一种万古霉素培养基及制备万古霉素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及药物生产领域，特别设及一种万古霉素培养基及制备万古霉素的方 法。
【背景技术】
[0002] 近年来，由于青霉素的广泛的运用造成了大量的青霉素抗性革兰氏阳性感染，万 古霉素就成为了对细菌作战的最后的防线。随着万古霉素的需求的增加，如何改进现有的 万古霉素生产工艺提升万古霉素的产量便成为研究的热点。
[0003] 在现有的万古霉素的生产工艺中，普遍采用控制放线菌属东方拟无枝酸菌在发酵 条件下产生万古霉素，再经过分离纯化后得到万古霉素纯品的方法。由此可见，万古霉素的 发酵步骤在整个生产工艺中对产量能够产生至关重要的影响。因此如何改进现有的发酵工 艺便成为如何提升万古霉素产量的重点。
[0004] 而在现有的发酵工艺中，培养基对发酵过程起着关键的作用。在现有菌种的情况 下，万古霉素的产量和质量的提高，只能通过工艺的优化从而改变产量及质量。而培养基的 优化也就成为重点的研究对象。
【发明内容】
[000引本发明的目的是提供一种万古霉素培养基，该培养基能够显著提高万古霉素在发 酵步骤的收率。本发明的另一个发明目的是提供一种制备万古霉素的方法。该方法应用万 古霉素培养基，从而提高万古霉素的收率和纯度。
[0006] 本发明的上述技术目的是通过W下技术方案得W实现的： 一种万古霉素培养基，其特征是:包括如下重量份数的组分： 碳源 ].5-5份 氮源 Q.05-Q.巧份 无机盐 0.15-0.45份 氷 90-Π 0份 所述无机盐包括硫酸儀、硝酸铁和氯化钢，按照重量份，硫酸儀:硝酸铁:氯化钢=0.5-2:0.5-2:1。
[0007] 还包括重量份为0.04-0.06份的pH调节剂，所述pH调节剂包括憐酸二氨钢和憐酸 氨二钢，按照摩尔比，憐酸二氨钢:憐酸氨二钢=0.15-0.19:1。
[000引还包括甘氨酸、色氨酸、酪氨酸组成的重量份为0.05-0.1份的氨基酸复合物，按照 重量份，甘氨酸:色氨酸:酪氨酸=3-8:1:3-5。
[0009] 所述碳源选自可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖中的一种。
[0010] 所述氮源由尿素、棉巧饼粉和乙酸锭混合而成，按照重量份，尿素:棉巧饼粉:乙酸 锭=3_5:1:2_4。
[0011] -种应用万古霉素培养基的万古霉素制备方法，包括如下步骤:摇瓶种子接种、种 子罐万古霉素培养基培养、发酵罐万古霉素培养基培养、预发酵液预处理、陶瓷膜过滤、一 次纳滤、草酸沉淀、一次板框过滤、一次过柱纯化、二次纳滤、一次结晶、二次板框过滤、活性 炭脱色、脱色板框过滤、二次过柱纯化、超滤、Ξ次纳滤、二次结晶、真空抽滤、晶体溶解、冷 冻干燥、打粉包装，其中 ① 发酵液的预处理:按照发酵液体积的0.1-0.5 %往万古霉素发酵液加入质量分数为 10-20%的盐酸进行成盐，揽拌30min得到预处理液； ② 草酸沉淀:将一次纳滤得到的浓缩液加入草酸沉淀罐，再加入一次纳滤得到的浓缩 液重量的0.001-0.004 %的固体草酸钢，揽拌30-50min后静置； ③ 活性炭脱色:将二次板框过滤得到的一次结晶体加入活性炭脱色罐，加入去离子水 溶解，揽拌并加热，待一次结晶体的溶液沸腾时加入一次结晶体重量的3-6%的活性炭进行 脱色30min。
[0012] 所述板框过滤中，过滤介质为滤板，所述滤板上预涂有2mm的助滤剂，所述助滤剂 为活性炭。
[0013] 所述一次结晶和二次结晶过程中均加入晶体重量10倍的有机溶剂进行结晶，所述 有机溶剂选用乙醇、丙酬和乙酸中的其中一种，所述一次结晶和二次结晶的起始溫度为35-45°C，终点溫度为0-15°C，降溫速度为l-3°C/min。
[0014] 所述晶体溶解步骤为:将真空抽滤得到的二次结晶体加入溶解罐中，加入二次结 晶体重量8-12倍的去离子水，揽拌30min至二次结晶体完全溶解形成溶解液。
[0015] 所述一次过柱纯化采用SP825树脂，所述二次过柱纯化采用HP20SS树脂。
[0016] 综上所述，本发明具有W下有益效果： (1) 在培养基中加入包括硫酸儀、硝酸铁和氯化钢的无机盐，补充微量元素，起到提高 万古霉素的产量作用； (2) 氨基酸复合物可作为氮源补充物;相比于尿素和棉巧饼粉等需要经过代谢后才能 得W吸收利用，甘氨酸、色氨酸、酪氨酸可直接被菌体吸收利用，提高吸收效率，提高万古霉 素产量； (3) 加入抑调节剂，调节培养基的抑至7.2左右，提供菌体合适的酸碱度环境有利于菌 体的生长和生命活动。同时本发明人意外地发现同时加入包括憐酸二氨钢和憐酸氨二钢的 P的周节剂和包括硫酸儀、硝酸铁和氯化钢的无机盐比单独加入包括憐酸二氨钢和憐酸氨二 钢的pH调节剂或者包括硫酸儀、硝酸铁和氯化钢的无机盐能够提高万古霉素的产量和纯 度； (4) 选用尿素、棉巧饼粉和乙酸锭Ξ种含氮物质作为氮源，其中尿素和棉巧饼粉中的氮 W有机物形式存在，而乙酸锭作为有机盐，乙酸锭中的氮比有机物中的氮更容易吸收，且本 发明人意外发现相比于其他锭盐，乙酸锭能够显著提高万古霉素的产率和纯度;而乙酸锭 中的NH4+和无机盐中氯化钢中的Cr结合形成氯化锭，在氯化锭被菌体吸收后留下氯化氨， 能够减少后期盐酸的使用； (5) 由于草酸钢中的C2〇42^能够与巧、儀、铭、儘等多种金属离子进行结合，而在发酵液 中存在着多种金属离子，因此通过草酸钢能够除去发酵液中存在的金属离子，提高产物纯 度，增强安全性和有效性； (6) 在板框的过滤介质上预涂活性炭，从而起到助滤的作用，避免因待过滤的悬浮液中 颗粒太小将滤板的空隙堵住，从而影响正常过滤。在过滤过程中，在一次板框上预涂的活性 炭和二次板框上预涂的活性炭会有部分进入后续步骤中，但是由于需要采用活性炭进行脱 色，因此不会对产物的纯度造成影响，反而能够助滤提高产物的收率和纯度； (7) 对培养基的组分的选择和比例进行优化设计，并通过工艺控制使各个组分之间发 挥协同作用，提高万古霉素的收率和纯度。
【附图说明】
[0017] 图1为工艺流程图。
【具体实施方式】
[0018] W下结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0019] 本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人 员在阅读完本说明书后可W根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本 发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。 表1实施例1-6为培养基的组分表
[0020] 将实施例1-5的培养基均按照如下的制备方法进行制备： 步骤1:按照重量份，称取或者量取各组分； 步骤2:量取用水量的2/3，加热至沸腾。将碳源和剩余的1/^3水混合揽拌，然后倒入上述 沸水，继续加热，至碳源完全溶化，降到室溫下加入氮源、无机盐和氨基酸复合物，揽拌溶 解； 步骤3:加入pH调节剂，调节pH至7.2。
[0021] 实施例6的培养基的制备方法与实施例1-5的培养基区别在于步骤2中未加入氨基 酸复合物，步骤3中不加入抑调节剂调节pH。
[0022] 参照图1，实施例7 -9为万古霉素的制备 实施例7 选用按照实施例1制备的培养基。
[0023] 步骤1:摇瓶种子接种、种子罐万古霉素培养基培养、发酵罐万古霉素培养基培养 得到万古霉素发酵液。将万古霉素发酵液置于预处理罐中，控制转速为80rad/min，溫度为 25°C，加入发酵液体积的0.1 %的质量分数为10%的盐酸进行成盐，揽拌30min得到预处理 液。
[0024] 步骤2:陶瓷膜过滤，选用多通道陶瓷膜，通道数为10,其膜材质为二氧化娃，孔径 为0.2皿。采用错流模式进行循环过滤，压力控制为0.1 MPa。
[0025] 步骤3:经过陶瓷膜过滤后进入一次纳滤机组，纳滤采用孔径为0.5nm的芳香聚酷 胺复合纳滤膜;纳滤过程中，压力控制在2.2MPa，滤液溫度控制在25°C，纳滤的流速控制在 400LA，纳滤的浓缩体积倍数为4倍，纳滤结束，采用纯化水顶洗lOmin。
[0026] 步骤4:经过一次纳滤后进入草酸沉淀罐，再加入一次纳滤得到的浓缩液重量的 0.001 %的固体草酸钢，揽拌时间50min后静置。
[0027] 步骤5:进入一次板框过滤除去草酸沉淀罐中的沉淀，板框中过滤介质为滤板，滤 板上预涂有2mm的助滤剂活性炭。
[0028] 步骤6:进入一次过柱纯化，一次过柱纯化采用SP825树脂。
[0029] 步骤7:将一次过柱纯化得到的洗脱液进入二次纳滤机组，纳滤采用孔径为0.5nm 的芳香聚酷胺复合纳滤膜;纳滤过程中，压力控制在2MPa，滤液溫度控制在25°C，纳滤的流 速控制在4(K)LA，纳滤的浓缩体积倍数为4倍，纳滤结束，采用纯化水顶洗lOmin。
[0030] 步骤8:进入一次结晶罐中进行一次结晶，加入二次纳滤得到的浓缩液的重量10倍 的乙醇，起始溫度控制为45°C，终点溫度为15°C，降溫速度为3°C/min。
[0031 ]步骤9:进入二次板框过滤得到一次结晶体，板框中过滤介质为滤板，滤板上预涂 有2mm的助滤剂活性炭。
[0032] 步骤10:将二次板框过滤得到的一次结晶体加入活性炭脱色罐，加入去离子水溶 解，揽拌并加热，待一次结晶体的溶液沸腾时加入一次结晶体重量的6%的活性炭进行脱色 30min〇
[0033] 步骤11:进入脱色板框进行脱色，脱色板框中过滤介质为滤板，滤板上预涂有2mm 的助滤剂活性炭。
[0034] 步骤12:将脱色板框中得到的过滤液进入二次过柱纯化，二次过柱纯化采用 服20SS树脂。
[00巧]步骤13:进入超滤机组，超滤采用中空纤维超滤膜组件，超滤时，控制压力ο. IMPa。
[0036] 步骤14:进入Ξ次纳滤机组，纳滤采用孔径为0.5nm的芳香聚酷胺复合纳滤膜;纳 滤过程中，压力控制在2MPa，滤液溫度控制在25°C，纳滤的流速控制在4(K)L/h，纳滤的浓缩 体积倍数为4倍，纳滤结束，采用纯化水顶洗lOmin。
[0037] 步骤15:进入二次结晶罐中进行二次结晶，加入Ξ次纳滤得到的浓缩液的重量10 倍的乙醇，起始溫度控制为45°C，终点溫度为15°C，降溫速度为3°C/min。
[0038] 步骤16:真空抽滤至干燥。
[0039 ]步骤17:将真空抽滤得到的二次结晶体加入溶解罐中，加入二次结晶体重量12倍 的去离子水，揽拌30min至二次结晶体完全溶解形成溶解液。
[0040]步骤18:置于冷冻干燥机内，-45°