专利名称：一种异硫氰酸酯类化合物的制备方法
技术领域：
本发明属于生物化工技术领域，涉及十字花科蔬菜中天然产物有效成分的制备工艺。具体为一种以萝卜籽(中药名称莱菔子)、萝卜籽芽苗、西兰花球茎、西兰花籽芽苗和西兰花籽为原料制备异硫氰酸酯类化合物的工艺方法。
背景技术：
据世界卫生组织统计，全球每年因癌症死亡的人数已经达到上千万；近几年来，我国癌症患者的数目也在大幅度的增加，癌症已经成为人类不容忽视的一种疾病。研究表明十字花科蔬菜具有很好的抗癌、防癌效果，长期大量食用十字花科蔬菜的人群的癌症发病率明显低于不食用或小量食用的人群，原因在于这些十字花科蔬菜中富含硫代葡萄糖苷(硫苷)。其能被十字花科蔬菜自身细胞内的黑芥子硫苷酸酶催化水解，并在特定PH范围内进行分子内重排，最终形成了具有良好抗癌、防癌作用效果的异硫氰酸酯类化合物。 异硫氰酸酯类化合物广泛存在于人们日常食用十字花科蔬菜中，例如萝卜、西兰花、甘蓝、芥菜和辣根等十字花科蔬菜。西兰花中富含的莱菔硫烷(Sulforaphane，也称萝卜硫素，分子式为C6H11NOS2)和萝卜中富含的莱菔素(Sulforaphene，也称莱菔子素，分子式为C6H9NOS2)就是异硫氰酸酯类物质，且都是不具有任何细胞毒性的。据研究报道，莱菔硫烷的抗癌作用机理是诱导PhaseII解毒酶的产生，促使癌细胞发生快速凋亡，从而达到抗癌、防癌效果。不仅具有抗癌、防癌作用效果，莱菔硫烷还具有很好的抗氧化及抑制并杀死幽门螺杆菌的生物活性。莱菔素作为莱菔硫烷的结构类似物，它们在化学结构上只有一个双键的差别。化学结构式如下
I)Il
Oo
Sul foraphaneSul foraphene据相关研究报道，莱菔素也具有与莱菔硫烷相似的药理活性，如抗癌、防癌、促进癌细胞凋亡、抗氧化、抑制并杀死幽门螺杆菌等生物活性，甚至还有莱菔硫烷所不具有的抗突变生物活性。目前，关于莱菔硫烷的制备工艺方法已有研究报道，例如专利名称为“一种莱菔硫烷的制备方法(CN1982294)”，“一种萝卜硫素的提取方法(CN101544995) ”，“一种提取萝卜硫素的方法(CN101143842)”，“一种从西兰花芽苗菜中提取多功能莱菔硫烷的方法(CN101514174) ”和“一种从花椰菜叶片中提取萝卜硫素的方法(CN102102113) ”均涉及到莱菔硫烷(也称萝卜硫素)的制备工艺方法。但这些工艺方法都是在PH值为5-8的条件下，将莱菔硫烷前体4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷利用黑芥子硫苷酸酶水解并分子内重排生成莱菔硫烷的，而处在水解反应体系中的莱菔硫烷却不是很稳定，在生成莱菔硫烷的同时，莱菔硫烷自身也在不停的快速降解，这样就降低了莱菔硫烷的水解转化产率。同时这些工艺中，通过有机溶剂萃取，直接从水解液中萃取得到莱菔硫烷粗产品，这样浪费了大量的有机溶剂和能源(用于回收有机溶剂)，也大大提高了莱菔硫烷的生产成本，因此，这些工艺方法只限于实验规模制备少量莱菔硫烷产品，大规模的工业化生产难以实现。近几年来，国内外对于莱菔硫烷进行了比较深入的研究，但是关于莱菔硫烷结构类似物莱菔素的研究才刚刚起步，相关研究也只是报道了莱菔素具有某种生物活性，对于莱菔素的制备工艺及水解转化条件的控制还没有建立一个完善的体系。
发明内容
本发明专利的目的是提供一种从十字花科蔬菜的种子、种子芽苗、花、茎、叶、根中制备异硫氰酸酯类化合物的工艺方法，以克服现有工艺技术的诸多缺点，提高异硫氰酸酯类化合物的水解转化产率，减少异硫氰酸酯类化合物的流失，简化工艺步骤，提高异硫氰酸酯类化合物的总体工艺产率，降低异硫氰酸酯类化合物制备成本，实现异硫氰酸酯类化合物的大规模工业化生产。原料经过的粉碎或匀浆后，利用十字花科蔬菜自身的黑芥子硫苷酸酶在pH值为 6-8的缓冲溶液中水解，并加入特定的终止剂终止异硫氰酸酯类化合物在水解反应体系中的降解反应，采用树脂吸附，去离子水和乙醇体积百分含量为10% -25%的乙醇的水溶液洗脱除杂，乙醇体积百分含量为60% -90%的乙醇的水溶液洗脱异硫氰酸酯类化合物，采用乙酸乙酯萃取异硫氰酸酯类化合物浓缩液得到异硫氰酸酯类化合物产品，从而高效率的提高了异硫氰酸酯类化合物的水解转化产率，产品纯度和总体工艺产率，大大降低了生产成本，实现了异硫氰酸酯类化合物的工业化生产。本发明的原料为十字花科蔬菜，包括，但不仅限于，萝卜、甘蓝、西兰花、芥菜、辣根，本方法使用于以十字花科蔬菜的种子、种子芽苗、花、茎、叶、根等组织作为原料。对于本方法优选的十字花科蔬菜是萝卜和西兰花，最优选的原料是萝卜籽、萝卜籽芽苗、西兰花籽、西兰花籽芽苗和西兰花球茎。一种异硫氰酸酯类化合物的制备方法，其特征在于包括如下具体步骤和工艺条件(I)以十字花科蔬菜的种子、种子芽苗、花、茎、叶、根为原料，粉碎或匀浆后，加入质量为5-20倍的pH值为6-8的缓冲溶液，在5°C _50°C条件下进行搅拌水解反应。(2)水解10-300分钟后，加入异硫氰酸酯类化合物降解反应终止剂，终止水解反 应生成的异硫氰酸酯类化合物的降解反应。(3)将上一步水解反应得到水解混合物，通过离心或过滤操作进行固液分离，收集澄清的水解液。(4)将上一步所得到的水解液，用树脂进行吸附处理，采用去离子水和乙醇体积百分含量为10% -25%的乙醇的水溶液洗脱除杂，乙醇体积百分含量为60-90%的乙醇的水溶液洗脱异硫氰酸酯类化合物，收集洗脱液，减压蒸馏回收乙醇，得到异硫氰酸酯类化合物浓缩液。(5)将上一步得到的异硫氰酸酯类化合物浓缩液，利用浓缩液体积1-3倍的乙酸乙酯萃取3-5次，收集异硫氰酸酯类化合物萃取液，减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到干燥的异硫氰1 Ife酷类化合物广品。上述异硫氰酸酯类化合物的制备工艺方法中，步骤(I)所采用的十字花科蔬菜为脱脂或未脱脂的萝卜籽或西兰花籽，萝卜籽芽苗、西兰花籽芽苗和西兰花球茎；所采用的缓冲溶液为磷酸盐、柠檬酸盐或醋酸盐缓冲溶液。上述异硫氰酸酯类化合物的制备工艺方法中，步骤(2)所采用的异硫氰酸酯类化合物降解反应终止剂为盐酸、硝酸、甲酸、乙酸、硫酸、磷酸或三氯乙酸，优选为盐酸。当利用萝卜籽或萝卜籽芽苗水解生成莱菔素时，盐酸在水解反应10-120分钟后加入，优选时间为20-40分钟；盐酸加入量以水解反应体系的pH值变为1-4时为基准，优选水解反应体系pH值变为2-3时的盐酸加入量。当利用西兰花籽、西兰花芽苗或西兰花球茎水解生成莱菔硫烷时，盐酸在水解反应60-300分钟后加入，优选时间为120-180分钟；盐酸加入量以水解反应体系的PH值变为1-4时为基准，优选水解反应体系pH值变为2-3时的盐酸加入量。上述异硫氰酸酯类化合物的制备工艺方法中，步骤(4)和(5)所采用的减压蒸馏的真空度低于0. 09Mpa，温度为30-50°C，优选为35_45°C。发明效果本发明将十字花科蔬菜的种子、种子芽苗、花、茎、叶、根粉碎或匀浆后，利用蔬菜组织细胞特有的黑芥子硫苷酸酶在PH值为6-8的条件下水解，水解反应完成后，加入特定的终止剂终止异硫氰酸酯类化合物降解反应的进行，采用树脂吸附，去离子水和低浓度乙醇的水溶液洗脱除杂，高浓度乙醇的水溶液洗脱异硫氰酸酯类化合物，采用乙酸乙酯萃取异硫氰酸酯类化合物浓缩液得到异硫氰酸酯类化合物产品。本发明工艺方法采用的原料易得，适用范围广，通过加入异硫氰酸酯类化合物降解反应终止剂提高了异硫氰酸酯类化合物的水解转化产率及总体工艺产率，与现有最佳工艺对比，莱菔硫烷总体工艺产率提高了15%左右，莱菔素总体工艺产率提高了 80%左右；通过采用树脂吸附大大提高了异硫氰酸酯类化合物产品的纯度及收率，降低了生产成本，简化了制备工艺过程，易于工业化放大生产。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明的工艺技术方案作进一步的描述，但，这些实施例并不构成对本发明要求保护范围的限制。实施例I :(I)称取2. 5kg的萝卜籽，粉碎机粉碎，加入25L的pH值为7.0的磷酸二氢钾/磷酸氢二钾缓冲溶液，在5°C条件下搅拌水解20分钟后，加入盐酸调整溶液pH值至2. 0终止莱菔素的降解反应。(2)将水解混合物在减压条件下用滤布过滤，收集水解液。(3)将水解液用树脂进行吸附，选用柱体积为I. 5L的普通层析柱，控制水解液流速为15mL/min,水解液吸附完成后,在流速为20mL/min的条件下,先后用4. 5L去离子水和4. 5L 20%乙醇的水溶液洗脱除去杂质。用8. OL 60%乙醇的水溶液洗脱莱菔素，收集莱菔素洗脱液。用4. 5L 90%乙醇的水溶液和4. 5L去离子水进行洗脱再生树脂柱，以便，下一次莱菔素的吸附洗脱。(4)在温度为40°C，真空度为0. 085MPa条件下，将收集得到的莱菔素洗脱液减压蒸馏回收乙醇后，得到莱菔素浓缩液I. 5L，用I. 5L的乙酸乙酯萃取3次，收集莱菔素萃取液，在温度为35°C，真空度为0. 085MPa条件下，减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到干燥的莱菔素产品，莱菔素纯度为68. 5 %，产品回收率为85.7%。实施例2 (I)称取2. 5kg的萝卜籽，粉碎机粉碎，加入25L的pH值为6.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液，在25°C条件下搅拌水解30分钟后，加入硫酸调整溶液pH值至2. 0终止莱菔素的降解反应。(2)将水解混合物在减压条件下用滤布过滤，收集水解液。(3)将水解液用树脂进行吸附，选用柱体积为I. 5L的普通层析柱，控制水解液流速为15mL/min,水解液吸附完成后,在流速为20mL/min的条件下,先后用4. 5L去离子水和4. 5L 20%乙醇的水溶液洗脱除去杂质。用8. OL 60%乙醇的水溶液洗脱莱菔素，收集莱菔素洗脱液。用4. 5L 90%乙醇的水溶液和4. 5L去离子水进行洗脱再生树脂柱，以便，下一次莱菔素的吸附洗脱。 (4)在温度为40°C，真空度为0. 085MPa条件下，将收集得到的莱菔素洗脱液减压蒸馏回收乙醇后，得到莱菔素浓缩液I. 2L，用I. 2L的乙酸乙酯萃取3次，收集莱菔素萃取液，在温度为35°C，真空度为0. 085MPa条件下，减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到干燥的莱菔素产品，莱菔素纯度为67. 0 %，产品回收率为86. 5 %。实施例3 (I)称取2kg发芽生长了 5天的萝卜籽芽苗，加入IOL的pH值为6. 5的柠檬酸/磷酸氢二钠缓冲溶液，匀浆机匀浆，在25°C条件下搅拌水解40分钟后，加入硫酸调整溶液pH值至3. 0终止莱菔素的降解反应。(2)将水解混合物在减压条件下用滤布过滤，收集水解液。(3)将水解液用树脂进行吸附，选用柱体积为0. 5L的普通层析柱，控制水解液流速为10mL/min,水解液吸附完成后,在流速为15mL/min的条件下,先后用I. 5L去离子水和1.5L 20%乙醇的水溶液洗脱除去杂质。用3L 60%乙醇的水溶液洗脱莱菔素，收集莱菔素洗脱液。用I. 5L 90%乙醇的水溶液和I. 5L去离子水进行洗脱再生树脂柱，以便，下一次莱菔素的吸附洗脱。(4)在温度为40°C，真空度为0. 085MPa条件下，将收集得到的莱菔素洗脱液减压蒸馏回收乙醇后，得到莱菔素浓缩液0. 5L，用0. 5L的乙酸乙酯萃取3次，收集莱菔素萃取液，在温度为35°C，真空度为0. 085MPa条件下，减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到干燥的莱菔素产品，莱菔素纯度为18. 5%，产品回收率为88. 5 %。实施例4 (I)称取2. 5kg的西兰花籽，粉碎机粉碎，加入25L的pH值为6. O的醋酸盐缓冲溶液，在25°C条件下搅拌水解2小时后，加入盐酸调整溶液pH值至2. O终止莱菔硫烷的降解反应。(2)将水解混合物在减压条件下用滤布过滤，收集水解液。(3)将水解液用树脂进行吸附，选用柱体积为I. 5L的普通层析柱，控制水解液流速为15mL/min,水解液吸附完成后,在流速为20mL/min的条件下,先后用4. 5L去离子水和4. 5L 20%乙醇的水溶液洗脱除去杂质。用8. OL 60%乙醇的水溶液洗脱莱菔硫烷，收集莱菔硫烷洗脱液。用4. 5L 90%乙醇的水溶液和4. 5L去离子水进行洗脱再生树脂柱，以便，下一次莱菔硫烷的吸附洗脱。
(4)在温度为40°C，真空度为0. 08MPa条件下，将收集得到的莱菔硫烷洗脱液减压蒸馏回收乙醇后，得到莱菔硫烷浓缩液I. 0L，用I. OL的乙酸乙酯萃取3次，收集莱菔硫烷萃取液，在温度为35°C，真空度为0. 085MPa条件下，减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到干燥的莱菔硫烷产品，莱菔硫烷纯度为70. 6 % ，产品回收率为85.0%。实施例5 (I)称取2kg生长了 5天的西兰花籽芽苗，加入25L的pH值为7. 0的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液，匀浆机匀浆，在50°C条件下搅拌水解3小时后，加入硫酸调整溶液pH值至2. 0终止莱菔硫烷的降解反应。(2)将水解混合物在减压条件下用滤布过滤，收集水解液。(3)将水解液用树脂进行吸附，选用柱体积为0. 5L的普通层析柱，控制水解液流速为10mL/min。水解液吸附完成后,在流速为20mL/min的条件下,先后用I. 5L去离子水和1.5L 20%乙醇的水溶液洗脱除去杂质。用3L 60%乙醇的水溶液洗脱莱菔硫烷，收集莱菔硫烷洗脱液。用I. 5L 90%乙醇的水溶液和I. 5L去离子水进行洗脱再生树脂柱，以便，下一次莱菔硫烷的吸附洗脱。(4)在温度为40°C，真空度为0. 085MPa条件下，将收集得到的莱菔硫烷洗脱液减压蒸馏回收乙醇后，得到莱菔硫烷浓缩液0. 8L，用0. 8L的乙酸乙酯萃取3次，收集莱菔硫烷萃取液，在温度为35°C，真空度为0. OSMPa条件下，减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到干燥的莱菔硫烷产品，莱菔硫烷纯度为20. 6 %，产品回收率为89. I %。实施例6 (I)称取2. 5kg的西兰花球茎，加入12. 5L的pH值为7. O的磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲溶液，匀浆机匀浆，，在25°C条件下搅拌水解2小时后，加入盐酸调整溶液pH值至
2.O终止莱菔硫烷的降解反应。(2)将水解混合物在减压条件下用滤布过滤，收集水解液。(3)将水解液用树脂进行吸附，选用柱体积为0. 5L的普通层析柱，控制水解液流速为15mL/min。水解液吸附完成后,在流速为15mL/min的条件下,先后用I. 5L去离子水和1.5L 20%乙醇的水溶液洗脱除去杂质。用3L 60%乙醇的水溶液洗脱莱菔硫烷，收集莱菔硫烷洗脱液。用I. 5L 90%乙醇的水溶液和I. 5L去离子水进行洗脱再生树脂柱，以便，下一次莱菔硫烷的吸附洗脱。(4)在温度为40°C，真空度为0. 085MPa条件下，将收集得到的莱菔硫烷洗脱液减压蒸馏回收乙醇后，得到莱菔硫烷浓缩液0. 5L，用0. 5L的乙酸乙酯萃取3次，收集莱菔硫烷萃取液，在温度为35°C，真空度为0. 085MPa条件下，减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到干燥的莱菔硫烷产品，莱菔硫烷纯度为10. 3 %，产品回收率为89. 5 %。
权利要求
1.一种异硫氰酸酯类化合物的制备方法，以十字花科蔬菜为原料，依 次包括以下工艺步骤 (1)将十字花科蔬菜种子、种子芽苗、花、茎、叶、根，粉碎或匀浆后，加入5-20倍体积的PH值为6-8的磷酸盐、柠檬酸盐或醋酸盐缓冲液，在5°C _50°C条件下搅拌水解10-300分钟后，加入终止剂终止异硫氰酸酯类化合物在水解反应混合物中的降解反应；终止剂为盐酸、硝酸、甲酸、乙酸、硫酸、磷酸或三氯乙酸； (2)将步骤(I)得到的水解混合物通过过滤或离心进行固液分离后，利用树脂进行吸附，吸附完成后，用2-8倍树脂柱体积的去离子水及2-8倍树脂柱体积的乙醇体积百分含量不超过25%的乙醇/水溶液洗脱杂质，再用乙醇体积百分含量不低于60%的乙醇/水溶液洗脱异硫氰酸酯类化合物，收集异硫氰酸酯类化合物洗脱液，减压蒸馏回收乙醇，得到异硫氰酸酯类化合物浓度大于15mg/ml的浓缩液； (3)利用乙酸乙酯萃取步骤(2)得到异硫氰酸酯类化合物浓缩液，乙酸乙酯加入量为异硫氰酸酯类化合物浓缩液体积的O. 5-5倍，萃取3-5次，收集异硫氰酸酯类化合物萃取液，减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到干燥的异硫氰酸酯类化合物产品。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征是步骤⑴中所说的十字花科蔬菜为萝卜籽、萝卜籽芽苗、西兰花籽、西兰花籽芽苗或西兰花球茎。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征是步骤(I)中所说的终止剂为盐酸，盐酸加入量以水解反应体系的PH值变为1-4时为基准。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是当利用萝卜籽或萝卜籽芽苗水解生成莱菔素时，盐酸在水解反应10-120分钟后加入，盐酸加入量以水解反应体系的pH值变为2-3时为基准。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征是当利用西兰花籽、西兰花芽苗或西兰花球茎水解生成莱菔硫烷时，盐酸在水解反应60-300分钟后加入；盐酸加入量为使水解反应体系PH值变为2-3时的盐酸用量。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征是步骤(2)中所说的去离子水选用3-6倍树脂柱体积的用量；洗脱杂质的乙醇/水溶液中乙醇体积百分含量为10% -25%，选用3-6倍树脂柱体积的用量；洗脱异硫氰酸酯类化合物的乙醇/水溶液中乙醇体积百分含量为60% -90%,选用5-8倍树脂柱体积的用量。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征是步骤(3)中所说的乙酸乙酯，其用量为异硫氰酸酯类化合物浓缩液体积的1-3倍。
全文摘要
一种异硫氰酸酯类化合物的制备方法属于生物化工技术领域。本发明公开了一种以十字花科蔬菜为原料制备异硫氰酸酯类化合物的方法。一种异硫氰酸酯类化合物的制备方法，包括以下步骤1. 将十字花科蔬菜的种子、种子芽苗、花、茎、叶、根充分粉碎或匀浆后，在pH值为6-8的条件下进行水解；2. 加入特定的终止剂终止异硫氰酸酯类化合物的降解反应; 3. 利用树脂吸附，乙醇与水的混合溶液洗脱异硫氰酸酯类化合物，减压蒸馏得到异硫氰酸酯类化合物浓缩液；4. 利用乙酸乙酯萃取，减压蒸馏得到异硫氰酸酯类化合物产品。本方法优化了现有异硫氰酸酯类化合物的制备方法，提高了水解转化效率及总体制备产率，大大降低了工业化生产成本。
文档编号C07C331/22GK102659651SQ201210093730
公开日2012年9月12日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者伊锐, 况鹏群, 周沫, 宋丹, 梁浩, 袁其朋 申请人:北京化工大学