort)等人，欧洲神经科学杂 志（Eur J Neurosci. ),18(4) :911-922(2003))、ATF3(中込（Nakagomi)等人，神经科 学杂志（J Neurosci. ),23(12) :5187-5196(2003);桑（Song)等人，实验神经病学（Exp Neurol)，209 (1):268-278 (2008))、Cacna2dl (罗（Luo)等人，药理学与实验治疗学杂志（J Pharmacol Exp Ther. ),303 (3) :1199-1205 (2002);牛顿（Newton)等人，脑研究与分子脑 研究（Brain Res Mol Brain Res. ),95(1-2) :1-8(2001)),所述基因的表达被神经损伤改 变。将表达归一化到作为内部对照的GAPDH。所测试的其它基因是：Ppia、Htr3a、Scnlla、 Npy、Gal、Vip、Clqb、Jun 和 RTlDbl。
[0097] 同侧和对侧肢体的结果提供在以下表I中。
[0098]
【权利要求】
1. 一种包含有效量的任选地与糖皮质激素组合的位点1钠通道阻滞剂于控制释放系 统中的组合物的用途，其用于在不存在局部毒性的情况下提供持续时间长于7天、长于8 天、长于10天、或约18天的神经阻滞以便延缓神经病理性疼痛发作。
2. 根据权利要求1所述的用途，其中所述控制释放系统是选自由以下组成的群组：月旨 质体、胶束、微米粒子和纳米粒子。
3. 根据权利要求2所述的用途，其中所述控制释放系统是脂质体并且所述位点1钠通 道阻滞剂被囊封在所述脂质体中。
4. 根据权利要求1到3中任一权利要求所述的用途，其中所述位点1钠通道阻滞剂是 选自由以下组成的群组：河豚毒素（TTX)、蛤蛘毒素（STX)、脱氨甲酰基蛤蛘毒素、新蛤蛘毒 素和膝沟藻毒素。
5. 根据权利要求4所述的用途，其中所述位点1钠通道阻滞剂是STX。
6. 根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物包含有效量的选自由以下组成的群组 的糖皮质激素：地塞米松、可的松、氢化可的松、强的松、倍氯米松、倍他米松、氟尼缩松、甲 基强的松、帕拉米松、泼尼松龙、曲安西龙、阿氯米松、安西奈德、氯倍他索、氟氢可的松、二 氟松二乙酸盐、氟新诺龙丙酮、氟米龙、氟氢缩松、哈西奈德、甲羟松和莫米松和其医药学上 可接受的盐和混合物，从而相比于单独所述钠通道阻滞剂在不存在局部毒性的情况下增强 神经阻滞。
7. 根据权利要求6所述的用途，其中所述位点1钠通道阻滞剂是STX并且所述糖皮质 激素是地塞米松。
8. 根据权利要求3所述的用途，其中所述脂质体由一或多种选自由以下组成的群组 的脂质形成：1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3磷酸胆碱（DSPC)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘 油-3-磷脂酰甘油（DSPG)和胆固醇。
9. 根据权利要求8所述的用途，其中所述脂质体包含摩尔比为3:1:2:0.0001的 DSPC:DSPG:胆固醇：地塞米松。
10. 根据权利要求1到9中任一权利要求所述的用途，其中所述组合物以一个以上连续 投予的剂量、优选地至少两个剂量、更优选地至少三个剂量投予。
11. 一种提供神经阻滞并优选地延缓神经病理性疼痛发作的试剂盒，其包含 组合物，其包含任选地与糖皮质激素组合的位点1钠通道阻滞剂于控制释放系统中， 和 说明书，其关于给药方案以便向患者投予治疗有效量的所述组合物，从而在不存在局 部毒性的情况下提供持续时间长于7天、长于8天、长于10天、或约18天的神经阻滞。
12. 根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述控制释放系统是脂质体，且其中所述组 合物以干粉形式储存在小瓶中或悬浮于水溶液中以便注射。
13. -种延缓神经病理性疼痛发作的方法，其包含投予治疗有效量的包含有效量的任 选地与糖皮质激素组合的位点1钠通道阻滞剂于控制释放系统中的组合物，从而在不存在 局部毒性的情况下提供持续时间长于7天、长于8天、长于10天、或约18天的神经阻滞。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述控制释放系统是选自由以下组成的群组： 脂质体、胶束、微米粒子和纳米粒子。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述控制释放系统是脂质体并且所述位点1钠 通道阻滞剂被囊封在所述脂质体中。
16. 根据权利要求13所述的方法，其中所述位点1钠通道阻滞剂是选自由以下组成的 群组：河豚毒素（TTX)、蛤蛘毒素（STX)、脱氨甲酰基蛤蛘毒素、新蛤蛘毒素和膝沟藻毒素。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述位点1钠通道阻滞剂是STX。
18. 根据权利要求13所述的方法，其中所述组合物包含有效量的选自由以下组成的群 组的糖皮质激素：地塞米松、可的松、氢化可的松、强的松、倍氯米松、倍他米松、氟尼缩松、 甲基强的松、帕拉米松、泼尼松龙、曲安西龙、阿氯米松、安西奈德、氯倍他索、氟氢可的松、 二氟松二乙酸盐、氟新诺龙丙酮、氟米龙、氟氢缩松、哈西奈德、甲羟松和莫米松和其医药学 上可接受的盐和混合物，从而相比于单独所述钠通道阻滞剂在不存在局部毒性的情况下增 强神经阻滞。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述位点1钠通道阻滞剂是STX并且所述糖皮 质激素是地塞米松。
20. 根据权利要求15所述的方法，其中所述脂质体由一或多种选自由以下组成的群 组的脂质形成：1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3磷酸胆碱（DSPC)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘 油-3-磷脂酰甘油（DSPG)和胆固醇。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述脂质体包含摩尔比为3:1:2:0.0001的 DSPC:DSPG:胆固醇：地塞米松。
22. 根据权利要求13到21中任一权利要求所述的方法，其中所述组合物以一个以上连 续投予的剂量、优选地至少两个剂量、更优选地至少三个剂量投予。
【文档编号】A61K31/573GK104427987SQ201380032990
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年4月23日 优先权日:2012年4月23日
【发明者】S·A·山卡拉帕, D·S·寇汉 申请人:儿童医学中心公司