一种从中药材中提取常用中药并用maldi-tof-ms鉴定的方法
【专利摘要】一种从中药材中提取常用中药并用MALDI-TOF-MS鉴定的方法，属于生物【技术领域】。本发明对中药材进行高速粉碎并提取了中药材总蛋白和多肽，透析除盐后用MALDI-TOF-MS检测得到了中药材蛋白质图谱。本发明应用简单的蛋白质提取技术结合Malditof鉴定了常用中药材黄芪、人参、甘草的蛋白质图谱，本发明方法具有简易、可靠的特点，为鉴定常用的中药材提供了选择和参考。
【专利说明】—种从中药材中提取常用中药并用MALD1-TOF-MS鉴定的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从中药材中提取常用中药并用MALD1-T0F-MS鉴定的方法，具体涉及一种应用Malditof鉴定常用中药材黄芪、人参、甘草的方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]中药材是中药饮片、中药提取物和中成药的原料，它的前端是药用植物、药用动物、药用矿物及其特定的药用部位，或者 称为中药材的基原。中药材的准确鉴定是中医药事业运行和发展的基本环节，一直备受关注。国家相关药材标准主要依据分类学研究将来源物种确认，限定了药用部位，基本澄清了混乱。然而，药材市场处于动态变化中，一些重要药物资源存在假冒伪劣现象，同时基原变化和新的药材类型不断出现，不同产地的中药材存在差异，鉴定研究工作仍不能松懈。
[0003]随着中药研究的深入以及科学技术的发展，目前已有几类用于鉴定中药材的新技术。第一类为化学鉴定技术。中药化学鉴定的物质基础是其所含的化学成分组。中药材所含成分复杂多样，化学鉴定通常选择少数具特征的化学成分，或者以化学成分的整体构成特点作为鉴定依据。随着色谱分离、分析技术的发展，HPLC，GC，HPCE等方法及与光谱联用技术的发展，可更精细和准确地反映中药材化学组分数和量等特征，成为中药材鉴定和质量控制的有效方法。第二类为分子鉴定技术。主要是针对DNA分子和蛋白质进行鉴定。基于序列分析的DNA条形码技术是目前影响较大、应用较广泛的DNA鉴定技术。与其他分子鉴定方法相比，DNA条形码鉴定具有三大优势:鉴定结果可重复性良好；方法通用性强；可构建统一数据库和鉴定平台，易于推广和标准化。
[0004]针对蛋白的鉴定技术主要有蛋白质电泳技术、ELISA检测技术、蛋白飞行时间质谱鉴定技术。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorptionionization-time of flight massspectrometry, MALD1-TOF-MS)技术是近年来发展起来的一种软电离新型有机质谱，通过引入基质分子，使待测分子不产生碎片，解决了非挥发性和热不稳定性生物大分子解吸离子化的问题。MALD1-T0F-MS具有灵敏度高、准确度高、分辨率高、图谱简明、质量范围广及速度快等特点，在测定多肽、蛋白质和合成高聚物应用方面有特殊的优越性。
[0005]目前MALD1-T0F-MS在微生物鉴定方面已经取得较为成功的应用，然而在中药材鉴定方面的应用还相对较少。中药材也有较多的蛋白质组分，相同品种的中药材在蛋白组成上既有一些保守性的成分也有受到产地等因素影响的不同成分。因此应用MALD1-T0F-MS收集不同中药材、相同品种不同产地的中药材的质谱图既可以对中药材进行评价又可以用于鉴定。本发明应用蛋白质提取技术结合样品处理方法应用MALD1-T0F-MS收集了常见中药材黄芪、甘草、人参的质谱图，为其鉴定提供了选择和参考。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是建立一种鉴定常用中药材黄芪、人参、甘草的方法，为鉴定常用的中药材提供了选择和参考。
[0007]本发明的技术方案，本发明对中药材进行高速粉碎并提取了中药材总蛋白和多肽，透析除盐后用MALD1-T0F-MS检测得到了中药材蛋白质图谱。
[0008]一种从中药材中提取常用中药的方法，步骤为:取中药材样品经过立式高速粉碎机粉碎，然后取4g粉末样品按照1:10的质量体积比例用含50mM NaCl, pH 8.0 25mMTris-HCl缓冲液溶解，50°C水浴浸提4h ;随后8000 rpm离心30min，取上清液，用15mL离心超滤管浓缩样品到体积为lmL，其截断分子量为3KD，样品用纯水透析2天，即得到中药材中常用中药的总蛋白和多肽。
[0009]所述常用中药为黄芪、人参或甘草。
[0010]所述从中药材中提取的常用中药用Malditof鉴定的方法，步骤为:将中药材中提取常用中药的总蛋白和多肽按照常规蛋白的上样方法上样，即取I μ L点在Malditof靶上，等其自然干燥后取I μ L TA基质液覆盖在样品上，自然干燥后上样检测，得到常用中药的图
[0011]本发明的有益效果:本发明提供的应用Malditof鉴定常用中药材黄芪、人参、甘草的方法，采用了高速粉碎方法对中药材进行处理并结合简单的溶液浸提方法提取了中药材的总蛋白和多肽，透析后即可用Malditof得到样品的蛋白质和多肽的图谱，进而实现对中药材的鉴定。与其它方法相比具有操作简单、分析时间短、方法通用性强的特点；与0嫩条形码技术类似可构建 统一数据库和鉴定平台，易于推广和标准化。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图l_a内蒙的黄芪的Malditof质谱图。
[0013]图Ι-b苏州的黄芪的Malditof质谱图。
[0014]图Ι-c甘肃的黄芪的Malditof质谱图。
[0015]图2-a内蒙的甘草的Malditof质谱图。
[0016]图2-b甘肃陇西甘草的Malditof质谱图。
[0017]图2-c新疆的甘草的Malditof质谱图。
[0018]图3_a东北生晒参的Malditof质谱图。
[0019]图3-b美国花旗参的Malditof质谱图。
【具体实施方式】
[0020]以下通过实施例进一步说明本发明。
[0021]实施例1 仪器:
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(ultrafle Xtreme MALD1-T0F-MS)，德国布鲁
克；
YS-04小型高速粉碎机，北京燕山正德机械设备有限公司；
70mm (MD77)透析袋，Cutoff 为 3KDa，USA ；
TGL-40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂；KFLOff纯水机，凯佛隆公司；
ZD-9556水平摇床，太仓科教器材厂；
可调试移液器，Thermo Labsystems公司；
涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂。
[0022]二、试剂:Tris base, Sigma-Aldrich ;其他试剂均为分析纯试剂。
[0023]三、步骤，以中药黄芪为例
1、中药材样品处理和蛋白质提取
取15g切片后的干燥黄芪，经过立式高速粉碎机粉碎。取4g粉末样品按照1:10的质量体积比例用含50mM NaCl.pH 8.0 25mM Tris-HCl缓冲液溶解，50°C水浴浸提4h。8000 rpm离心30min,取上清,用15mL离心超滤管(mi 11 ipore,截断分子量为3KDa)浓缩样品到体积为lmL。样品用纯水透析(截断分子量为3KD) 透析2天，除去盐离子，得黄芪的总蛋白和多肽。
[0024]2、Malditof鉴定常用中药材
将中药材中提取的常用中药的总蛋白和多肽按照常规蛋白的上样方法上样，即取I μ L点在Malditof靶上，等其自然干燥后取I μ L TA基质液覆盖在样品上，自然干燥后上样检测，得到常用中药的图谱。
[0025]按照上述步骤提总蛋白和多肽后用Malditof鉴定得到的内蒙、苏州及甘肃的黄芪的Malditof质谱图分别如图Ι-a、图l_b及图l_c所示；内蒙、甘肃陇西及新疆的甘草的Malditof质谱图如图2_a、图2_b及图2_c所示；东北及美国的人参的Malditof质谱图如图3_a及图3_b所不。
【权利要求】
1.一种从中药材中提取常用中药的方法，其特征在于步骤为:取中药材样品经过立式高速粉碎机粉碎，然后取4g粉末样品按照1:10的质量体积比例用含50mM NaCl, pH 8.025mM Tris-HCl缓冲液溶解，50°C水浴浸提4h ;随后8000 rpm离心30min，取上清液，用15mL离心超滤管浓缩样品到体积为lmL，其截断分子量为3KD，样品用纯水透析2天，即得到中药材中常用中药的总蛋白和多肽。
2.根据权利要求1所述从中药材中提取常用中药的方法，其特征在于:所述常用中药为黄芪、人参或甘草。
3.权利要求1所述方法从中药材中提取的常用中药用Malditof鉴定的方法，其特征在于步骤为:将中药材中提取常用中药的总蛋白和多肽按照常规蛋白的上样方法上样，即取I U L点在Malditof祀上,等其自然干燥后取I μ L TA基质液覆盖在样品上，自然干燥后上样检测，得到常用中药的图谱。
【文档编号】A61K38/00GK104000857SQ201410260787
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】马伟, 胥传来, 王文彬, 匡华, 徐丽广, 刘丽强, 宋珊珊, 吴晓玲 申请人:江南大学