专利名称：红色诺卡放线菌细胞壁骨架制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制剂，特别是红色诺卡放线菌细胞壁骨架制剂，是治疗宫颈糜烂患者首选的外用药物。
使用的微生物用来生产本发明所述产品的是一种属于诺卡氏菌所属的菌株，其具有生产红色诺卡放线菌细胞骨架制剂的能力。红色诺卡放线菌(Nocardia rubra)Nr-8026(以下简称Nr-8026菌株)就具有上述特性，适于生产本发明所述的产品。该菌株经在甘油琼脂培养基上，33℃培养5天而得，其于2002年2月5日在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.0712。
Nr-8026菌株的菌学特征1、菌落形态特征在甘油琼脂培养基上，33℃培养48小时，菌落隆起，呈桔红色，表面干燥皱起，外观呈砂粒状，略有光泽。接种环接触易碎。显微镜下观察菌体呈分枝状有横隔膜，形成纤细的菌丝体。整个菌丝分裂成规则的柱形短粗细胞，培养5天菌体成短杆状和球形。
2、染色性革兰氏染色阳性，抗酸染色阴性。
3、生化特性取甘油琼脂斜面培养基上经33℃，48小时培养的培养物接种于以下各种培养基内，经33℃，24小时后开始观察结果，连续观察8天，生化反应见下表红色诺卡放线菌生化反应结果 符合以上标准者可用于生产[注]+阳性产酸-阴性培养与提取方法用红色诺卡氏菌属通过常规的微生物生产方法，可以培养Nr-8026菌株，并经传代、扩增、超声波粉碎，提取获得该细胞壁骨架，酶纯化、有机溶剂除脂后，再加入适量的赋形剂后冻干制成。其培养方式既可为固体培养，也可为液体培养。
对培养基中的营养源并无特殊的规定，可使培养基中含有通常用于微生物培养的碳源、氮源及其它营养源。其中碳源可为淀粉、糊精、甘露醇、蔗糖、甘露糖、乳糖、山梨醇、麦牙糖、福寿草醇等。氮源可为肉膏、蛋白胨、铵盐、硝酸盐以及其它有机或无机含氮化合物。至于其它营养源则可适当添加一些无机盐类。例如食盐、磷酸盐类。
对温度、时间等培养条件并无严格的限制，以利于使用菌的生长为准，并以选择使其产量最高的条件为好。例如培养基的PH值以接近中性为好，培养温度宜在22-37℃，当然这些培养基的组分、氢离子浓度、培养温度等均应根据所使用的菌株不同及外部条件等进行适当的调节，以获得最好的效果。
通过常规培养微生物的方法，将Nr-8026菌株接种在甘油琼脂基上培养菌种，经检定合格的菌种增菌培养、菌体收集、细胞粉碎后经酶纯化、除脂后即为本发明产品的有效成分细胞壁骨架，添加药用微生物制剂所能接受的赋形剂，如右旋糖酐40，灌装后冻干即为成品。本产品每瓶为0.5ml，其组成与配比如下红色诺卡放线菌细胞壁骨架 60μg右旋糖酐4015mg经检测其质量指标见下表
本发明与现有技术相比，由于是利用微生物的细胞壁骨架做为有效成分，制成的生物制剂，该细胞壁骨架是一种免疫增强剂，它能增强机体抗肿瘤作用和对某些病毒和细菌感染具有保护作用，增强巨噬细胞的吞噬能力并被一系列的实验和医院临床实验所证明，对适应症取得了令人满意的疗效，治愈率达88％，总有效率达100％，对正常组织无损伤、无毒、安全性好，副作用小，是一种高效、安全、使用简便，成本低，取代进口的治疗宫颈摩烂的外用药物。
本发明所使用的红色诺卡放线菌Nr-8026，于2002年2月5日在北京中关村，中国微生物保藏管理中心普通微生中心保藏，登记入册编号CGMCCNo.0712，并经检测表明所寄存的菌株存活，无失活者。
1、一般药理试验1)、用相当于临床剂量的20、40、80倍静脉注射后，对麻醉猫血压、呼吸、心率和心电均未产生明显影响；2)、用相当于临床剂量的1000倍静脉注射后，对小鼠的协调运动和学习记忆功能未产生明显的影响。
从而可见本发明的制剂对动物精神、神经系统、心血管系统、呼吸系统均无明显影响。
2、安全试验(无菌、毒性)1)、无菌试验结果阴性，证明无菌试验合格；2)、通过小白鼠急性毒性试验实验组分别以皮下注射及腹腔注射方式给药，其剂量是人用量的5倍，对照组以无菌生理盐水0.5ml/支代替品，连续观察7-8天，小鼠状态良好，体重均较注射前增加，均无异常，剖检小鼠各脏器均无异常变化，毒性试验合格。
3、长期毒性试验高于临床剂量30倍，每日一次，连续阴道给药三个月，未发现狗有毒性作用，心电图、各项血液生化及血液指标均在正常范围内与给药前比较均未发现明显毒性变化，停药两周后，留待观察的狗各项指标亦正常，未见到延迟毒性反应，从而表明本发明的产品在所用剂量，时间范围内无毒性作用。
4、药品稳定性试验在生产工艺无改变情况下，药品在常温下，放置1、2、3个月、8个月、14个月，21个月时，该制剂中含有的丙氨酸、胞壁酸其含量与该产品生产当月时相比无明显差异，从而说明该条件下，产品的稳定性很好；又通过效力试验表明与该三批当月时的吞噬率和吞噬指数均无明显变化，表明产品稳定性很好，冻干后可常温保存二年。
5、免疫力试验表明免疫吞噬鸡红细胞能力很强，其吞噬率为59-74.4％，吞噬指数0.6---0.9而右旋糖酐40其吞噬率和吞噬指数较生理盐水都低，从而说明本发明的产品免疫吞噬能力很强，而右旋糖酐40、生理盐水无此作用。
2、 宫颈有糜烂，已除外癌变者。
3、 月经规律周期不少于25天者。
4、 能坚持完成疗程者。
5、 受试期间不用其他治疗方法。(二)受试对象排除条件1、 阴道细胞学涂片检查结果为IIB以上者。
2、 宫颈有癌变者。
3、 有各种阴道炎或急性、亚急性盆腔炎者。
4、 产后3个月以内。
5、 多种药物有过敏史者。(三)受试对象例数总共75例，按2∶1随机表分配在试验组上50例，对照组25例。(四)使用的药物和方法1、试验组药物为红色诺卡放线菌细胞壁骨架制剂(以下简称诺卡擦剂)，规格为每安瓶内含细胞壁骨架(以下简称Nr-CWS)60μg冻干粉，为申请人单位的研制品，批号950321。
使用方法除去宫颈表面分泌物后，用2.0ml生理盐水溶解诺卡擦剂60μg冻干粉后，用药物浸湿无菌带尾绳棉球置于宫颈糜烂处，24小时后由患者自行取出。每周上药2次，共6次。2、对照组药物为爱宝疗浓缩液，每克含爱宝疗360mg，为德国BYK公司产品，批号J940475。
使用方法首先用1∶5稀释液冲洗宫颈，用纱布块清除宫颈粘液及阴道内分泌物，然后将浸透浓缩液的棉花块紧贴糜烂处三分钟后即取出，此时糜烂面全已变白。上述治疗每周二次，共6次。
试验组和对照组均于月经干净后2-3天开始治疗。(五)宫颈糜烂诊断标准1、分度轻度糜烂面小于整个宫颈面积的1/3。中度糜烂面占整个宫颈面积的1/3-2/3。重度糜烂面占整个宫颈面积的2/3以上。2、分型按糜烂深浅程度分为单纯型糜烂表面平滑。颗粒型糜烂表面呈乳头状突起，不平。(六)观察事项1、用药前(1)常规询问病史，做妇科检查。(2)阴道分泌物检查清洁度，分为I、II、III度，查滴虫霉菌。(3)做阴道细胞学涂片检查，除外癌变。(4)目测宫颈糜烂面积，按诊断标准进行分度，分型。(5)查血、尿常规，肝功能(GPT或ALT)肾功能(BUN、Cr)。(6)安排专人进行治疗和观察，以便统一标准。2、用药期间(1)治疗期间建议患者避免性生活。(2)询问药物的全身和局部的不良反应情况。(3)每次上药前注意观察外阴、阴道局部的不良反应，白带变化(性状和量)。宫颈糜烂局部变化(范围和深度)。3、治疗后下次月经后来复查，继续询问症状，观察宫颈糜烂局部变化(包括面积和深浅)，阴道分泌物量和性状变化，并进行疗效判定。最后一次上药后，重复治疗前阴道的细胞学检查和实验室检查(血、尿常规，肝、肾功能)。(七)疗效判定标准痊愈糜烂面消失，宫颈光滑，症状消失。有效上下唇糜烂面直径缩小2mm，变浅，症状减轻。无效自觉症状和体征无改变。恶化；糜烂面扩大，变深，症状加重。(八)数据处理和统计方法统一方案，统一表格，统一数据处理。统计方法为X2检验。
结果1、基本情况比较门诊宫颈糜烂患者按随机表50例应用诺卡擦剂治疗为试验组，25例应用爱宝疗治疗为对照组。两组受试对象的年龄、初潮年龄、孕次、产次等基本情况见表1。表1受试对象的年龄、初潮年龄、孕次、产次的比较年龄 初潮孕次产次例数 均值标准差 均值标准差 均值 标准差 均值 标准差实验组 50 35.886.88 14.140.951.240.480.94 0.24对照组 25 34.445.87 14.160.941.160.371.00两组间P＝0.3737 P＝0.9315 P＝0.4349P＝0.2205差异的显著性两组间年龄最小24岁，最大45岁，由上表可见两组受试对象基本情况无显著性差异，具有可比性(P＞0.005)。
2、临床表现2.1两组患者宫颈糜烂分度，分型情况见表2、表3。表2 两组患者宫颈糜烂分度、分型比较用药前 第三次复查轻度中度 重度正常轻度 中度重度试验组21 24 5 44 6对照组8 10 7 19 5 1试验组用药前与第三次复查的显著性检验(精确概率)(P＜0.01)。对照组同试验组相似(P＜0.01)。详见表11，下同。
由上表可见试验组轻度占42％，中度占48％，重度占10％，对照组轻度占32％，中度占40％，重度占24％。治疗后试验组宫颈正常占88％，轻度占12％，对照组宫颈正常占76％，轻度占20％，中度占4％，从糜烂度所占有的百分比上看试验组疗效优于对照组。表3宫颈糜烂分型的对比用药前第三次复查单纯型 颗粒型 乳头型正常单纯型 颗粒型 乳头型试验组 30 17 3 442 3 1对照组 10 11 4 192 2 2注宫颈糜烂分度及分型两表中“正常”一项是针对疗效中填入“0”而设计的。试验组用药前与第三次复查的显著性检验(精确概率)(P＜0.01)。对照组与试验组相似(P＜0.01)。
由表3可见(1)治疗前试验组单纯型占60％，颗粒型占34％，乳头型占6％。对照组单纯型占40％，颗粒型占44％，乳头型占16％。治疗后试验组单纯型占4％，颗粒型占6％，乳头型占2％，正常者为88％。对照组单纯型占4％，颗粒型占4％，乳头型占8％，正常占76％。试验组疗效优于对照组。
2.2用药前后白带量、白带性状见表4、表5表4白带量的对比用药前 第一次复查 第二次复查 第三次复查正常 稍多 很多 正常 稍多 很多 正常 稍多 很多 正常 稍多 很多试验组 27 212 454 1 50 50对照组 13 7 5 186 1 21 4 23 2
试验组用药后与第三次复查的显著性检验(精确概率)(P＜0.01)。对照组与试验组相似(P＜0.01)。由上表可见(1)治疗前试验组中白带量正常者占54％，稍多占42％，很多占4％。对照组正常占52％，稍多占28％，很多占20％。(2)治疗后白带量正常占100％，无稍多或很多。对照组正常占92％，稍多占8％。试验组或对照组在治疗前后白带量有非常显著差异(P＜0.01)，两组中白带量所占百分比看，试验组对白带量的改善上优于对照组(第二次复查试验组正常者占100％，第一次复查正常者占90％，而对照组正常者分别为72％、82％)。表5白带性状的对比用药前 第一次复查 第二次复查第三次复查正常 脓性正常 脓性 正常 脓性正常 脓性试验组 446 482 491 491对照组 187 232 25 25试验组用药前与第三次复查的显著性检验(精确概率)(P＜0.01)。对照组与试验组相似(P＜0.01)。
由表5看(1)治疗前试验组白带正常占88％，脓性占12％，对照组白带正常占72％，脓性占24％。治疗后试验组白带正常占98％，脓性占2％，对照组白带正常占100％。由此可见，两组在治疗前后白带性状改善上均存显著差异(P＜0.01)。试验组在改善白带性状上正常者为98％，对照组为100％，两者无差异(P＞0.05)。白带量和性状常为患者主诉症状，估计与此有关。
2.3阴道清洁度，宫颈涂片，巴氏分级见表6表6阴道清洁度，宫颈涂片，巴氏分级阴道清洁度 巴氏分级用药前第三次复查用药前 第三次复查I度 II度 III度 I度 II度 III度 I度 II度 III度 I度 II度 III度试验组 2228 473 3020491对照组 1411 232 131225经统计两组间阴道清洁度和宫颈涂片巴氏分级，在治疗前生P值均小于0.01，差异均非常显著。提示药物的安全性和实用价值。
3、疗效评定见表7表7疗效评定痊愈 有效 无效试验组 44 60对照组 19 60
从表7可见试验组治愈率占88％，有效率占12％，总有效率100％，对照组痊愈率占72％，有效率占28％，总有效率为100％，经X2统计检验两者判别不显著。
4、安全性和不良反应见表8表8不良反应总例 有 无试验组 500 50对照组 250 25试验组50例，对照组25例，均无一例出现副反应，提示诺卡擦剂应用于临床的安全、可靠性。4、治疗前后实验室指标检查结果见表9、表105、表9治疗前后实验室指标检查结果
表10试验组与对照组治疗前后各项指标差异的显著性检验Hb RBC WBC BUN Cr治疗前P＝0.0704P＝0.3963P＝0.6048P＝0.8684P＝0.0071治疗后P＝0.122 P＝0.964 P＝0.7019P＝0.5754P＝0.7377用药前后各项指标的观察75例受试者用药前后测血红细胞，红细胞已计数，白细胞已计数，转氨酶，血尿素氨，血肌肝，变化如表9所示，两组中各项指标相比较，大部分指标统计差异无显著性(P＞0.05)，少数指标差别虽有显著性，但其均值均在正常范围内。结果详见表9、表10。结果说明试验组与对照组所用的药物均是安全的。
6、 用药前后各项指标的卡方显著性检验见表11
白带过 宫颈糜 宫颈糜 白带量 白带性 阴道清 巴氏分多 烂分度 烂分型 状 洁度级实验组用药前与第三次复查差 P＜0.05 P＜0.01 P＜0.01 P＜0.01 P＞0.05 P＜0.01 P＜0.01异的显著性检验(精确概率法)对照组用药前与第三次复查差 P＜0.05 P＜0.01 P＜0.01 P＜0.01 P＜0.01 P＜0.01 P＜0.01异的显著性检验(精确概率法)实验组与对照组用药前差异的 P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05显著性检验(精确概率法)实验组与对照组第三次复查差 P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05 P＞0.05异的显著性检验(精确概率法)讨论从本试验的结果来看，两种药品均有显著的疗效，尤其是试验组治疗宫颈糜烂更是取得了令人满意的疗效，治愈率达88％，总有效率达100％，两者均能使阴道分泌物减少和性状改善。两种药物的副作用反应均很小，对局部无明显刺激症状，不损伤正常组织，安全性好，两者均为高效安全使用简便的治疗宫颈糜烂的外用药。同时给药方式合理，带尾棉球紧贴于糜烂面作用充分，并自行取下较方便，患者十分乐于接受。
因此，我们认为诺卡擦剂是为宫颈糜烂治疗提供了新的途径，又具有防癌作用的良药，值得推广。
对于面积大的颗粒型、乳头型宫颈糜烂，一个疗程不能完全治愈者，可考虑使用2-3个疗程，以取得更好的治疗效果。
权利要求
1.一种红色诺卡放线菌细胞壁骨架制剂，其特征是先培养红色诺卡放线菌CGMCCNo.0712，再以增菌培养、菌体收集、细胞粉碎、酶纯化除脂后的所得物，经配制灌装冻干而成，每瓶为0.5ml，其组成与配比如下红色诺卡放线菌细胞壁骨架 60μg右旋糖酐40 15mg。
全文摘要
本发明涉及一种生物制剂，特别是红色诺卡放线菌细胞壁骨架制剂。先培养红色诺卡放线菌CGMCCNo.0712，再经增菌培养、菌体收集、细胞粉碎、酶纯化除脂后的所得物，经配制灌装冻干而成，其中含有红色诺卡放线菌细胞壁骨架和右旋糖酐40，两者的含量按配方的配比。通过一系列的试验和临床结果表明，本发明的制剂对适应症的疗效显著，治愈率达88％，总有效率达100％，对正常组织无损伤、无毒，安全性好，副作用小，使用简便，成本低，取代进口是治疗宫颈糜烂的首选外用药物。
文档编号A61K35/74GK1443542SQ02109258
公开日2003年9月24日 申请日期2002年3月8日 优先权日2002年3月8日
发明者张策, 张轶, 李军 申请人:沈阳胜宝康生物制药有限公司