一种应用于鲍鱼、海参养殖的微生态制剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种应用于鲍鱼、海参养殖的微生态制剂，具体是由枯草芽孢杆菌制成的制剂在促进鲍鱼、海参的生长，提高鲍鱼、海参免疫力，防治鲍鱼、海参疾病，提高饲料转化率或净化养殖水质中的应用。
【专利说明】—种应用于鲍鱼、海参养殖的微生态制剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种应用于鲍鱼、海参养殖的制剂，具体是由枯草芽孢杆菌制成的制剂在促进鲍鱼、海参的生长，提高鲍鱼、海参免疫力，防治鲍鱼、海参疾病，提高饲料转化率或净化养殖水质中的应用。
【背景技术】
[0002]2006年底在全国爆发的大菱鲆药残事件给我们敲响了警钟。欧盟己于2006年全面禁止抗菌药作为饲料添加剂在养殖中的应用。为保证食品安全，美国等发达国家对肉类、海产品等抗菌药残留进行检测。随着中国加入世贸组织，名优产品出口被普遍看好。但由于国内养殖不科学使用抗生素等有害药物的现象严重，大大限制了产品的出口。开发抗菌药替代产品应用于养殖业是目前市场所需要的。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种促进鲍鱼、海参的生长，提高鲍鱼、海参免疫力，防治鲍鱼、海参疾病，提高饲料转化率或净化养殖水质的制剂，该制剂由枯草芽孢杆菌制成。
[0004]本发明制剂的制备优选是通过下述步骤实施的，但不局限于此制备工艺，公知的能实现的制备工艺均可以:采取含枯草芽孢杆菌的样品，然后将样品置于灭菌瓶内，4°C保存，研究时从中取一定量样品加入ISmL灭菌的稀释液中，充分混匀，在无菌操作台内，进行ιο'ιο'ιο'ιοΛ 10_5，10_6，10_7梯度稀释，取10_5，10_6，10_7三个稀释梯度，分别涂布于枯草芽孢杆菌选择性单菌落分离固体培养基上，置于培养箱内，30°c下培养48小时，选择长势良好的单菌落分别接种于枯草芽孢杆菌液体扩增培养基中，置于培养箱内，30°C下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出各菌种的干燥菌粉，然后根据《伯杰细菌鉴定手册》、相关细菌鉴定文献或16S rRNA序列对比分析进行枯草芽孢杆菌菌种鉴定和毒性试验，将无毒性的枯草芽孢杆菌干燥菌粉按需要比例添加粘合剂、沸石粉等辅料制成颗粒剂、片剂、胶囊、散剂、粉剂或液体制剂等各种剂型，或制成兽药、饲料添加剂或水质净化剂，也可加入其他活菌或低聚果糖等低聚糖起到协同作用。
[0005]枯草芽孢杆菌选择性单菌落分离固体培养基优选但不局限于:纯化水1L，蛋白胨10.0g,牛肉浸膏 3.0g, NaC15.0g,琼脂 25.0g,调 ρΗ7.2，121。。，灭菌 15 分钟。
[0006]枯草芽孢杆菌液体扩增培养基优选但不局限于:纯化水1L，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g,柠檬酸铁0.1g,氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙1.8g，氯化钾
0.55g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g,氯化锶0.034g,硼酸0.022g,硅酸钠0.004g,氟化钠
0.0024g,硝酸钠 0.0016g,磷酸氢二 0.008g,调 ρΗ7.4，121。。，灭菌 15 分钟。
[0007]为进一步具体说明本发明，发明人利用上述方法通过枯草芽孢杆菌选择性单菌落分离固体培养基分离鉴定出了无毒性的枯草芽孢杆菌，本发明所述枯草芽孢杆菌并不局限于为说明本发明所述的枯草芽孢杆菌，只要无毒性的枯草芽孢杆菌均是本发明所述，均在本发明的保护范围内。
[0008]本发明所述枯草芽孢杆菌优选但不限于枯草芽孢杆菌DH1215保藏编号CGMCC1887，枯草芽孢杆菌DHH25保藏编号CGMCC8562。
[0009]本发明实施说明中优选使用的枯草芽孢杆菌的细菌学性质，本发明并不局限本发明所述细菌学性质，只是为说明本发明的优选:
[0010]1、为说明本发明，本发明利用上述方法分离的枯草芽孢杆菌分别为枯草芽孢杆菌DH1215保藏编号CGMCC1887，枯草芽孢杆菌DHH25保藏编号CGMCC8562。
[0011]2、菌落形态
[0012]显微镜观察:长2-3微米，宽0.7-0.8微米，菌体杆状，革兰氏染色阳性，产芽孢，中生或近中生。
[0013]平板形态:菌落扁平，边缘不整齐，表面粗糙褶皱，颜色淡黄，表面无光泽。
[0014]3、生理生化鉴定
[0015]吲哚:—;明月父液化:+;卵黄反应:一；V~P试验:+ ;接触酶:+ ;是否需氧:
需氧性。
[0016]4、糖酵解实验鉴定
[0017]阿拉伯糖:一；葡萄糖:十；木糖:一；甘露糖:一。
·[0018]本发明所述的枯草芽孢杆菌指活生物个体。
[0019]本发明是以有效剂量的上述枯草芽孢杆菌作为主要活性成份，按照一定的制剂工艺，加入常规的赋形剂、调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、黏合剂、溶剂、增稠剂、增溶剂等辅料，制成任何一种适合于使用的剂型，如颗粒剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂、粉剂等剂型。
[0020]本发明所述以有效剂量的上述枯草芽孢杆菌作为主要活性成份制成活菌制剂，也可以是上述枯草芽孢杆菌与双歧杆菌、链球菌、酪酸梭菌等益生菌中的一种或几种或低聚糖等其他活性成份组合制成活菌制剂，以起到协同作用，提高效果。
[0021]本发明所指有效剂量是指以上述枯草芽孢杆菌根据上面所述单独或组合作为主要药物活性成份制成的固体活菌制剂包含的总活菌数不能低于IXlO6CFU / g，一般在I X IO9CFU / g 以上，最高可达到 IXio11CFU / g 或 IXio11CFU / g 以上。
[0022]本发明所指有效剂量是指以上述枯草芽孢杆菌根据上面所述单独或组合作为主要药物活性成份制成的液体活菌制剂包含的总活菌数不能低于IXlO6CFU / mL，一般在I X IO9CFU / mL 以上，最高可达到 IxIO11CFU / mL 或 IX IO11CFU / mL 以上。
[0023]由于本发明首次公开了枯草芽孢杆菌作为主要活性成份制成制剂在鲍鱼、海参养殖中的应用，因此含上述枯草芽孢杆菌的制剂在鲍鱼、海参养殖中的应用均属于本发明的保护范围。
[0024]本发明所述的枯草芽孢杆菌在制成任何一种剂型时，均具有促进鲍鱼、海参的生长，提高鲍鱼、海参免疫力，防治鲍鱼、海参疾病，提高饲料转化率或净化养殖水质的作用。任何剂型，如果其组份中含有上述枯草芽孢杆菌成份制备成制剂，在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示具有促进鲍鱼、海参的生长，提高鲍鱼、海参免疫力，防治鲍鱼、海参疾病，提高饲料转化率或净化养殖水质的作用，则落入本发明的保护范围之内。[0025]本发明所述的枯草芽孢杆菌可以制成兽药、饲料添加剂或养殖水质净化剂。将上述枯草芽孢杆菌制成的兽药、饲料添加剂或养殖水质净化剂应用于促进鲍鱼、海参的生长，提高鲍鱼、海参免疫力，防治鲍鱼、海参疾病，提高饲料转化率或净化养殖水质等鲍鱼、海参养殖中，则落入本发明的保护范围之内。
【具体实施方式】
[0026]制备例说明:上述已经对鲍鱼、海参制剂的制备进行说明，这里通过枯草芽孢杆菌分别为枯草芽孢杆菌DH1215保藏编号CGMCC1887、枯草芽孢杆菌DHH25保藏编号CGMCC8562颗粒剂为例进行具体说明，其他枯草芽孢杆菌菌种制剂的制备方法本领域技术人员通过本实施例很容易掌握，其他剂型的制备方法本领域技术人员通过本实施很容易掌握，在此不再一一叙述说明。制备方法并不局限于本发明实施例所述，公知的能够达到制备目的的方法均可以，实施例的制备说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。
[0027]制备实施例枯草芽孢杆菌颗粒剂的制备
[0028]I菌粉的制备和菌种的鉴定
[0029]采取含有枯草芽孢杆菌的样品(海参肠道内容物、海泥等)，然后将样品置于灭菌瓶内，4°C保存，研究时从中取部分样品加入ISmL灭菌的稀释液中，充分混匀，在无菌操作台内，进行 10' 10_2、10_3、10_4，10_5，10_6，10_7 梯度稀释，取 10_5，10_6，10_7 三个稀释梯度，涂布于枯草芽孢杆菌选择性单菌落分离固体培养基上，置于培养箱内，30°C下培养48小时，选择长势良好的单菌落分别接种到枯草芽孢杆菌液体扩增培养基中，置于培养箱内，30°C下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出干燥菌粉，活菌数均为IXlO9CFU / g以上，然后根据《伯杰细菌鉴定手册》、相关细菌鉴定文献和分离菌株进行16S rRNA基因测序后用BLAST与GenBank和RDP数据库中的基因序列进行相似性分析，经鉴定为枯草芽孢杆菌。分别为枯草芽孢杆菌分别为枯草芽孢杆菌DH1215保藏编号CGMCC1887、枯草芽孢杆菌DHH25保藏编号CGMCC8562。
[0030]2毒性试验
[0031]2.1动物及分组取30只SPF级别小鼠，6~8周龄，体重15~19g，随机分入枯草芽孢杆菌CGMCC1887组、枯草芽孢杆菌CGMCC8562组和未给药组，每组10只。
[0032]2.2制备菌液将上述不同的枯草芽孢杆菌菌粉分别用纯化水调制为含菌数均为I X IO9CFU / mL 的菌液。
[0033]2.3方法各枯草芽孢杆菌组和未给药组均给予相同的基础饲料，且饲养条件均一致，各枯草芽孢杆菌组每天灌服枯草芽孢杆菌菌液0.5mL，未给药组每天灌服纯化水
0.5mL,饲喂6个月，观察体重及毒性反应。
[0034]2.4 结果
[0035]各组小鼠均未出现异常情况，未发生振颤、痉挛、运动失调、姿态异常，无眼球突出，排尿正常，皮肤、呼吸正常，无死亡情况，且各枯草芽孢杆菌组的体重增加显著高于未给药组(P〈0.05)，表明枯草芽孢杆菌菌种有促进生长发育作用，说明效果良好，未见中毒反
应。
[0036]3制备成颗粒剂等剂型[0037]根据上述步骤和方法分离鉴定后，经实验检验无毒性，就可将枯草芽孢杆菌菌种制成菌粉，然后按照需要添加相关辅料制成各种剂型，优选据枯草芽孢杆菌菌粉的活菌数，按比例添加粘合剂、沸石粉制成颗粒剂，使活菌数不低于IXlO9CFU / g，然后装袋。
[0038]应用效果实施例说明:本发明以枯草芽孢杆菌DH1215保藏编号C6MCC1887、枯草芽孢杆菌DHH25保藏编号CGMCC8562为代表说明枯草芽孢杆菌的应用效果，但不是对本发明的限制。
[0039]应用效果实施例1:枯草芽孢杆菌在鲍鱼养殖中的应用
[0040]I材料与方法
[0041]1.1 材料
[0042]1.1.1试验产品
[0043]枯草芽孢杆菌活菌颗粒剂，活菌数均为I X IO9CFU / g以上。
[0044]1.1.2试验鲍鱼
[0045]将鲍鱼分为3组，每组90头，每组设3个重复。
[0046]1.2 方法
[0047]1.2.1试验时间为30天。
[0048]1.2.2该试验采取鲍鱼常规饲料喂养，试验组每天添加枯草芽孢杆菌活菌颗粒剂，保证水体浓度为IXlO7CFU / L以上，对照组不加试验产品。
·[0049]2试验结果
[0050]2.1对促进生长的影响
[0051]结果表明枯草芽孢杆菌CGMCC1887组、枯草芽孢杆菌CGMCC8562组与对照组相比，分别将体重量提高11.21 %、11.01 %，差别具有统计学意义(P〈0.05)，但试验组之间差异无统计学意义(P>0.05)。
[0052]2.2对增强免疫的影响
[0053]2.2.1对超氧化物歧化酶的影响
[0054]结果表明枯草芽孢杆菌CGMCC1887组、枯草芽孢杆菌CGMCC8562组与对照组相比，分别将超氧化物歧化酶的活性提高15.58%U6.02%,差别具有统计学意义(P〈0.05)，但试验组之间差异无统计学意义(P>0.05)。
[0055]2.2.2对溶菌酶的影响
[0056]结果表明枯草芽孢杆菌CGMCC1887组、枯草芽孢杆菌CGMCC8562组与对照组相比，分别将溶菌酶的活性提高9.58%、10.01%，差别具有统计学意义(P〈0.05)，但试验组之间差异无统计学意义(P>0.05)。
[0057]2.3死亡率
[0058]结果表明枯草芽孢杆菌CGMCC1887组、枯草芽孢杆菌CGMCC8562组死亡率均为0，低于对照组的3.04% (P〈0.05)，但试验组之间差异无统计学意义(P>0.05)。
[0059]2.4对饲料与体重比的影响
[0060]结果表明枯草芽孢杆菌CGMCC1887组、枯草芽孢杆菌CGMCC8562组料重比分别为
1.31、1.33，低于对照组的1.88(P〈0.05)，但试验组之间差异无统计学意义(P>0.05)。
[0061 ] 2.5对养殖水质的影响
[0062] 2.5.1 对 pH 的影响[0063]试验组的pH值在6.5~7.6之间变化，对照组pH值在6.1~7.9之间变化，试验组相比对照组变动幅度小，差异有统计学意义(p〈0.05)，但试验组之间差异无统计学意义(Ρ>0.05)。
[0064]2.5.2对亚硝酸盐、氨态氮的影响
[0065]各试验组亚硝酸盐、氨态氮低于对照组20% (Ρ〈0.05)，但试验组之间差异无统计学意义(ρ>0.05)。
[0066]3 结论
[0067]枯草芽孢杆菌能够提高鲍鱼体重量、超氧化物歧化酶活性、溶菌酶活性，并降低死亡率、料重比和改善水质，且试验组之间差异没有统计学意义，说明枯草芽孢杆菌具有促进鲍鱼的生长，提高鲍鱼免疫力，防治鲍鱼疾病，提高饲料转化率或净化养殖水质的作用。
[0068]应用效果实施例2:枯草芽孢杆菌在海参养殖中的应用
[0069]I材料与方法
[0070]1.1 材料
[0071]1.1.1试验产品
[0072]枯草芽孢杆菌活菌颗粒剂，活菌数均为I X IO9CFU / g以上。
[0073]1.1.2试验海参
[0074]将海参分 为3组，每组50头。
[0075]1.2 方法
[0076]1.2.1试验时间为30天。
[0077]1.2.2该试验采取海参常规饲料喂养，试验组每天添加枯草芽孢杆菌活菌颗粒剂，保证水体浓度为IXlO7CFU / L以上，对照组不加试验产品。
[0078]2试验结果
[0079]2.1对消化酶的影响
[0080]2.1.1对蛋白酶的影响
[0081]结果表明枯草芽孢杆菌CGMCC1887组、枯草芽孢杆菌CGMCC8562组与对照组相比，分别将蛋白酶的活性提高46.32%,45.56%，差别具有统计学意义(P〈0.05)，但试验组之间差异无统计学意义(P>0.05)。
[0082]2.1.2对淀粉酶的影响
[0083]结果表明枯草芽孢杆菌CGMCC1887组、枯草芽孢杆菌CGMCC8562组与对照组相比，分别将淀粉酶的活性提高32.51%,31.69%，差别具有统计学意义(P〈0.05)，但试验组之间差异无统计学意义(P>0.05)。
[0084]2.2对增强免疫的影响
[0085]2.2.1对超氧化物歧化酶的影响
[0086]结果表明枯草芽孢杆菌CGMCC1887组、枯草芽孢杆菌CGMCC8562组超氧化物歧化酶活性是与对照组的10.7倍和10.6倍，差别具有统计学意义(P〈0.05)，但试验组之间差异无统计学意义(P>0.05)。
[0087]2.2.2对溶菌酶的影响
[0088]结果表明枯草芽孢杆菌CGMCC1887组、枯草芽孢杆菌CGMCC8562组溶菌酶是对照组的5.5倍和5.3倍，差别具有统计学意义(P〈0.05)，但试验组之间差异无统计学意义(Ρ>0.05)。
[0089]2.3对日增重的影响
[0090]结果表明枯草芽孢杆菌CGMCC1887组、枯草芽孢杆菌CGMCC8562组与对照组相比，分别将日增重提高32%、31%，差别具有统计学意义(Ρ〈0.05)，但试验组之间差异无统计学意义(Ρ>0.05)。
[0091]2.4死亡率
[0092]结果表明枯草芽孢杆菌CGMCC1887组、枯草芽孢杆菌CGMCC8562组均为0，低于对照组的3.23% (Ρ〈0.05)，但试验组之间差异无统计学意义(Ρ>0.05)。
[0093]2.5对养殖水质的影响
[0094]2.5.1 对 pH 的影响
[0095]枯草芽孢杆菌CGMCC1887组、枯草芽孢杆菌CGMCC8562组的pH值在6.8~7.5之间变化，对照组PH值在6.2~7.9之间变化，试验组相比对照组变动幅度小，差异有统计学意义(P〈0.05),但试验组之间差异无统计学意义(P>0.05)。
[0096]2.5.2对亚硝酸盐、氨态氮的影响
[0097]各试验组亚硝酸盐、氨态氮低于对照组30% (P<0.05)，但试验组之间差异无统计学意义(p>0.05)。
[0098]3 结论
[0099]枯草芽孢杆菌能够提高海参日增重、消化酶活性、超氧化物歧化酶活性、溶菌酶活性，并降低死亡率和改善水质，且试验组之间差异没有统计学意义，说明枯草芽孢杆菌具有促进海参的生长，提高海参免疫力，防治海参疾病，提高饲料转化率或净化养殖水质的作用。
[0100]本发明在实施过程中所使用的微生物菌种已分别于2006年12月15日、2013年12月06日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所邮编100101)保藏，共2个下述微生物菌种，但本发明所述的枯草芽孢杆菌并不局限于这2微生物菌种。
[0101](I)分类命名:枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保存编号1887。
[0102](2)分类命名:枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保存编号8562。
[0103]上述2个微生物菌种经该微生物中心检测，检测结果均为存活。
【权利要求】
1.一种应用于鲍鱼、海参养殖的制剂，其特征在于该制剂由枯草芽孢杆菌制成。
2.按权利要求1所述应用，其特征在于促进鲍鱼、海参的生长，提高鲍鱼、海参免疫力，防治鲍鱼、海参疾病，提高饲料转化率或净化养殖水质。
3.按权利要求1所述制剂，其特征在于包括兽药、饲料添加剂或水质净化剂。
4.按权利要求1所述枯草芽孢杆菌，其特征在于枯草芽孢杆菌指活的生物个体。
5.按权利要求1所述枯草芽孢杆菌，其特征在于包括枯草芽孢杆菌DHH25保藏编号CGMCC8562。
6.按权利要求1所述枯草芽孢杆菌，其特征在于包括枯草芽孢杆菌DH1215保藏编号CGMCC1887。
7.按权利要求1所述微生态制剂，其特征在于固体制剂包含的总活菌数不低于I X IO6CFU / g，一般在 I X IO9CFU / g 以上，最高可达到 I X IO11CFU / g 或 IX IO11CFU / g以上；或液体制剂包含的总活菌数不能低于IXlO6CFU / mL，一般在I X IO9CFU / mL以上，最高可达到 IxIO11CFU / mL 或 I X` IO11CFU / mL 以上。
【文档编号】A61K35/74GK103845367SQ201410014889
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2014年1月3日
【发明者】崔云龙 申请人:青岛东海药业有限公司