一种天然及人工合成的异硫氰酸酯类化合物及其在治疗和预防癌症中的应用的制作方法

专利名称：：一种天然及人工合成的异硫氰酸酯类化合物及其在治疗和预防癌症中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于医药应用(或化学制药)领域，涉及JC-5411系列化合物，以异硫氰酸酯为母核结构，无论是天然的还是人工合成的，能直接抑制肿瘤细胞中异常的DNA甲基化和组蛋白脱乙酰基酶(histonedeacetylase，HADC)的活性，有选择性地促进组蛋白乙酰化和甲基化，进而使癌细胞中被异常关闭的一些具有重要功能的基因如抑癌基因，调节细胞周期，细胞凋亡的基因，DNA损伤和修复的基因，抑制癌细胞恶性侵润和转移的基因等恢复表达，发挥其正常功能，于是使癌细胞的恶性增殖得以控制，从而能有效地抑制包括结肠癌，胃癌，肺癌，前列腺癌，肝癌，乳腺癌，结肠癌，宫颈癌，黑色素瘤和神经母细胞瘤等多种人体肿瘤细胞生长。与已知的天然或是人工合成的DNA甲基化及组蛋白脱乙酰基酶抑制剂相比较，该系列化合物是独一无二的既抑制异常的DNA甲基化又抑制组蛋白脱乙酰基酶的双重抑制剂，且具有疗效强，毒副作用低微，化学生物学性质稳定等特点，可用于治疗和预防恶性肿瘤。
背景技术：
：虽然由于流行病学的进步，早期诊断和治疗方法的进一步改良，癌症的治疗和预防在过去的十多年中已取得显著的成就，然而肿瘤仍然是威胁人们生命的主要疾病之一，并且尽管外科手术和放射治疗的不断成熟，新的治疗方法如基因治疗等的不断出现，但迄今为止尚无一方法能取代化疗。进年来，肿瘤分子生物学研究的进步，一些疗效好，特异性强的药物如阿瓦斯丁(Avastin)(抗血管形成，美国基因泰克公司)及易瑞沙(表皮生长因子通路抑制剂，阿斯利康)为恶性肿瘤的治疗增加了新的有力武器。但由于肿瘤是一多分子(基因)病变而致的疾病，针对某一基因或通路的药物远远不能达到治愈肿瘤的目的。现有的抗癌药物，虽然具有一定疗效，但它们大多是细胞毒药物，具有严重的毒副作用。于是，发掘新型高效低毒的抗癌新药，仍然是药物研究的重要课题。现已公认，两种主要的非遗传基因转录控制的机制是DNA-CpG位点的甲基化和组蛋白的共价修饰(1，2)。大量研究已表明，几乎所有的恶性肿瘤都有一些重要的基因由于DNA-CpG甲基化和/或组蛋白的共价修饰异常而导致基因转录异常关闭。这些基因包括DNA修复酶，如MGMT和hMLH1或解毒酶(GSTP1)。它们的转录关闭将导致DNA突变(3-5)。其它异常关闭的基因包括调节细胞周期的基因，抑癌基因，影响细胞凋亡，血管形成基因，以及与癌细胞侵润转移有关的基因，如p16INK4a，BRCA1，Rb，RAR2，RAR4，RASSF1A，CDH13，APC，CDH1，和FHIT(3，4，6-11)。于是，与甲基化相关的基因关闭，已成为肿瘤诊断和治疗的靶点(12)。另一方面，高等有机体包括人体细胞在内，基因的转录严格受到染色质密度的控制。任何处于高密度染色质位点的基因，则处于关闭状态。众所周知，贮存遗传信息的细胞染色体主要是由DNA和组蛋白所组成的。在DNA周围，是由组蛋白所组成的蛋白球。它们与DNA紧密环抱，而形成细胞核。早在1964年，Allfrey等人首次证明组蛋白的甲基化/乙酰化与RNA的合成有关。后来人们相继发现组蛋白的共价修饰与染色质的构造，基因转录的调节，非遗传信号的传递，以及恶性肿瘤等有关。可逆的组蛋白化学修饰直接调节核体与核体，核体与DNA，以及DNA与转录因子间的相互作用(13)。翻译后的组蛋白化学修饰包括乙酰化，甲基化以及磷酸化。它们是通过相应的作用完全相反的酶来实现的，即乙酰基转移酶和脱乙酰化酶(HDAC)；甲基转移酶和脱甲基化酶；磷酸化酶和磷脂酶(14)。DNACpG位点甲基化和组蛋白HDAC一起共同参与了癌细胞中一些具有重要生理功能的基因的关闭。甲基化结合位点(MBD)蛋白能特异地与甲基化的CpG位点结合，从而抑制基因转录(15)。重要的是在MBD蛋白家族中，所有的成员都具有相同的MBD，其中，MeCP2，MBD2andMBD3与庞大的蛋白复合物相联系。这些庞大的蛋白复合物含有组蛋白脱乙酰基酶HDACl，和HDAC2，并具有染色质重建功能。这种染色质重建活动的结果是阻碍转录因子与DNA相结合，进而抑制基因的转录。显而易见，由于DNA甲基化和组蛋白脱乙酰基酶在关闭正常基因转录过程中相互作用，同时使用DNA甲基化抑制剂和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，则能协同地阻断正常基因的转录关闭，从而起到阻止癌变和治疗肿瘤的作用。由于CpG甲基化和组蛋白化学修饰在癌变和肿瘤的恶化过程中的作用日益明确，寻找DNA甲基化抑制剂和组蛋白脱乙酰化抑制剂已成为抗癌药研制开发的新方向(12，16)。常见的DNA甲基化抑制剂抑制DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferases，DNMTs)。采用基因敲除技术，使DNMT1和DNMT3b灭活，则使抑癌基因的所有CpG甲基化位点甲基化逆转。于是甲基转移酶是甲基化抑制剂的重要靶酶。甲基转移酶有二个底物结合位点，胞嘧啶残基和S-腺嘌呤-蛋氨酸(S-adenosyl-methionine)。于是，任何化学结构类似于胞嘧啶或S-腺嘌呤-蛋氨酸的则有可能与DNMTs相结合，而成为竞争性抑制剂。事实上，DNMTs的第一个竞争性抑制剂是5-氮杂胞嘧啶核苷(17)。该药曾用于白血病的治疗。由于其易被核甘脱氨基酶所降解而失去DNMTs抑制剂作用，该化合物已很少应用。临床上常使用的DNA甲基化抑制剂是脱氧氮杂胞苷(5’-Aza)(Decitabine，or5’-Aza，Super-GenInc.，CA，USA)。在体外细胞体系中已证明，该化合物能有效地抑制DNA甲基化。但由于肝和脾组织具有高水平的胞嘧啶脱氨基酶存在，脱氧氮杂胞苷体内有效半衰期仅仅15到20分钟。同时由于这类核甘衍生物能参入DNA分子中，进而干扰正常的DNA代谢，于是毒副作用大。有趣的是，临床上用作为抗心率失常的药物普鲁卡因胺(Procainamide)以及局部麻醉药普鲁卡因(Procaine)已被认为是非核甘类的DNA甲基化抑制剂(18)，在前列腺癌细胞中能有效地抑制解毒酶，即GSTP1的DNA甲基化(19)。尽管这些药物抗肿瘤作用有待评价，毫无疑问，发掘新型的DNA甲基化抑制剂已在紧锣密鼓进行中(12)。与此同时，另一个打断非遗传癌变及其恶化过程的是抑制组蛋白脱乙酰基酶(HADC)。如前所述，肿瘤细胞内HADC的异常，使得组蛋白的甲基化，乙酰化异常下降，从而增加了组蛋白与DNA间的结合而阻断转录因子与靶基因的作用，使具有重要生理功能的基因，如抑癌基因，调节细胞周期，细胞凋亡的基因，DNA损伤修复的基因等异常关闭。因而组蛋白脱乙酰基酶抑制剂成为近年来抗肿瘤药研究领域中的热点之一。目前为止，已有十种HDAC抑制剂在临床试用。虽然尚有各种各样的问题需要解决，但临床试用结果仍另人振奋。为了填补我国在该领域的研究空白，我们无锡杰西医药科技有限公司在大量研究基础上，发现异硫氰酸酯(JC-5411系列化合物)，无论是天然的，还是人工合成的既能抑制DNA-CpG位点的甲基化，又能抑制HDAC，从而能有效地使癌细胞中被异常关闭的基因重新恢复功能(至今为止，尚没有一个化合物具有这样的双重作用)。我们的大量实验还表明，这类化合物具有很强的抗癌活性。与现有的甲基化和HDAC抑制剂相比较，JC-5411系列化合物具有如下特点1，JC-5411系列化合物既抑制DNA甲基化又抑制HADC，这在目前所有已知的这类药物中独一无二。单一以JC-5411类化合物处理癌细胞，就能达到使癌变后异常关闭的抑癌基因等重要的基因恢复正常功能。2，与目前广泛使用的DNA甲基化抑制剂脱氧氮杂胞苷相比，JC-5411无论是DNA脱甲基化作用还是抗癌作用都优于脱氧氮杂胞苷。3，目前临床试用的HADC抑制剂，化学及药物代谢学性质不稳定。虽然许多这类化合物在体外抑制HADC活性很强，但整体抗癌活性不强，或无效。而我们的实验已证明JC-5411系列化合物，其体内代谢物PEITC-NAC仍然有等同的活性。4，与目前临床试用最好的HADC抑制剂N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SuberoylanilideHydroxamicAcid，SAHA)相比较，JC-5411系列化合物抗癌活性优于SAHA。5，与临床上试用的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂丁酸钠相比，JC-5411的活性强度大约是丁酸钠的200倍。6，无论是传统的核甘类DNA甲基化抑制剂还是现发现的利多卡因，普鲁卡因等临床使用的抗心率失常或局部麻醉药，都具有严重的毒副作用，限制了其治疗恶性肿瘤的临床使用。恰恰相反，JC-5411系列化合物来自于天然食物，而且我们实验已证明JC-5411系列化合物选择性极强，在有效药物剂量下，对正常人体细胞无任何不良作用。
发明内容本发明的目的在于寻求一种天然及人工合成的异硫氰酸酯类化合物及其在治疗和预防癌症中的应用，这种化合物能重新启动正常的基因功能，可用于治疗和预防恶性肿瘤。异硫氰酸类化合物(Isothoicyanates)，即JC-5411系列化合物，天然的或人工合成的，以JC-5411为代表，是DNA甲基化和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，其结构式如下所指的肿瘤包括各种白血病和各种实体瘤。在使用时，可以是单药治疗，亦可以是联合治疗。联合治疗可以是与其它化疗联用，亦可以与中草药联用，或是与手术，放疗，免疫治疗，激素治疗，基因治疗等联用。联合治疗可以是同时治疗，亦可以是不同先后次序治疗。JC-5411系列化合物作为药用，可以采用任何给药途经，任何给药方式。即可以口服，注射，吸入，透皮吸收，植入，腔道，黏膜，以及静脉滴注等。JC-5411系列化合物作为药用，可以制成片剂，丸剂，胶囊剂，膏剂，霜剂，贴剂，粉剂，针剂，喷雾剂，植入剂，拴剂，滴剂等多种剂型。本发明通过DNA甲基化特异性DNA多聚酶链反应(MS-PCR)及定量的DNA甲基化特异性DNA多聚酶链反应(Pyro-sequencing)，在世界范围内首次在激素依赖型和激素非依赖型人前列癌细胞中证明了JC-5411能有效地抑制GSTP1基因起动子(Promoter)DNA甲基化。其作用强于阳性药物脱氧氮杂胞苷。GSTP1基因在人前列癌细胞中由于起动子区被异常甲基化而几乎完全被关闭。本发明通过蛋白印迹法在世界范围内首次证明了JC-5411能有效地激活人前列癌细胞重新表达GSTP1蛋白。本发明通过荧光酶标法在世界范围内首次证明了JC-5411及其体内代谢物JC-5411-NAC能有效地抑制组蛋白脱甲基化酶。本发明通过蛋白印迹法，在世界范围内首次证明了JC-5411显著地有选择地调节组蛋白的化学修饰，即促进组蛋白H3乙酰化，组蛋白H3K4甲基化(该化学修饰的结果有利于基因转录)。与此相反，同等实验条件下，JC-5411抑制组蛋白H3K9的甲基化(该蛋白的甲基化不利于基因的转录)。实验亦表明，在相同条件下，JC-5411使HDACl的蛋白水平下降。与临床上试用的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂丁酸钠(20)相比，JC-5411的活性强度大约是丁酸钠的200倍(10μM的JC-5411所产生的作用相当于2mM的丁酸钠所产生的作用)。本发明通过MTT和SRB法，对抗癌活性研究表明，JC-5411对乳腺癌，肝癌，肺癌，胃癌，结肠癌，宫颈癌，黑色素瘤，激素依赖型和激素非依赖型前列腺癌以及神经母细胞瘤都具有很好的抗癌作用。尤为重要的是JC-5411对临床上束手无策的激素非依赖型前列腺癌亦具有与激素依赖型前列腺癌相同的抑制作用。本发明通过及裸小鼠的人前列腺癌模型证明JC-5411对激素非依赖的人前列腺癌具有较强的抗癌活性。应该指出，JC-5411在肿瘤治疗过程中，可以是单药治疗，亦可以是与2种，3种或更多药物联合治疗，同时给药，或不同先后次序给药。这里所说的联合治疗，可以是与其它西药，中草药合并使用，或与激素治疗，放射治疗，免疫治疗，化疗，冷冻治疗以及基因治疗合并治疗。该项发明提供的药物产品治疗肿瘤，这些产品含有有效剂量的JC-5411和其它制药工业所采用的一切适宜添加剂，以及各种适宜的给药途经。娴熟的药物生产工艺包括使用无毒的制药工业所接受的药物前体为原料，采用多种方法从天然材料中提取或人工合成JC-5411。娴熟的药物生产工艺还包括使用制药工业所接受的溶剂作为JC-5411的溶媒，例如水，矿物油，食用油，二甲基亚砜，等。JC-5411可制成口服给药，局部用药，吸入给药，肛门给药等剂型。使用无毒的制药工业所接受的材料作为载体，附加剂，赋型剂。再次指出的是给药方式可以是联合用药。口服给药剂型包括片剂，胶囊，酊剂，锭剂，口服糖浆或其它一切适用剂型。JC-5411可制成系统给药剂型，包括皮下注射，皮内注射，肌肉注射，静脉注射，脊椎注射，鞘内注射，或其它任何注射给药和滴注。除此之外，JC-5411制剂除含有有效剂量的JC-5411外，尚可含有其它药学上一切可用的无毒物质。包括一种或多种载体，稀释剂，附加剂，以及如果需要的话，其它药用成份。JC-5411可制成任何形式的口服剂型，包括片剂，锭剂，软硬胶囊，可服水剂，酊剂，口服混悬液，粉剂，乳化剂等。口服剂型可含有一种或多种甜味剂，矫味剂，颜色剂及防腐剂，以保证色彩完美和便于服用。用于JC-5411片剂的赋型剂可以是惰性的稀释剂，如碳酸钙，碳酸钠，乳酸钙，磷酸钙，磷酸钠；制颗粒剂玉米淀粉，藻朊酸；粘合剂淀粉，明胶或是阿拉伯胶；滑润剂硬脂酸，硬脂酸镁或滑石粉。采用一切已知技术，制成包衣或无衣片剂。包衣剂型包括肠溶衣和缓释剂型。用于缓释剂型的材料可以是甘油单脂或甘油二脂盐。JC-5411胶囊可以是硬胶囊，亦可以是软胶囊。用于硬胶囊的辅料可以是碳酸钙，磷酸钙或高岭土。用于软胶囊的辅料如水，油类包括花生油，橄榄油或液态石蜡。JC-5411口服水型混悬液可将有效剂量的JC-5411与合适的稀释剂配制而成。其稀释混悬剂可以是羟甲基纤维素钠或甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，藻酸钠盐，聚乙烯吡咯烷酮，西黄耆胶，阿拉伯胶。分散剂或湿润剂包括天然磷脂，如卵磷脂，或烯烃氧化物与脂肪酸的缩合物，如17烷基乙烯氧化烷醇，或是乙烯与脂肪酸部分酯化缩合物，或是己糖醇如聚氧乙烯山梨醇单油酸盐，或是氧化乙烯和脂肪酸部分脂肪缩合产物，以及乙醇酐，如聚乙烯山梨醇甲酯酸盐。JC-5411口服水型混悬液也可能含有一种或多种防腐剂，如乙基对或邻羟基苯安息香盐；含一种或多种甜味剂，如蔗糖或糖精。JC-5411油型混悬液可将有效剂量的JC-5411混悬于植物油中，如大豆油，花生油，玉米油，橄榄油，芝麻油，可可油。或是矿物油，如液态石蜡。该制剂亦可含有稀释剂，如蜂蜡，蜡，或十六烷醇，上文所述的甜味剂，以及矫味剂和稳定剂，如抗氧化剂维生素C(抗坏血酸)。采用如上所述的分散剂，湿润剂，混悬剂，防腐剂，矫味剂，甜味剂，以及着色剂，JC-5411亦可制成水包油型制剂。JC-5411制成水包油型乳化剂。其油相可以是如上所述的植物油，如大豆油，橄榄油，花生油等。亦可以是液态石蜡，矿物油，或是二类的混合物。乳化剂可以是天然的乳化剂，如金合欢胶，或是西黄耆胶，天然磷脂如大豆磷脂，卵磷脂，脂肪酸，己糖醇或酐的脂或半脂化物，如山梨糖单脂。亦可是人造化工材料，如氧化乙烯半脂缩合物，聚乙烯山梨醇单脂盐。JC-5411的水包油型乳化制剂亦可含有甜味剂和矫味剂等。JC-5411的糖浆剂和酊剂可采用甜味剂，如丙醇，丙二醇，山梨醇或蔗糖。该制剂亦可含有湿润剂，防腐剂，矫味剂，颜色添加剂。JC-5411的注射剂可采用无菌注射液或是油状混悬液。其可运用药剂学上一切适用的分散剂，湿润剂或混悬剂。该制剂可以是无菌透明液，使用药剂学上一切适用的稀释剂，如1，3-丁二醇，水，林格氏溶液，或生理盐水。此外，无菌油脂类亦可作为溶剂或混悬剂。其可以是合成的甘油单脂或二脂，脂肪酸，如油酸等。JC-5411亦可制成拴剂，如肛门栓剂等。栓剂可由一定量的JC-5411与相应的无刺激赋型剂组合而成。赋型剂在常温下为固体，但在肛门体温下液化而释放药物。适用的赋型剂包括可可脂和聚乙烯二醇类。JC-5411的系统给药剂型，根据所用载体浓度，可以是混悬型，亦可是溶解型。为了使用便利或减轻病人痛苦，可添加防腐剂，缓冲剂和局部麻醉剂。JC-5411亦可作为兽医用药。为便于动物服用，含有JC-5411的制剂可加入动物饲料中或饮水中。亦可制成方便的剂型作为动物的食品或饮品。对于人，在治疗上述疾病时，JC-5411的剂量范围初步定为每公斤体重0.01mg至20mg，或按人均体重60公斤计大约每天0.6mg至1200mg。根据给药方式，JC-5411可制成单一剂量剂型或多剂量剂型。剂量单位初步定为含有效成份1mg至500mg。每日给药次数依病种而定。多数情况下，每日不多于四次。应指出的是，给药剂量可能取决于多种因素，如年龄，体重，健康状况，性别，饮食，以及给药时间，途径，病情，和药物的联合使用等。于是，最终给药方案应由医生根据具体情况而决定。该专利所提及的优先化合物，有理想的药理学性如优越的口服生物利用度，低毒性，低血浆蛋白结合率和理想的体内外半衰期。这类化合物能通过血脑屏障，这对治疗中枢神经系统疾病是优点。图1，JC-5411及其异硫氰酸酯母核的化学结构。图2，JC-5411抑制GSTP1基因甲基化作用。对数生成期的人前列腺癌细胞LNCAP，以不同浓度的(0.5-2μM)JC-5411及如图所示浓度的5’-AZA(阳性对照)处理5天后，提取基因组DNA，以MS-PCR法测定GSTP1基因起动子部位的甲基化(M)及非甲基化(U)形式的DNA。图3，定量测定JC-5411对GSTP1基因甲基化的抑制作用。将对数生长期的人前列腺癌细胞LNCAP，分别以JC-5411(2μM)或5’Aza(阳性对照，5μM)处理5天后，定量测定GSTP1基因CpG位点的甲基化。图4，JC-5411及5’Aza对LNCAP细胞中GSTP1基因表达的影响。将对数生长期的人前列腺癌细胞LNCAP，分别以JC-5411(2μM)或5’Aza(阳性对照，5μM)处理6天后，提取细胞总蛋白，并以蛋白印迹发测定GSTP1的蛋白水平。图中β-Actin被用作为内标，以提高测定的可靠性。图5，JC-5411对组蛋白化学修饰的影响。将对数生成期的人前列腺癌LNCAP细胞以如图所示浓度的JC-5411处理36小时，分离组蛋白，以位点特异性组蛋白抗体进行蛋白印迹实验，以测定所示组蛋白水平。图中β-Actin为内标，以表明每行所加入的蛋白量相同。图6，JC-5411对HDAC的抑制作用。左图JC-5411对前列腺癌LNCAP细胞中HDAC的抑制作用。取对数生长期的LNCAP细胞，以不同浓度的JC-5411处理36小时，提取细胞蛋白，以HDAC荧光酶标试剂盒测定HDAC酶活性。图示结果是三次实验的平均值±标准差。右图将市售HeLa细胞核提取物与不同浓度的JC-5411及其体内代谢物JC-5411-NAC或与IC50浓度的TSA(作为阳性对照物)温孵10分钟，以HDAC荧光酶标试剂盒测定HDAC酶活性。图示结果是二次实验的平均值±标准差。图7，JC-5411诱导的细胞凋亡。对数生长期的人前列腺癌细胞LNCAP，以如图所示的JC-5411浓度处理48小时后，分别以TUNEL法(黑色)及活化的caspases酶荧光分析法(蓝色)测定凋亡细胞的百分数。图中数据是二次独立实验的平均值±标准差。图8，JC-5411及其阳性对照药物Casodex，SAHA，5’-Aza对人激素依赖型前列腺癌LNCAP细胞生长抑制药-效曲线。将对数生长期的人激素依赖型前列腺癌LNCAP细胞生长接种于96孔板(2500细胞/孔)，24小时后，加入等比例稀释的图中所示药物，并继续培养7天，以MTT法测定细胞生长。图9，JC-5411及其阳性对照药物Casodex，SAHA，5’-Aza对人激素非依赖型前列腺癌AI细胞生长抑制药-效曲线。方法同图8。图10，JC-5411对人激素依赖AD及激素非依赖型AI前列腺癌细胞生长抑制药-效曲线，及其与紫杉醇(Paclitaxel)的比较。方法同图8。具体实施例方式实例1，JC-5411的合成仪器与试剂1H-NMR谱用BruckerAV-300型核磁共振仪测定，内标TMS，溶剂为CDCl3；MS用NicoletFTMS-2000型质谱仪测定；元素分析用ElementarVarioELIII仪器测定。薄板层析(TLC)采用硅胶GF254(青岛海洋化工厂生产)自制；试剂均为市售化学纯或分析纯产品，未经处理直接使用。JC-5411(苯乙基硫代异氰酸酯，PhenethylIsothiocyanate)的制备在50mL圆底烧瓶中加入15mLCH2Cl2和硫代光气3mL(40mmol)，搅拌，冷却至0℃，用恒压滴液漏斗缓慢滴加等当量的三乙胺(4.04g，40mmol)与苯乙胺(4.85g，40mmol)组成的混合液(滴加过程放热，温度不宜超过15℃)。滴毕后，在室温下反应5～6小时，用TLC检测苯乙胺消失后，加入10mL水淬灭反应。再加5mLCH2Cl2，分液漏斗分出有机相，无水硫酸钠干燥有机相后，过滤，浓缩有机相至干。残留液用石油醚(沸程60～90℃)作洗脱液，经硅胶柱洗脱纯化，浓缩后，经真空精馏得无色油状液体4.9g，产率75％。1H-NMRδ7.26～7.24(m，3H，Ph-H)，7.12(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-H)，3.94(t，J＝7.0Hz，2H，CH2)，2.81(t，J＝7.0Hz，2H，CH2)；ESI-MS164.1[M+H]+，C9H9NS(163.24)；Anal.CalcdforC9H9NSC66.22，H5.56，N8.58；FoundC66.30，H5.42，N8.34；分子量为163.24。实例2，JC-5411抑制GSTP1基因起动子DNA甲基化材料及方法试剂JC-5411苯乙基异硫氰酸酯PhenethylIsothiocyanate，由无锡杰西医药科技有限公司合成(见实施例一)。实验时，以DMSO配成溶液。DNA多聚酶链反应(PCR)试剂购于美国Invitrogen生物技术公司。PCR引物购于美国Operon生物技术公司.实验用其它化学试剂，除特别说明外，均购于美国Sigma化学试剂公司。蛋白电泳用聚丙酰胺凝胶试剂，SDS，电泳缓冲液，蛋白电转移缓冲液，购于美国Bio-Rad生命科学公司。细胞培养人前列腺癌细胞LNCAP和PC-3，购于AmericanTypeCultureCollection。细胞置于37℃，5％CO2温箱中，以含10％胎牛血清和青霉素和链霉素的RPMI1640培养基培养。特异性甲基化DNA多聚酶链反应(MS-PCR)以Singaletal所述方法进行MS-PCR实验以测定JC-5411对DNA甲基化的影响(5)。简言之对数生成期的人前列腺癌LNCAP细胞，以不同浓度的JC-5411处理5天后，提取细胞基因组DNA。取1微克的DNA样品，以0.2M的氢氧化钠(NaOH)处理10分钟使其变性后，加入30μl新鲜配制的10mM的氢化喹啉(hydroquinone)及520μl的3M亚硫酸氢钠(pH5.0)和少许矿物油。然后将DNA样品在50℃保温16小时后提纯。以经亚硫酸氢钠转换的DNA为模板，进行MS-PCR，其条件如下甲基化型(M)PCR引物5’-TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC-3’及5’-GCCCCAATACTAAATCACGACG-3’；非甲基化型(U)PCR引物5’-GATGTTTGGGGTGTAGTGGTTGTT-3’，及5’-CCACCCCAATACTAAATCACAACA-3’。以MJResearchPTC-100PCR仪进行PCR反应，其PCR程序如下95℃/10分钟，然后以95℃/1分，54℃/1分，72℃/1分，最终链延伸72℃，10分钟。反应共进行50个周期。每一样品进行二重MS-PCR反应。以2％琼脂糖电泳法检测PCR反应产物。JC-5411抑制DNACpG甲基化的定量测定(Pyro-sequencing)采用文献所述的pyro-sequencing方法(21，22)，我们以5’GTGATTTAGTATTGG，和biotin标记的5’-AACTCTAAACCCCATC为PCR引物，并以5’-AGGTTTTTGTTGGA为DNA序列测定的引物，使用计算机程序定量分析了JC-5411脱甲基化作用。蛋白印迹法检测GSTP1蛋白将对数生长期的人前列腺癌细胞LNCAP以不同浓度的JC-5411或5μM5’-Aza(阳性对照)处理6天。收集细胞，洗涤，以文献方法(23)提取蛋白，定量。取50μg的蛋白进行SDS-聚丙酰胺凝胶电泳。电泳后，将蛋白电转到硝酸纤维膜上，以特异的GSTP1抗体进行检测，并以β-Aetin抗体作为内标。结果和讨论通过采用前列腺癌病人标本及细胞系所进行的大量实验表明，GSTP1基因的甲基化及其转录的异常关闭是非常特异及十分敏感的前列腺癌分子病变。为了研究JC-5411对基因甲基化的影响，我们选择了人前列腺癌细胞系LNCAP为研究对象，以甲基化特异DNA多聚酶链反应技术观察了JC-5411对GSTP1基因甲基化抑制作用。如图2所示，LNCAP细胞的GSTP1基因几乎100％被甲基化了(图1中M为甲基化形式，U为非甲基化形式)。但以不同浓度的JC-5411处理LNCAP细胞5天后，我们观测到了非甲基化形式的DNA信号，并且JC-5411的脱甲基化作用是药物浓度依赖的(有效浓度为1-2μM)，说明这种药物作用并非人为的实验误差。以同样的方法，我们研究了JC-5411对其它癌细胞如人前列腺癌细胞PC-3和DU145脱甲基化作用，均得到了同样的结果。与阳性对照药物脱氧氮杂胞苷(5’-AZA)(5，7)相比，5μM的5’-AZA脱甲基化的作用强度与1μM的JC-5411相当，说明JC-5411强于5’-A7A。采用文献所述的pyro-sequencing方法(21，22)，我们进一步定量测定了JC-5411对GSTP1基因甲基化的影响。如图3所示，我们所用的DNA序列测定引物复盖4个CpG甲基化位点(分别表为1，2，3和4)。象预料的那样，在正常前列腺组织DNA中，未检测到GSTP1基因的甲基化。与此相反，在前列腺癌细胞LNCAP中GSTP1基因甲基化程度相当高，如位点1和3，LNCAP细胞GSTP1基因甲基化分别为89.％和61.8％(C89.5％及C61.8％)。经2μM的JC-5411处理5天后，1及3位的甲基化则分别下降为78.3％和6.5％。JC-5411介导甲基化抑制作用强于阳性对照药物5’-Aza。在5μM的5’-Aza作用下，1及3位的甲基化则分别下降为78.3％和37.7％。为了进一步证明JC-5411介导的GSTP1基因脱甲基化，能重新起动该基因的表达，我们以蛋白印迹法测定了JC-5411处理后的LNCAP细胞GSTP1蛋白水平。如图4所示，LNCAP细胞经2μM的JC-5411处理6天后，GSTP1的蛋白大幅度增加。于是我们实验首次证明JC-5411是DNA甲基化抑制剂，其结果使被异常关闭的基因重新启动表达，恢复其原有的功能。实例3，JC-5411抑制组蛋白脱乙酰基酶材料及方法试剂JC-5411，同实例2。蛋白电泳用聚丙酰胺凝胶试剂，SDS，电泳缓冲液，蛋白电转移缓冲液，购于美国Bio-Rad生命科学公司。位点特异性乙酰化及甲基化组蛋白H3抗体，购于美国Upstate生化技术公司。实验用其它化学试剂，除特别说明外，均购于美国Sigma化学试剂公司。组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)活性测定试剂盒购于美国Biomol生化技术公司。细胞培养同实例2。组蛋白乙酰化和甲基化的测定将对数生长期的人前列腺癌细胞LNCAP，以不同浓度的JC-5411处理48小时后，以Yoshida等人所述方法分离组蛋白(24)将细胞以冰冷的磷酸盐缓冲液收集，并置于1ml溶细胞缓冲液(含有50mM亚硫酸氢钠，8.6％蔗糖，1％TritonX-100，10mM氯化镁，and10mMTris-HClpH6.5)，以匀浆器制成匀浆，在700RPM速度下离心5分钟，收集细胞核。将细胞核再以溶细胞缓冲液洗涤三次，10mMTris-HClpH7.4(含有13mMEDTA)洗涤一次。然后，按文献所述方法，以酸性溶液提取组蛋白(24)，再以位点特异性乙酰化及甲基化组蛋白H3抗体，通过蛋白印迹法测定总体核心组蛋白的乙酰化和甲基化。组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)活性的测定将人前列腺癌LNCAP细胞核提取物在37℃温孵数分钟后，加入不同浓度的JC-5411及阳性对照药物TrichostatinA，继续温孵10分钟，以组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)活性测定试剂盒测定I型和II型HDAC酶活性。结果和讨论为检测JC-5411是否能修饰组蛋白而激活被关闭的基因的表达，我们将人前列腺癌细胞LNCAP以不同浓度的JC-5411处理36小时，分离了组蛋白，采用位点特异性乙酰化及甲基化组蛋白H3抗体，以蛋白印迹法测定了总体核心组蛋白的乙酰化和甲基化。如图5所示，JC-5411显著地有选择地调节组蛋白的化学修饰，即促进组蛋白H3乙酰化，组蛋白H3K4甲基化。而组蛋白H3K4甲基化是然色质激活的重要标志(25)。并且JC-5411的这一作用是药物浓度依赖性的。于此相反，同等实验条件下，JC-5411抑制组蛋白H3K9的甲基化(与组蛋白H3K4修饰相反，组蛋白H3K9的甲基化则是抑制基因的转录标志(26))。实验亦表明，在相同条件下，JC-5411使HDACl的蛋白水平下降。值得一提的是，与临床上式用的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂丁酸钠(20)相比，JC-5411的活性强度大约是丁酸钠的200倍(10μM的JC-5411所产生的作用相当于2mM的丁酸钠所产生的作用)。为了研究JC-5411有选择地调节组蛋白的化学修饰是否是通过其有效地抑制组蛋白脱乙酰基酶，我们采用HDAC测定试剂盒，观察了JC-5411对组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)的作用。如图5所示，细胞经JC-5411处理后，HDAC活性明显下降。该结果说明JC-5411能直接抑制HADC酶活性。为进一步证明JC-5411能直接抑制HDAC酶活性，我们采用市售的HeLa细胞核提取物作为HDAC酶的来源，将其与不同浓度的JC-5411及Trichostatin(TSA，阳性对照药物)温孵10分钟，以荧光酶标法(ELISA)测定HDAC酶活性。如图5所示，JC-5411能明显地抑制HDAC酶活性。与TSA相比，虽然JC-5411酶抑制活性较TSA弱，但TSA化学及生物学性质极不稳定，并且毒性大，无药物应用价值。相比之下，不仅JC-5411有效，其体内代谢物JC-5411-NAC与其母化合物JC-5411具有相当的酶抑制活性(见图6右半图)。我们亦已证明，与上述诱导组蛋白化学修饰结果相同，JC-5411对HDAC酶活性抑制作用亦强于丁酸钠。由我们上述实验亦可以看出，JC-5411抑制DNA甲基化作用强，所需药物浓度低。但这种须经历至少二个DNA复制过程才能体现，所以需要一定的药物作用时间(5天以上，见图3)。相比之下，JC-5411对调节组蛋白的化学修饰则较快。将细胞以JC-5411处理36小时，药物作用就已非常明显(图5)。应该指出，至今为止，没有一个已知化合物既抑制DNA甲基化又调节组蛋白化学修饰。而我们上述实验已证明JC-5411具有这种双重作用。这是本专利独特之一。实例4，JC-5411诱导癌细胞凋亡材料及方法试剂JC-5411，同实例2。细胞凋亡原位测定试剂盒，购于美国Roche分子生化公司。测定活化了的caspases试剂盒，购于美国Intergen分子生物学试剂公司。实验用其它化学试剂，除特别说明外，均购于美国Sigma化学试剂公司。细胞培养同实例2。细胞凋亡的测定根据DNA链断裂及细胞凋亡形态学差异，我们以文献所述的TUNEL法及荧光标志法，对JC-5411诱导的细胞凋亡进行了测定(27-30)。将对数生长期的人前列腺癌细胞LNCAP，以不同浓度的JC-5411处理48小时后，以4％福尔马林固定制片，再以0.1％Triton透明。然后将细胞与/或不与末端转移酶温孵以作为阴性对照。含有激活了的caspases酶的细胞则以fam-VAD-fmk试剂进行标志，然后再以propidiumiodide进行荧光染色，并采用双比色法测定染色后的细胞。计算caspase阳性细胞频率。结果和讨论我们根据细胞凋亡形态学差异及DNA断裂这二个基本的细胞凋亡特征测定了JC-5411对人前列腺癌细胞LNCAP凋亡的影响。与未处理的对照相比，JC-5411处理24小时后，出现了许多成团的漂浮死细胞。处理二天后，细胞密度明显下降。以0.1μM的JC-5411处理48小时，细胞密度大约下降4-8％，药物浓度增加为20μM时，细胞密度则下降60％。许多细胞在JC-5411作用下，细胞变小，染色质密度增加，出现了明显的细胞凋亡的特征。并且，促进细胞凋亡的BAX基因，在JC-5411作用下4小时后，表达显著增加，并且与DNA断链相平行。图7是以TUNEL法测定的凋亡细胞的百分数。在JC-5411作用后48小时，凋亡细胞随着药物浓度的增加而明显增加。实例5，JC-5411体外抗肿瘤活性的研究材料及方法试剂JC-5411，同实例2。实验用其它化学试剂，除特别说明外，均购于美国Sigma化学试剂公司。细胞培养人前列腺癌细胞LNCAP，同实例2。激素非依赖型前列腺癌细胞AI，由同行馈赠。其它人癌细胞包括人激素非依赖型前列腺癌细胞PC-3，DU145，乳腺癌细胞MCF-7、结肠癌细胞LOVO、肝癌细胞Bel-7402、宫颈癌细胞HeLa、黑色素瘤细胞M-14、胃癌细胞SGC-7901、大鼠乳腺癌细胞SHZ-888，由江南大学提供。按文献所述方法培养(31)。MTT和SRBMTT和SRB实验方法如文献所述(32)。简述如下取对数生长期的癌细胞，接种于96孔板中，细胞密度为每孔2500细胞/200μl。24小时后加入等系列稀释的药物。细胞在药物作用下，继续培养72小时。每孔取出100μl的培养液后，加入50μlMTT[溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide]溶液继续培养4小时。以200μl盐酸-异丙醇溶液溶解紫黑色的甲潜沉淀物，于540nm波长处测定光吸收值。若采用SRB法，则在72小时后，除去所有的培养液，细胞以10％三氯醋酸固定1小时后，置空气中自然干燥24小时，加入50μlSRB(丽丝胺罗丹明B，sulforhodamineB)染色20-30分钟，以1％冰醋酸洗涤5次，置空气中自然干燥后，加入200μl的10mMTris-HCl(pH10.0)溶液溶解紫红色蛋白-SRB复合物，于600nm波长处测定光吸收值。求得各组试验数据的平均值，以实验组对对照组计算得细胞生成抑制率。以SigmaPlot绘图软件绘得细胞生长率-药物浓度半对数曲线，并求得药物的半数有效浓度(IC50)。结果和讨论采用MTT及SRB二种分析方法，我们对JC-5411的抗癌活性进行了研究。表1列出的是JC-5411及其它化疗药物对各种癌细胞的半数有效抑制浓度。图8-10是列举的JC-5411及其它药物对激素依赖型和激素非依赖型前列腺癌细胞LNCAP作用的药效-药物浓度曲线。由表1及图8-9，可以看出，JC-5411具有较强的抗癌活性。对于人前列腺癌细胞，JC-5411的抗癌活性优于临床上最新的抗激素药物Casodex。特别应该指出的是Casodex对激素非依赖型前列腺癌细胞无效。同样激素非依赖型前列腺癌细胞对许多化疗药物耐药，如图10所示，AI细胞对紫杉醇IC50大约增加了50倍。与此相反，无论是激素依赖型，还是激素非依赖型前列腺癌细胞，对JC-5411都很敏感，其半数有效抑制浓度IC50小于1μM(见表1)。另一方面，作为DNA甲基化抑制剂，JC-5411与广泛应用的5’-Aza相比，JC-5411对激素依赖型和激素非依赖型前列腺癌细胞的生长抑制作用都较5’-Aza强。而且由图8，图9都可以看出，在较高浓度的5’-Aza(25μM)作用下，仍然有20％以上的癌细胞能够存活。而在相同的实验条件下，5μM的JC-5411即获得98％的抑制率。与目前临床上十分看好的组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂，SAHA相比，JC-5411对所试癌细胞的抑制作用亦优于SAHA。可见，由于JC-5411具有抑制DNA甲基化和组蛋白脱乙酰基酶的双重作用，其抗癌作用既优于DNA甲基化抑制剂，又优于组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。通过MTT和SRB实验，我们还注意到与其它类型抗癌药相比，JC-5411亦具有其优越性。如其对癌细胞抑制作用比细胞诱导分化剂维甲酸(Retinoidacid，IC5021.5-＞50μM)强得多。JC-5411对激素依赖型前列腺癌细胞LNCAP的抑制作用亦大大强于临床所常用的Casodex(IC5037.4μM)和Proscar(IC5040.6μM)。表1JC-5411对前列腺癌细胞的半数抑制有效浓度(IC50，μM)及与其它化疗药物的比较(MTT法)。虽然与柔红霉素或紫杉醇相比，JC-5411抗癌作用弱些，但前者在有效的药物浓度下即已产生较强的毒副作用，如紫杉醇在血浆药物浓度0.05μM时即产生严重的骨髓抑制。而JC-5411来源于食物，毒性很低。值得指出的是，由图10不难看出，虽然LNCAP细胞对紫杉醇很为敏感，但实验很难测得其IC90，因为不管浓度多大，总有15-20％左右的细胞不敏感。其原因可能是这些细胞在紫杉醇作用下，进入GO期而躲避药物的进一步作用。与之相反，JC-5411有很好的疗效-浓度曲线。这一结果也表明，JC-5411若与紫杉醇不同先后顺序给药，则可能产生显著的协同作用。表2JC5411对结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、黑色素瘤、胃癌、肝癌、大鼠乳腺癌的抑制率及与5-氟脲嘧啶抑制率的比较(MTT法)表2是JC-5411对其它人体肿瘤细胞的生长抑制作用。由表2不难看出，JC-5411对所试癌细胞的生长均有较强的抑制作用。具体地说，JC-5411对乳腺癌、黑色素瘤、肝癌的体外抗肿瘤活性优于阳性对照药物5-氟脲嘧啶；但对结肠癌、宫颈癌、胃癌、大鼠乳腺癌的体外抗肿瘤活性较阳性对照药物5-氟脲嘧啶差。有必要指出的是，阳性对照药物5-氟脲嘧啶的浓度是20μg/ml，这相当于153μM，高于JC-5411的药物浓度。此外，阳性对照药物5-氟脲嘧啶是细胞毒性药物，有明显的副作用。由于该化合物是DNA甲基化和组蛋白脱乙酰基酶的双重抑制剂，而异常的DNA甲基化和组蛋白的化学修饰几乎是所有癌细胞的共同特征，基于我们的实验及其作用的理论原理，我们相信，JC-5411是广谱抗癌药物，即JC-5411不仅仅对本发明所例举的实例中所试肿瘤有效，对其它肿瘤亦有效。实例6，JC-5411体内抗肿瘤活性的研究材料及方法药物JC-5411，同实例2。环磷酰铵及实验用其它化学试剂除特别说明外，均购于美国Sigma化学试剂公司。肿瘤接种及药物处理BALA/c无毛小鼠，雄性，5周龄，购于中国科学院上海动物中心。动物词养于SMP实验室。取人激素非依赖型前列腺癌细胞PC-3，加入Matrigel胶，然后皮下接种于小鼠前腋下，平均每小鼠大约接种1×106细胞。接种24小时后，将动物随机分成3组，每组9只，一组为阴性对照，一组于接种后第5天和第15天腹腔注射环磷酰铵，剂量为60mg/kg，另一组为JC-5411治疗组，每日口服给予JC-5411(灌胃)，剂量为100mg/kg。共治疗6周后，每二周测量肿瘤体积，以公式V＝L×W×H×0.5236计算肿瘤体积。其中L为瘤长径，W为宽径，H为高。每3周称量动物体重。于最后一次给药后24小时，称量动物体重，并将动物处死，取出肿瘤称重，计算肿瘤生成抑制率。结果与讨论免疫缺陷型小鼠被广泛用于人体肿瘤的移植及抗癌药物的研究(33).为了证明JC-5411具有抗癌活性，我们将激素非依赖型人前列腺癌PC-3细胞移植于免疫缺陷型小鼠，观察了JC-5411的抗癌作用。如表3所示，JC-5411在所用剂量下，对激素非依赖型人前列腺癌PC-3细胞具有较强的抑制作用，肿瘤生长抑制率达63％，与阳性对照药环磷酰铵疗效相当。另一方面，环磷酰胺是细胞毒药物，与其它细胞毒类药物一样，具有作用快，作用强的特点，但缺乏选择性。从我们的实验亦可以看出，在所用剂量下，环磷酰胺已出现毒性作用。其表现在与对照组相比，环磷酰胺组动物体重下降了10.9％。与此相反，JC-5411具有很好的选择性，在有效药物剂量下，明显抑制前列腺癌的生成，但动物没有出现明显的毒性反应。用药后动物体重与对照组相比，无任何差别。这与药物最初的设计目标相一致。因此，我们认为JC-5411具有很好的应用前景。表3JC-5411对接种人激素非依赖型前列腺癌PC-3裸鼠抗癌作用(X±SD)a第5日和第15日给药(i.p.)；b每日给药(p.o)；与模型对照组相比，*P＜0.01。参考文献1.Jones，P.A.andBaylin，SB.Thefundamentalroleofepigeneticeventsincancer.NatRgvGenet，3415-428，2002.2.Johnstone，R.W.Histone-deacetylaseinhibitorsnoveldrugsforthetreatmentofcancer.NatRevDrugDiscov，1287-299，2002.3.Nakagawa，H.，Nuovo，G.J.，Zervos，E.E.，Martin，E.W.，Jr.，Salovaara，R.，Aaltonen，L.A.，anddelaChapelle，A.Age-relatedhypermethylationofthe5′regionofMLH1innormalcolonicmucosaisassociatedwithmicrosatellite-unstablecolorectalcancerdevelopment.CancerRes，616991-6995，2001.4.Palmisano，W.A.，Divine，K.K.，Saccomanno，G.，Gilliland，F.D.，Baylin，S.B.，Herman，J.G.，andBelinsky，S.A.Predictinglungcancerbydetectingaberrantpromotermethylationinsputum.CancerRes，605954-5958，2000.5.Singal，JR.，vanWert，J.，andBashambu，M.CytosinemethylationrepressesglutathioneS-transferaseP1(GSTP1)geneexpressioninhumanprostatecancercells.CancerRes，614820-4826，2001.6.Maruyama，R.，Toyooka，S，Toyooka，K.O.，Virmani，A.K.，Zochbauer-Muller，S.，Farinas，A.J.，Minna，J.D.，McConnell，J.，Frenkel，E.P.，andGazdar，A.F.Aberrantpromotermethylationprofileofprostatecancersanditsrelationshiptoclinicopathologicalfeatures.ClinCancerRes，8514-519，2002.7.Woodson，K.，Gillespie，J.，Hanson，J.，Emmert-Buck，M，Phillips，J.M.，Linehan，W.M.，andTangrea，J.A.Heterogeneousgenemethylationpatternsamongpre-invasiveandcancerouslesionsoftheprostate.ahistopathologicstudyofwholemountprostatespecimens.Prostate，6025-31，2004.8.Costello，J.F.，andPlass，C.Methylationmatters.JMedGenet，38285-303，2001.9.Esteller，M.CpGislandhypermethylationandtumorsuppressorgenesaboomingpresent，abrighterfuture.Oncogene，215427-5440，2002.10.Kopelov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5411类化合物，无论是天然的还是人工合成的，既能直接抑制基因起动子/5－UTR区CpGDNA的甲基化，又能直接抑制组蛋白脱乙酰基酶(histonedeacethylases，HADC)的活性，有选择性地促进组蛋白乙酰化和甲基化，进而使癌细胞中被异常关闭的一些具有重要功能的基因恢复表达，发挥其正常功能，使癌细胞的恶性增殖得以控制，从而能有效地抑制包括结肠癌，胃癌，肺癌，前列腺癌，肝癌，乳腺癌，结肠癌，宫颈癌，黑色素瘤和神经母细胞瘤等多种人体肿瘤细胞生长。与已知的DNA甲基化抑制剂及天然或是人工合成的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂相比较，该系列化合物是独一无二的双重抑制剂，且具有抗癌作用强，毒副作用低，生物学性质稳定，可用于治疗和预防各种恶性肿瘤。文档编号A61K9/00GK1724516SQ20051004086公开日2006年1月25日申请日期2005年6月30日优先权日2005年6月30日发明者王龙贵,乔仁伟,程景才申请人:无锡杰西医药科技有限公司