专利名称：红色奴卡氏放线菌细胞壁骨架用于治疗肝脏疾病的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种红色奴卡氏放线菌细胞壁骨架的医药新用途，即治疗肝脏疾病的新用途。
背景技术：
红色奴卡氏放线菌(Nocardia rubra)是自土壤分离的一种放线菌，分类学上属于细菌域，厚壁菌门，放线菌纲，奴卡氏菌属。
目前国内已有研究者从该菌中分离制备得到一种天然混合产物——红色奴卡氏菌细胞壁骨架(Nocardia rubra cell wall skeleton，简称N-CWS)，也称红色诺卡氏菌细胞壁骨架。主要成分为类脂化合物(枝菌酸17.1％)、多糖(阿拉伯半乳聚糖46.3％)和粘肽(主要为丙氨酸、谷氨酸、二氨基庚二酸、葡萄糖胺和胞壁酸)等(Zhang ZL，Lin S，Tang WL，et al.Studies on thephysico-chemical properties，composition and content determination of Nocardia rubra cell wallskeleton[J].J China Antibiotic，2002，27(9)532-534)。临床上已用于治疗体外炎症、妇科疾病、疱疹病毒引起的感染的临床治疗药物。目前，国内外学者已通过荷瘤小鼠整体动物模型，验证了N-CWS具有显著预防和抑制肿瘤增生，并治疗癌性并发症(癌性胸水、癌性腹水)的作用，包括膀胱癌、乳腺癌、肺癌，辅助治疗恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤、晚期胃癌和食道癌等。除此之外，目前未见有关于N-CWS其它药效作用的报导。
近年来，各种慢性肝炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎以及因肥胖导致的脂肪肝呈明显上升趋势，肝脏疾病已成为严重危害人类身体健康的重大疾病之一，但是，市场上尚未见有特效低毒的各类抗肝炎药物，发现更多肝脏类疾病的治疗新药已成为药物研究领域的重点之一。
发明内容
本发明公开了红色奴卡氏放线菌细胞壁骨架(以下简称N-CWS)的治疗新用途，即其可以用于治疗肝脏疾病，所述肝脏疾病包括慢性肝损伤、肝纤维化、急性肝损伤、化学性肝损伤、肝炎等，也可用于护肝。
本发明的N-CWS在治疗肝脏疾病时可以将其制备成药剂学上常规的剂型，通过所属领域技术人员所熟知的给药方式来进行给药，例如口服、直肠、舌下、肺部、透皮、离子透入、阴道及鼻内给药。优选的给药方式是口服。给药剂量根据制剂形式和期望的作用时间以及治疗对象的情况而有所变化，实际治疗所需的量可以由医师根据实际情况(如，病人的病情、体重等)而方便地确定。对于一般的成人，每日需要给药5-600mg的量。
本发明的N-CWS可以由固体发酵制备得到，具体制备方法已有文献报道，一般的方法如下1、菌种保存斜面保存法配制固体培养基(0.5％牛肉膏，1％蛋白胨，0.5％氯化钠，0.03％Na2HPO4.12H2O，1％甘油，1.6％琼脂；以10％碳酸钠调pH值至7.2)，121℃灭菌后制成斜面培养基。以接种环从平板中挑取活化单菌落，斜面划线接种，31℃培养120h后，4℃保藏。
2、发酵固体培养基牛肉膏0.5％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％、0.03％Na2HPO4.12H2O、甘油1％、蒸馏水配制；10％碳酸钠调节pH值至7.5；121℃灭菌后，铺平板备用。
接种与发酵用无菌蒸馏水或液体培养基洗脱斜面菌种保藏管中的菌体，吹打均匀后制成一定浓度的菌悬液，按照一定的量涂布法涂布于直径15cm的平板上，31℃倒置培养120h。
菌体收集将长出的菌苔用接种铲轻轻刮下，然后用一定体积的PBS缓冲液制成菌悬液，4℃下5000rpm离心5min，收集菌体后称重备用。
3、N-CWS的制备与理化性质分析将发酵获得的菌体重悬于10倍体积PBS溶液，冰浴条件下间歇法超声破碎菌体，调节频率和功率，避免发生泡沫，使裂解尽快完成。
裂解产物于4℃，10000g离心15min，取上清，适量DNase和RNase处理1h以消化菌体中的核酸，然后加入终浓度为1％TritonX-100处理24h，再用适量的胰蛋白酶和链蛋白酶处理12h，最后以正丙醇、无水乙醇/冰乙酸(1∶1)分别处理2h，蒸馏水洗涤三次后即得到白色的N-CWS，60℃烘干后称重。
将收集获得的N-CWS配置成一定浓度混悬液，0.07Mpa下灭菌15min，4℃保存。
N-CWS无嗅无味，呈白色粉末状，不溶于水、乙醇、二甲亚砜、醚等试剂。
图1.N-CWS处理对ALT的动态变化影响图2.N-CWS处理对AST的动态变化影响图3小鼠肝组织的病理学变化(HE染色，×20)，A为正常小鼠肝组织，B为100mg/kg联苯双酯处理组，C为模型组，D、E、F分别为150、15和1.5mg/kg N-CWS处理组(n＝10)图4.N-CWS对四氯化碳诱导的肝纤维大鼠血清AST的影响图5.N-CWS对四氯化碳诱导的肝纤维大鼠血清ALT的影响图6不同处理组大鼠肝组织的病理变化(HE染色，×400)A为正常组，B为模型组，C为阳性对照组，D为40mg/kgN-CWS高剂量组)，E为8mg/kgN-CWS中剂量组，F为1.6mg/kgN-CWS低剂量组为了便于理解，以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。
具体实施例方式
实施例1N-CWS对CCl4所致急性肝损伤小鼠的保护作用1、药物剂量高剂量组的剂量为150mg/kg，配制浓度7.5mg/ml，灌胃0.2ml/10g；中剂量组为15mg/kg，配制浓度0.75mg/ml，灌胃0.2ml/10g；低剂量组为1.5mg/kg，配制浓度0.075mg/ml，灌胃0.2ml/10g。
试验对照空白对照用生理盐水，按与给药组等体积灌胃口服。
阳性对照药为联苯双酯滴丸剂(1.5mg/粒)，北京协和药厂生产。临用时根据需要加入蒸馏水溶解混悬均匀，4℃保存备用。根据临床用量和动物耐受容量，设计动物实验剂量小鼠剂量100mg/kg，配制浓度5mg/ml，灌胃0.2ml/10g。
2、实验动物健康昆明种小鼠，全雄，体重20±2g，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场。
3、其他实验材料四氯化碳，分析纯，南京化学试剂一厂生产。甲醛溶液，分析纯，南京化学试剂一厂生产。鲁花牌纯正花生油，莱阳鲁花浓香花生油有限公司。氯化钠注射液，金陵药业浙江天峰制药厂生产。转氨酶活性测定试剂盒为南京建成生物技术有限公司产品，批号为20040518。
4、实验方法
4.1 N-CWS对四氯化碳所致急性肝损伤模型小鼠的保护作用将90只昆明种小鼠按体重随机分为六组，每组15只，即正常对照组(Control)、模型组(Model)、阳性药对照组(Bifendate，p.o 100mg/kg)和N-CWS高、中、低剂量组(p.o，剂量分别为150、15和1.5mg/kg)。给药体积为0.2ml/10g，正常组和模型组分别给予等体积生理盐水。
造模前24h开始灌胃给药，每日早晚各给药一次，连续给药4日，第2d给药后1h，除正常对照组外，其余各组用0.2％的CCl4花生油溶液0.2ml/10g腹腔注射，建立小鼠急性肝损伤模型。48h后小鼠眼眶取血，3000rpm离心10min分离血清以改良赖氏法测定血清转氨酶；断头处死动物，取肝脏左叶以10％甲醛固定，石蜡包埋，HE染色后进行病理学观察。
4.2 血清转氨酶动态变化实验取130只昆明种小鼠按体重随机分为四组，即正常对照组(Control，n＝10)、模型组(Model，n＝40)、联苯双酯阳性对照组(Bifendate，p.o 100mg/kg，n＝40)和N-CWS高剂量组(p.o 150mg/kg，n＝40)。给药体积为0.2ml/10g，正常组和模型组给予等体积生理盐水。
除正常对照组外，其余各组用0.2％的CCl4花生油溶液0.2ml/10g腹腔注射，建立小鼠急性肝损伤模型。造模后1h开始灌胃给药，每隔12h给药一次，分别在造模后第8h、24h、48h、72h从模型组、阳性对照组、给药组各取10只小鼠，眼眶取血，3,000rpm离心10min，取血清测定转氨酶水平。正常组小鼠只设一个时间点(Oh)如上操作。
5、结果5.1 N-CWS对CCl4致急性肝损伤小鼠血清转氨酶活性的影响N-CWS可明显抑制CCl4诱导的小鼠血清转氨酶活性的异常升高，并呈现出明显的量效关系(见表1)。与阳性药物联苯双酯相比，15mg/kg的N-CWS对转氨酶活性的抑制作用与100mg/kg的药效相当，但剂量仅为前者的15％。
表1.N-CWS对CCl4诱导的急性肝损伤小鼠血清转氨酶活性的影响
*P＜0.05，**P＜0.01 compared with Model group，ΔΔP＜0.01 compared with Normal group.
鉴于由CCl4诱导的血清转氨酶活性在后期恢复，观察了造模后不同时间中小鼠血清转氨酶活性的动态变化(见图1和图2)，结果显示模型组小鼠血清转氨酶活性在72h内恢复正常，150mg/kg的N-CWS与阳性药物对照组对血清转氨酶活性的影响趋势是相近的，它们均可降低整个过程中(0～72h)转氨酶的活性，前者的效果尤为显著。
5.2 N-CWS对小鼠肝脏组织学变化的影响通过石蜡切片观察了肝脏组织的病理变化(图3)，结果显示与正常对照组相比，模型组小鼠肝小叶的中央静脉周围肝细胞明显肿胀，胞浆疏松化，汇管区可见大量中性粒细胞浸润；肝窦扩张充血，部分病例可见肝细胞点状坏死，肝细胞脂肪变性。而150mg/kg和15mg/kg的N-CWS处理后，肝小叶结构清楚，肝细胞虽有轻度水肿，但无坏死现象；在肝脏的汇管区仅见少量中性粒细胞浸润，病变程度远较模型组为轻，并能阻止由于CCl4引起的肝细胞肿胀，胞浆疏松化，脂肪变性，最终至点状坏死的病变过程，保护肝脏组织结构受损；结果同时显示，150mg/kg的N-CWS处理后，肝细胞发生有丝分裂，肝细胞分化与增殖较濒繁，肝再生旺盛。
实施例2N-CWS对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化的保护作用1、受试药物药物剂量高剂量组为40mg/kg，配制浓度2mg/ml，p.o 0.2ml/10g；中剂量组为8mg/kg，配制浓度0.4mg/ml，p.o 0.2ml/10g；低剂量组为1.6mg/kg，配制浓度0.08mg/ml，p.o 0.2ml/10g。
实验对照空白对照用生理盐水，按与给药组等体积灌胃口服。
阳性对照马洛替酯为山西亚宝药业集团股份有限公司产品。临用时根据需要加入蒸馏水溶解混悬均匀，4℃保存备用。
2、实验动物SD大鼠，全雄，体重150-180g，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场。
3、其他实验材料四氯化碳，分析纯，南京化学试剂一厂生产。甲醛溶液，分析纯，南京化学试剂一厂生产。鲁花牌纯正花生油，莱阳鲁花浓香花生油有限公司。氯化钠注射液，金陵药业浙江天峰制药厂生产。转氨酶活性、肝脏羟脯氨酸、血清A/G比检测试剂盒为南京建成生物技术有限公司产品，批号为20050318。
4.实验方法将120只SD大鼠按体重随机分为六组，每组20只，即正常对照组(Control)、模型组(Model)、阳性对照组(Bifendate，p.o 50mg/kg)和N-CWS高、中、低剂量组(p.o，剂量分别为40、8和1.6mg/kg)。
每周一、四上午除正常对照组外，其余各组以20％CCl4花生油溶液2.5ml/kg腹腔注射，建立大鼠肝纤维化模型；每周一至周六下午灌胃给药，给药体积2.5ml/kg，每日给药一次，正常组和模型组给予等体积生理盐水，实验总周期为10周。
末次给药12h后大鼠眼眶取血，血清采用改良法赖氏法测定ALT和AST活性。断头处死动物，肝脏左叶以10％甲醛固定，石蜡包埋，HE染色后进行病理学检测；中叶于液氮中速冻后置于-80℃保存，进行肝脏羟脯氨酸，血清白蛋白与球蛋白比值(A/G)等相关生化指标的检测。
5、结果5.1 血清转氨酶活性变化利用CCl4诱导的肝纤维化损伤动物模型评价了N-CWS对抗肝纤维化的药效作用，结果表明高、中、低不同剂量(40mg/kg、8mg/kg和1.6mg/kg)的N-CWS均表现出显著降低CCl4所致血清转氨酶ALT和AST病态升高的活性，且呈现明显的量效关系(图4和图5)，其中1.6mg/kg剂量组的N-CWS对肝损伤保护作用的药效与阳性药物马洛替酯的作用相当，但给药剂量仅为后者的3.2％。
5.2 肝组织的病理变化对不同处理组的大鼠肝组织病理变化情况进行分析(图6)与正常对照组相比，模型组大鼠肝细胞发生较明显的脂肪变性，细胞肿胀严重，汇管区可见明显的炎细胞浸润，纤维结缔组织中度生成，肝纤维化形成。而40mg/kg的N-CWS处理后，肝小叶结构清楚；在肝脏的汇管区仅见少量中性粒细胞浸润，仅有一例标本可见肝细胞肿胀，脂肪变性，病变程度远较模型组为轻。8mg/kg和1.6mg/kg的N-CWS处理后，大鼠肝脏内炎症细胞浸润和肝细胞脂肪变性均较严重，但未见较明显的纤维结缔组织增生，肝纤维化并未形成。
5.3 血清中白蛋白与球蛋白的比值利用CCl4诱导的肝纤维化损伤动物模型评价N-CWS对抗肝纤维化的药效作用，结果表明各剂量组N-CWS均可较显著逆转CCl4引起血清A/G比值的降低，且药效呈现较明显的量效关系(表2)。
表2 N-CWS对CCl4诱导的肝纤维化大鼠血清中A/G比值的影响
*P＜0.05 compared with Model group，**P＜0.05compared with Normal group.
5.4 肝脏组织中羟脯氨酸含量(HYP)的变化利用CCl4诱导的肝纤维化损伤动物模型评价了N-CWS对抗肝纤维化的药效作用，结果表明40mg/kg、8mg/kg和1.6mg/kg剂量组的N-CWS可较显著逆转CCl4引起的肝脏羟脯氨酸含量的增高，三个剂量组N-CWS的药效呈现较明显的量效关系(表3)。
表3 N-CWS对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝组织中羟脯氨酸含量的影响
*P＜0.05 compared with Model group，**P＜0.05compared with Normal group.
6、讨论血清转氨酶(ALT和AST)被认为是反映肝损伤的敏感指标，并被作为肝功能的评价指标广泛应用于肝病的临床诊断过程。ALT位于肝细胞胞浆内，AST则主要分布于肝细胞线粒体内，少部分位于胞浆。肝受损较轻时，细胞膜通透性增加，胞浆内ALT和AST释放进入血液，而线粒体内的AST则不释放，当肝细胞受损严重时AST才释放进入血液，故血清转氨酶的水平可在一定程度上反映肝细胞膜的受损程度。
羟脯氨酸是合成细胞外基质(ECM)的主要成分之一胶原蛋白的基础物质，因而肝脏中羟脯氨酸的含量可直接反映肝脏纤维化的程度。N-CWS可显著降低CCl4诱导所致的肝脏中羟脯氨酸的异常增高，说明N-CWS能对抗肝纤维化，该结果也与组织病理学检测结果一致。
白蛋白主要由肝细胞合成和分泌，可维持血液渗透压，且能结合阳离子、阴离子等多种物质，产生广泛可逆构形的改变，故能输送许多营养物质，如脂肪酸、激素、微量金属离子、酶、维生素和药物等。此外，白蛋白还能与微溶的代谢物及有毒物质结合成复合物后运送至代谢器官和解毒器官，然后排出体外；球蛋白是机体免疫应答过程中产生的免疫蛋白。白蛋白与球蛋白量的比值是慢性肝损伤治疗的一项重要的预后指标。而N-CWS能在一定程度上恢复CCl4诱导的A/G比值的降低而达到趋于正常的水平，表明N-CWS对肝纤维化治疗的预后效果较好。
综上所述，N-CWS可以抑制血清转氨酶的活性和炎症反应，并促进肝细胞的分裂增生，对化学性肝损伤和慢性肝损伤具有良好保护作用。同时，N-CWS可显著降低肝脏中羟脯氨酸水平和ECM的蓄积，具有显著的抗肝纤维化作用，且预后效果较好。
权利要求
1.红色奴卡氏放线菌细胞壁骨架用于制备治疗肝脏疾病药物的用途。
2.权利要求1所述的用途，其中肝脏疾病是慢性肝损伤。
3.权利要求1所述的用途，其中肝脏疾病是肝纤维化。
4.权利要求1所述的用途，其中肝脏疾病是肝炎。
全文摘要
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种红色奴卡氏放线菌细胞壁骨架的医药新用途，即治疗肝脏疾病的新用途。
文档编号A61P1/00GK1724071SQ20051004094
公开日2006年1月25日 申请日期2005年7月8日 优先权日2005年7月8日
发明者叶波平, 王颖, 金国虔, 陶俊, 余江河, 吴梧桐, 刘煜, 王鑫, 刘慧 申请人:中国药科大学