一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取和干燥的改进方法
【专利摘要】本发明公开了一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取和干燥的改进方法，步骤包括：无水乙醇提取2-3次、无水乙醇与乙醚提取2-3次、三氯甲烷提取2-3次(加甲醇离心)、无水乙醇提取1-2次、旋转蒸发干燥。提取在20～24℃条件下进行、磁力搅拌7～18h。本发明有效去除了细胞壁中的脂类、色素、蛋白质等杂质，明显缩短了干燥时间，更加确保了产品甲醇、三氯甲烷残留符合要求。
【专利说明】一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取和干燥的改进方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物制药【技术领域】中红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取和干燥的 方法，指经酶解后的中间产品利用有机溶剂进行萃取、干燥，去除有机溶剂的工艺。
【背景技术】
[0002] 红色诺卡氏菌（Nocardia rubra)是具有免疫活性的微生物，经过细胞破碎、去除 细胞内容物和蛋白质及脂类等组份物质，得到其细胞壁骨架。这是一种含诺卡氏霉菌酸、中 性多糖以及粘肽的活性物质，可刺激细胞免疫功能，并促进多种细胞因子分泌，参与抗肿瘤 免疫过程，用于多种肿瘤的治疗或辅助治疗。以该细胞壁骨架为原料的药品已获准上市。
[0003] 目前国内对于红色诺卡氏菌细胞壁骨架的研究多为剂型及其治疗用途的拓展。本 发明则从红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取和干燥工艺着手，对其工艺进行了改进与创 新。现有技术中，溶媒提取工艺为："分别以乙醇-乙醚、氯仿和氯仿-甲醇提取16小时"。此 工艺所用三氯甲烷、甲醇为有害有机溶剂，在制品中的残留量将受到严格的控制（现行《中 国药典》第三部溶剂测定法规定：甲醇残留不高于〇. 3%，三氯甲烷残留不高于0. 006% )。 该工艺具有残留量不合格的风险。干燥工艺为："真空干燥箱抽真空干燥50小时"，该工艺 耗时长、效率低。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题，是提供一种既能充分有效地萃取并分离杂质、除去有 机溶剂和水分，能更加确保产品符合要求，又能节省时间、降低能耗的方法。
[0005] 本发明通过以下技术方案实现以上目的：
[0006] -种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取和干燥的改进方法，包括如下步骤：
[0007] (1)、将无水乙醇加入酶解后所得的红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片，搅拌7-18小 时，无水乙醇与细胞壁骨架碎片的比例为6?8 :1，离心，弃上清液，留沉淀碎片；
[0008] ⑵、按（1)步骤继续重复一遍；
[0009] (3)、将体积比1 :1的无水乙醇、无水乙醚加入沉淀碎片中搅拌7-18小时，无水乙 醇-乙醚混合液与细胞壁骨架碎片的比例为6?8 :1，离心，弃上清液，留沉淀碎片；
[0010] (4)、按（3)步骤继续重复一遍；
[0011] (5)、将三氯甲烷加入沉淀碎片中搅拌7-18小时，三氯甲烷与沉淀碎片的比例为 3?4 :1，加入甲醇进行离心，甲醇与碎片的比例为5?7 :1，弃上清液，留沉淀碎片；
[0012] (6)、按（5)步骤继续重复一遍；
[0013] (7)、将无水乙醇加入沉淀碎片中搅匀，搅拌7-18小时，无水乙醇与细胞壁骨架碎 片的比例为6?8:1，离心，弃上清液，留沉淀碎片，然后再加入无水乙醇溶解进行干燥，溶 解所用的无水乙醇与细胞壁骨架碎片的比例为2?3 :1。
[0014] (8)、将溶解后的碎片倒入旋转蒸发瓶并将旋转蒸发仪各管路连接好，水浴温度可 设为：50?70°C，启动真空泵，打开冷凝管的饮用水开关，当真空度彡0. 07MPa时，调节调速 开关，调速至60-80转/分，盖上防护罩，目视冷凝管不挂水滴时，计时2. 0?4. 0小时，至 目测产品干燥为止。
[0015] 其中，步骤⑴和⑵中的离心力，条件优选为2304?3600g，4?10°C，15? 25min〇
[0016] 其中，步骤（3)和⑷中的离心力，条件优选为2304?3600g，-10?-4Γ，15? 25min〇
[0017] 其中，步骤（5)、（6)和（7)中的离心力，条件优选为2304?3600g，4?10°C，15? 25min〇
[0018] 其中，步骤（1)-(7)所述的搅拌温度，条件优选为20?24°C。
[0019] 其中，步骤⑶中的旋转蒸发干燥，条件优选为水浴温度：50?70°C，真空度 彡0. 07MPa，转速：60-80转/分。更优选为水浴温度60°C，转速70转/分。
[0020] 本发明的有益效果：本发明改进了现有乙醇-乙醚、氯仿和氯仿-甲醇提取方法， 本发明整个提取过程中采用两次无水乙醇提取2-3次，无水乙醇与乙醚提取2-3次，三氯甲 烷提取2-3次（加甲醇离心），无水乙醇提取1-2次，可有效去除诺卡氏菌细胞壁中脂类、色 素和蛋白质类等杂质。并且，甲醇、氯仿等有机溶剂残留低。整个干燥过程采用旋转蒸发仪， 利用真空泵使蒸发瓶处于负压状态，蒸发瓶在旋转同时置于水浴锅中恒温加热，瓶内溶液 在负压下进行加热扩散蒸发，热蒸汽在冷凝管冷却作用下迅速液化，加快蒸发速率，从而达 到干燥的效果。本发明提高了提取效率，降低有机溶剂残留，有效去除了细胞壁中的脂类、 色素、蛋白质类等成分，同时有效减低了有机溶剂残留，其中甲醇残留比现行《中国药典》第 三部溶剂测定法标准低了 3倍以上，而三氯甲烷则更几无检出残留。本发还极大地缩短了 干燥时间，从以往真空干燥箱抽真空干燥改为水浴恒温旋转真空干燥，将干燥从50小时缩 至4小时，缩短了 12倍以上，极大地提高了干燥效率。此法提高了产品用药安全性，保证了 产品质量。（现行《中国药典》第三部溶剂测定法规定：甲醇残留不高于〇. 3%，三氯甲烷残 留不闻于0. 006% )。
【具体实施方式】
[0021 ] 实施例1至3酶解后所得的红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片，其酶解按《中国生物制 品规程》2000年版的"红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂制造及检定规程"进行。
[0022] 实施例1
[0023] 具体操作步骤：
[0024] 1.将无水乙醇加入酶解后所得的红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片，至22°C恒温下、 磁力搅拌15小时，离心：3136g，8°C，25min，弃上清液，留沉淀碎片。无水乙醇与红色诺卡氏 菌细胞壁骨架碎片的比例为8 :1。
[0025] 2.将无水乙醇加入酶解后所得的红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片，至22°C恒温下、 磁力搅拌7小时，离心：3136g，8°C，25min，弃上清液，留沉淀碎片。无水乙醇与红色诺卡氏 菌细胞壁骨架碎片的比例为8 :1。。
[0026] 3.将1 :1无水乙醇、无水乙醚加入沉淀碎片中搅匀，至22°C恒温下、磁力搅拌15 小时，离心：3136g，-4°C，25min，弃上清液，留沉淀碎片。乙醇-乙醚混合溶液与红色诺卡氏 菌细胞壁骨架碎片的比例为8 :1。
[0027] 4.将1 :1无水乙醇、无水乙醚加入沉淀碎片中搅勻，至22°C恒温下、磁力搅拌7小 时，离心：3136g，-4°C，25min，弃上清液，留沉淀碎片。乙醇-乙醚混合溶液与红色诺卡氏菌 细胞壁骨架碎片的比例为8 :1。
[0028] 5.将三氯甲烷加入沉淀碎片中搅匀，至22°C恒温下、磁力搅拌15小时，三氯甲烷 与沉淀碎片的比例为4 :1，加入甲醇进行离心：31368,81：，251^11，弃上清液，留沉淀碎片。 甲醇与沉淀碎片的比例为7:1。
[0029] 6.将三氯甲烷加入沉淀碎片中搅匀，至22°C恒温下、磁力搅拌7小时，三氯甲烷与 沉淀碎片的比例为4 :1，加入甲醇进行离心：3136g，8°C，25min，弃上清液，留沉淀碎片。甲 醇与沉淀碎片的比例为7 :1。
[0030] 7.将无水乙醇加入沉淀碎片中搅勻，至22°C恒温下、磁力搅拌15小时，离心： 3136g，8°C，25min，弃上清液，留沉淀碎片，无水乙醇与细胞壁骨架碎片的比例为8 : 1，然后 再加入无水乙醇溶解进行干燥。溶解用无水乙醇与细胞壁骨架碎片的比例为2 :1。
[0031] 8.将溶解后的碎片倒入旋转蒸发瓶并将旋转蒸发仪各管路连接好，水浴温度设 为：60°C，启动真空泵，打开冷凝管的饮用水开关，当真空度彡0.07MPa时，调节调速开关， 调速至70转/分，盖上防护罩，目视冷凝管不挂水滴时，计时3小时，至目测产品干燥为止。
[0032] 实施例2
[0033] 具体操作步骤：
[0034] 1.将无水乙醇加入酶解后所得的红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片，至22°C恒温下、 磁力搅拌17小时，离心：3136g，8°C，20min，弃上清液，留沉淀碎片。无水乙醇与红色诺卡氏 菌细胞壁骨架碎片的比例为7 :1。
[0035] 2.将无水乙醇加入酶解后所得的红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片，至22°C恒温下、 磁力搅拌8小时，离心：3136 8,81：，2〇1^11，弃上清液，留沉淀碎片。无水乙醇与红色诺卡氏 菌细胞壁骨架碎片的比例为7 :1。
[0036] 3.将1 :1无水乙醇、无水乙醚加入沉淀碎片中搅匀，至22°C恒温下、磁力搅拌15 小时，离心：3136g，-4°C，20min，弃上清液，留沉淀碎片。乙醇-乙醚混合溶液与红色诺卡氏 菌细胞壁骨架碎片的比例为7 :1。
[0037] 4.将1 :1无水乙醇、无水乙醚加入沉淀碎片中搅勻，至22°C恒温下、磁力搅拌7小 时，离心：3136g，-4°C，20min，弃上清液，留沉淀碎片。乙醇-乙醚混合溶液与红色诺卡氏菌 细胞壁骨架碎片的比例为7 :1。
[0038] 5.将1 :1无水乙醇、无水乙醚加入沉淀碎片中搅匀，至22°C恒温下、磁力搅拌15 小时，离心：3136g，-4°C，20min，弃上清液，留沉淀碎片。乙醇-乙醚混合溶液与红色诺卡氏 菌细胞壁骨架碎片的比例为7 :1。
[0039] 6.将三氯甲烷加入沉淀碎片中搅匀，至22°C恒温下、磁力搅拌7小时，三氯甲烷与 沉淀碎片的比例为7 :2,加入甲醇进行离心：3136g，8°C，20min，弃上清液，留沉淀碎片。甲 醇与沉淀碎片的比例为6 :1。
[0040] 7.将三氯甲烷加入沉淀碎片中搅匀，至22°C恒温下、磁力搅拌15小时，三氯甲烷 与沉淀碎片的比例为7 :2,加入甲醇进行离心：31368,81：，2〇1^11，弃上清液，留沉淀碎片。 甲醇与沉淀碎片的比例为6:1。
[0041] 8.将无水乙醇加入酶解后所得的红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片，至22°C恒温下、 磁力搅拌8小时，离心：3136g，8 °C，20min，弃上清液，留沉淀碎片。无水乙醇与红色诺卡氏 菌细胞壁骨架碎片的比例为7 :1。
[0042] 9.将无水乙醇加入沉淀碎片中搅勻，至22°C恒温下、磁力搅拌16小时，离心： 3136 8,81：，2〇1^11，弃上清液，留沉淀碎片，无水乙醇与细胞壁骨架碎片的比例为7:1，然后 再加入无水乙醇溶解进行干燥。溶解用无水乙醇与细胞壁骨架碎片的比例为5 :2。
[0043] 10.将溶解后的碎片倒入旋转蒸发瓶并将旋转蒸发仪各管路连接好，水浴温度设 为：60°C，启动真空泵，打开冷凝管的饮用水开关，当真空度彡0.07MPa时，调节调速开关， 调速至70转/分，盖上防护罩，目视冷凝管不挂水滴时，计时3. 5小时，至目测产品干燥为 止。
[0044] 实施例3
[0045] 具体操作步骤：
[0046] 1.将无水乙醇加入酶解后所得的红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片，至22°C恒温下、 磁力搅拌18小时，离心：3136 8,81：，151^11，弃上清液，留沉淀碎片。无水乙醇与红色诺卡氏 菌细胞壁骨架碎片的比例为6 :1。
[0047] 2.将无水乙醇加入酶解后所得的红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片，至22°C恒温下、 磁力搅拌7小时，离心：3136 8,81：，151^11，弃上清液，留沉淀碎片。无水乙醇与红色诺卡氏 菌细胞壁骨架碎片的比例为6 :1。
[0048] 3.将1 :1无水乙醇、无水乙醚加入沉淀碎片中搅匀，至22°C恒温下、磁力搅拌16 小时，离心：3136g，-4°C，15min，弃上清液，留沉淀碎片。乙醇-乙醚混合溶液与红色诺卡氏 菌细胞壁骨架碎片的比例为6 :1。
[0049] 4.将1 :1无水乙醇、无水乙醚加入沉淀碎片中搅匀，至22°C恒温下、磁力搅拌7小 时，离心：3136g，-4°C，15min，弃上清液，留沉淀碎片。乙醇-乙醚混合溶液与红色诺卡氏菌 细胞壁骨架碎片的比例为6 :1。
[0050] 5.将1 :1无水乙醇、无水乙醚加入沉淀碎片中搅匀，至22°C恒温下、磁力搅拌16 小时，离心：3136g，-4°C，15min，弃上清液，留沉淀碎片。乙醇-乙醚混合溶液与红色诺卡氏 菌细胞壁骨架碎片的比例为6 :1。
[0051] 6.将三氯甲烷加入沉淀碎片中搅匀，至22°C恒温下、磁力搅拌7小时，三氯甲烷与 沉淀碎片的比例为3 :1，加入甲醇进行离心：3136g，8°C，15min，弃上清液，留沉淀碎片。甲 醇与沉淀碎片的比例为5 :1。
[0052] 7.将三氯甲烷加入沉淀碎片中搅匀，至22°C恒温下、磁力搅拌16小时，三氯甲烷 与沉淀碎片的比例为3 :1，加入甲醇进行离心：31368,81：，151^11，弃上清液，留沉淀碎片。 甲醇与沉淀碎片的比例为5:1。
[0053] 8.将三氯甲烷加入沉淀碎片中搅匀，至22°C恒温下、磁力搅拌7小时，三氯甲烷与 沉淀碎片的比例为3 :1，加入甲醇进行离心：31368,8°〇，151^11，弃上清液，留沉淀碎片。甲 醇与沉淀碎片的比例为5 :1。
[0054] 9.将无水乙醇加入沉淀碎片中搅勻，至22°C恒温下、磁力搅拌16小时，离心： 3136 8,81：，151^11，弃上清液，留沉淀碎片，无水乙醇与细胞壁骨架碎片的比例为6:1，然后 再加入无水乙醇溶解进行干燥。溶解用无水乙醇与细胞壁骨架碎片的比例为3 :1。
[0055] 10.将溶解后的碎片倒入旋转蒸发瓶并将旋转蒸发仪各管路连接好，水浴温度设
【权利要求】
1. 一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取和干燥的改进方法，包括如下步骤： (1) 将无水乙醇加入酶解后所得的红色诺卡氏菌细胞壁骨架碎片，搅拌7-18小时，无 水乙醇与细胞壁骨架碎片的比例为6?8 :1，离心，弃上清液，留沉淀碎片； (2) 按（1)步骤继续重复1-2遍； (3) 将体积比1 :1的无水乙醇、无水乙醚加入沉淀碎片中搅拌7-18小时，无水乙醇-乙 醚混合液与细胞壁骨架碎片的比例为6?8 :1，离心，弃上清液，留沉淀碎片； (4) 按（3)步骤继续重复1-2遍； (5) 将三氯甲烷加入沉淀碎片中搅拌7-18小时，三氯甲烷与沉淀碎片的比例为3?4 : 1，加入甲醇进行离心，甲醇与碎片的比例为5?7 :1，弃上清液，留沉淀碎片； (6) 按（5)步骤继续重复1-2遍； (7) 将无水乙醇加入沉淀碎片中搅匀，搅拌7-18小时，无水乙醇与细胞壁骨架碎片的 比例为6?8 :1，离心，弃上清液，留沉淀碎片，然后再加入无水乙醇溶解进行干燥，溶解所 用的无水乙醇与细胞壁骨架碎片的比例为2?3 :1 ; (8) 将溶解后的碎片倒入旋转蒸发瓶，并将旋转蒸发仪各管路连接好，水浴温度设 为：50?70°C，启动真空泵，打开冷凝管的饮用水开关，当真空度彡0. 07MPa时，调节调速开 关，调速至60-80转/分，盖上防护罩，目视冷凝管不挂水滴时，计时2. 0?4. 0小时，至目 测产品干燥为止。
2. 如权利要求1所述的一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取和干燥的改进方法，其 特征在于：步骤（1)和（2)中的离心，离心力2304?3600g，4?10°C，15?25min。
3. 如权利要求1所述的一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架的溶媒提取和干燥的改进方法， 其特征在于：步骤（3)和（4)中的离心，离心力2304?3600g，-10°C?_4°C，15?25min。
4. 如权利要求1所述的一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取和干燥的改进方法，其 特征在于：步骤（5)、（6)和（7)中的离心，离心力2304?3600g，4?10°C，15?25min。
5. 如权利要求1至4任一项所述的一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架溶媒提取和干燥的改 进方法，其特征在于： 步骤⑴-⑵所述的搅拌，温度为：20?24°C。
6. 如权利要求5所述的一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架的溶媒提取和干燥的改进方法， 其特征在于：步骤（1)-(7)所述的搅拌，温度为22°C。
7. 如权利要求1所述的一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架的溶媒提取和干燥的改进方法， 其特征在于：步骤（8)中的旋转蒸发干燥，条件为水浴温度：50?70°C，真空度彡0. 07MPa， 转速：60-80转/分。
8. 如权利要求7所述的一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架的溶媒提取和干燥的改进方法， 其特征在于：步骤（8)中的旋转蒸发干燥，条件为水浴温度：60°C，真空度<0.07MPa，转速： 70转/分。
【文档编号】A61P37/04GK104107195SQ201410275364
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年6月19日 优先权日:2014年6月19日
【发明者】徐镜, 林晓光, 查贝贝, 谢必峰, 黄春玉, 邵恩文 申请人:福建省山河药业有限公司