一种香灰菌不产黑色素的培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于真菌培养技术领域，涉及一种香灰菌不产黑色素的培养基。
【背景技术】
[0002] 香灰菌（历sp.)是银耳的伴生菌能够与银耳发生互生作用，在银耳生产 栽培过程中银耳几乎不具备降解木质素、纤维素的能力，银耳菌丝单独培养时生长缓慢且 极易变黄、胶质化并转化为节孢子，只有当香灰菌和银耳生活在一起时才能结耳。香灰菌和 银耳互作程中香灰菌能够有效分解基质为银耳生长提供必需的营养成分以帮助其完成其 生活史，因此香灰菌生长发育好坏直接影响银耳产量和质量。在现代银耳生产栽培中香灰 菌对基质的分解能力直接影响到银耳的生长发育。香灰菌菌丝在生长到一定阶段还会有大 量黑色素生成，这对帮助银耳提高其生存竞争能力具有非常重要的意义。银耳生产栽培中 香灰菌菌丝生长中途停止及菌种退化等都将影响银耳子实体生长发育而导致银耳严重减 产。由于不同条件下香灰菌形态发育及黑色素产量差异很大，香灰菌菌丝生长及黑色素的 产生在银耳生产中起着非常重要的作用，但目前关于香灰菌产生的黑色素对银耳菌丝生长 及香灰菌与银耳之间的伴生关系的影响尚不明确。该条件不影响香灰菌菌丝生长速度及其 形态，不产生黑色素，这将为香灰菌黑色素在银耳菌丝生长及其生产中的作用研究奠定基 础。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种香灰菌不产黑色素的培养基，解决了银耳与香灰菌共 同培养过程有大量黑色素生成，这对帮助阐明香灰菌与银耳互作过程中黑色素的作用有非 常重要的意义。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 所述的培养基为每升培养基中葡萄糖〇. 5g，硝酸铵5g，KH2P04 0 . 2g，MgS04. 7H20 0.lg，CaCl2 0.Olg，pH4. 4、0. 02mol/L醋酸钠缓冲液100mL。在以上培养基中添加质量分数为2% 的琼脂。
[0005] -种香灰菌不产黑色素的培养基在香灰菌与银耳互作研究中的应用。
[0006] 本发明的优点在于：培养基配方成本低、成份明确，不影响香灰菌菌丝生长； 消除香灰菌黑色素对液体培养的银耳菌丝分离干扰； 首次提供香灰菌不产黑色素的培养基，这对帮助阐明香灰菌与银耳互作过程中黑色素 的作用有非常重要的意义。
【附图说明】
[0007] 图1不同营养成分培养基菌丝形态特征，左：正面，右：背面，A:高氮低碳培养基； B:完全培养基；C:高无机盐培养基；D:三低培养基；E:低氮培养基；F:吐温20培养基。
[0008] 图2不同培养基菌丝生长速度。
[0009] 图3不同营养条件下黑色素产量，*P< 0? 05; **P< 0? 01;ns,P>0. 05。
【具体实施方式】 [0010] 1材料与方法 1. 1供试菌株： 香灰菌（Hypoxylonsp.)，为福建省古田县恒春农业发展有限公司提供。
[0011] 供试培养基： 完全培养基：葡萄糖 20g/L，酵母粉 3g/L，蛋白胨 3g/L，KH2P041. 5g/L，MgS04 7H201. 5g/L,VBiO.lg/L； 低氮培养基：葡萄糖l〇g/L，硝酸铵 0? 2g/L，KH2P040 . 2g/L，MgS04 7H20 0?lg/L，CaCl20. 01g/L，VBW. 001g/L，0. 02mol/L醋酸钠缓冲液（pH4. 4)lOOmL; 吐温 20 培养基：葡萄糖 10g/L，硝酸铵 0. 2g/L，KH2P040 . 2g/L，MgS04 7H20 0.lg/L，CaCl20. 01g/L，VBW. 001g/L，0. 02mol/L醋酸钠缓冲液（pH4. 4) 100mL，吐温 20 1.Og/L; 高氮低碳培养基：葡萄糖 〇. 5g/L，硝酸铵 5g/L，KH2P040 . 2g/L，MgS04 7H20 0.lg/L，CaCl20. 01g/L，VB! 0? 001g/L，0. 02mol/L醋酸钠缓冲液（pH4. 4)lOOmL; 高无机盐培养基：葡萄糖l〇g/L，硝酸铵 0. 2g/L，KH2P042g/L，MgS04 7H20 1. 0g/L，CaCl20.lg/L，VBi0? 001g/L，0. 02mol/L醋酸钠缓冲液（pH4. 4)lOOmL; 低氮低碳低无机盐培养基(三低培养基):葡萄糖〇. 5g/L，硝酸铵0. 2g/L，KH2P040 . 2g/L，MgS04 7H20 0?lg/L，CaCl2 0? 01g/L，VBW. 001g/L，0? 02mol/L、pH4. 4 醋酸钠缓冲液 100mL; 加富培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨3g/L，KH2P041. 5g/L，MgS04 7H201. 5g/L，VBAlg/L，琼脂 20g/L，pH自然； 固体培养基；在以上液体培养基中添加2%琼脂； 1. 3方法 1. 3. 1菌株生长速度测定、菌丝形态及黑色素产生情况观察实验：将供试菌株接种在 加富PDA平板上，24°C培养，用打孔器打孔菌龄相同的1. 0cm菌块分别接种于完全培养基、 低氮培养基、高氮低碳培养基、高无机盐培养基、低氮低碳低无机盐培养基、吐温20培养基 平板(直径90mm)，每种培养基平板接一个菌块（d=l. 0cm)，设置3个重复，置于24°C恒温培 养箱中培养，每天测定菌丝生长速度，并观察菌落形态及黑色素产生情况(郭艳艳等2014)。
[0012] 黑色素的提取实验：用打孔器打孔菌龄相同的1. 0cm菌块分别接种于装有100mL 液体完全培养基、低氮培养基、高氮低碳培养基、高无机盐培养基、低氮低碳低无机盐培养 基、吐温20培养基的250mL三角瓶中，每种培养基接种10片菌块（d=l. 0cm)，每种培养基设 置3个重复，24°C，120r/min摇瓶培养7d;过滤除菌丝，滤液用6mol/LHC1酸化至pH值为 1. 5,4°C静置过夜。10000r/min离心15min，取沉淀，用去离子水冲洗沉淀至pH为中性后再 10000r/min离心15min，取沉淀常温真空干燥，得香灰菌黑色素粗品（Savaetal.2001 ; Harkietal. 1997)。
[0013] 结果与分析 2. 1不同培养基对菌丝生长、黑色素的影响 2. 1. 1不同培养基对菌株生长、黑色素产生的影响：菌株在不同培养基上的生长速度 和菌丝形态差异较大，在完全培养基上生长速度最快且菌丝健壮致密，菌丝背面因为黑色 素的产生明显变黑；在高氮低碳培养基上生长速度较快，但菌丝纤细稀疏、洁白，菌丝背面 由于没有黑色素产生不会变黑；在低氮低碳低无机盐培养基上生长速度较慢，没有黑色素 产生，菌丝洁白，纤细稀疏；在高无机盐培养基、低氮培养基和吐温20培养基上的生长速度 最慢，菌丝致密，菌丝显淡黄色，同时菌丝背面因大量黑色素的产生而变黑。综上说明：培养 基中氮源和碳源对香灰菌菌丝的生长发育有很大的影响，培养基中合适的碳氮比和无机盐 含量能提高菌丝活力促进菌丝生长；较高无机盐含量和吐温20对菌丝的影响非常明显，能 够抑制菌丝的生长（图1，2 ;表1)。
[0014] 表1不同营养成分培养基菌丝形态特征
注：++++表不程度尚；+++表不程度较尚；++表不程度低；+表不程度很低. 2. 1. 2不同培养基对黑色素产量的影响：菌株在6种不同液体培养基中黑色素产量 差异明显，其在完全培养基上黑色素产量最高为0. 42g/L，在低氮培养基上次之，产量为 0. 34g/L，在高无机盐培养基和吐温20培养基上产量较低，分别为0. 1lg/L和0. 03g/L，而在 高氮低碳培养基和三低培养基上不产黑色素（图3)。与菌株在相应固体培养基上生长时产 黑色素情况相一致。培养基中合适的营养配比是菌丝生长和黑色素产生的必要条件，碳源 不足时完全抑制了黑色素的产生，氮源对菌株黑色素生产影响不大。
[0015] 综上研究表明在高氮低碳培养基(葡萄糖0. 5g/L，硝酸铵5g/L，KH2P040. 2g/ L，MgS04. 7H20 0?lg/L，CaC120. 01g/L，VB1 0? 001g/L，0? 02mol/L醋酸钠缓冲液（pH4. 4) lOOmL;)中香灰菌不产黑色素，同时不影响菌丝生长速度及菌丝形态。
[0016] 该发明通过研究不同培养条件下香灰菌菌丝的生长速度、菌丝形态及产黑色素特 性，获得了一种抑制香灰菌产黑色素的培养基，条件为：每升培养基中葡萄糖0. 5g，硝酸铵 5g，KH2P04 0? 2g，MgS04. 7H20 0?lg，CaCl2 0? 01g，0? 02mol/L醋酸钠缓冲液（pH4. 4) 100mL。 此条件下香灰菌不产黑色素。
[0017] 目前尚未见通过相关研究报道，该条件的获得为银耳生产栽培中通过培养条件调 节香灰菌菌丝生长速度、菌丝形态及黑色素的产生提供重要的理论依据，同时为今后关于 香灰菌与银耳相互作用关系中黑色素是否影响银耳生长发育的研究奠定基础。
[0018] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 一种香灰菌不产黑色素的培养基，其特征在于：所述的培养基为每升培养基中葡萄 糖 〇? 5g，硝酸铵 5g，KH2PO4 0? 2g，MgSO4. 7H20 0? lg，CaCl2 〇? Olg，pH4. 4、0. 02mol/L 醋酸钠 缓冲液l〇〇mL。2. 根据权利要求1所述的一种香灰菌不产黑色素的培养基，其特征在于：在以上培养 基中添加质量分数为2%的琼脂。3. 如权利要求1所述的一种香灰菌不产黑色素的培养基在香灰菌与银耳互作研究中 的应用。
【专利摘要】本发明属于真菌培养技术领域，涉及一种香灰菌不产黑色素的培养基，所述的培养基为每升培养基中葡萄糖0.5g，硝酸铵5g，KH2PO4？0.2g，MgSO4.7H2O？0.1g，CaCl2？0.01g，pH4.4、0.02mol/L醋酸钠缓冲液100mL，此条件下香灰菌不产黑色素。目前尚未见通过相关研究报道，该条件的获得为银耳生产栽培中通过培养条件保证香灰菌菌丝生长速度、菌丝形态及调节黑色素的产生提供重要的理论依据，同时为今后关于香灰菌与银耳相互作用关系中黑色素是否影响银耳生长发育的研究奠定基础。
【IPC分类】C12N1/14, C12Q1/02
【公开号】CN105112297
【申请号】CN201510472952
【发明人】孙淑静, 冯宏昌, 单书凯, 陈文星, 赖春芬, 胡开辉
【申请人】福建农林大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月5日