黄芪总皂苷提取物的制备方法
【专利摘要】本发明提供一种改进的黄芪总皂苷提取物的制备方法，包括对黄芪的水提液进行两次醇沉一次水沉，再使用大孔树脂吸附三次，浓缩后即得黄芪总皂苷提取物。由于黄芪总皂苷含量较低，且药材含大量糖类物质，提取分离比较困难。本发明能够显著降低无效杂质含量，保留了药物的有效成分，极大地提高了样品纯度，进而提高了皂苷的提取率，本方法制得的黄芪总皂苷提取物中黄芪总皂苷含量高达98～100％，是一种有效的黄芪总皂苷的提取分离方法。
【专利说明】黄芪总皂苷提取物的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药材提取物的制备方法，具体地说，涉及黄芪总皂苷提取物的制备 方法。
【背景技术】
[0002] 黄苗为豆科植物蒙古黄苗 Astragalus membranaceus (Fisch. ) Bge. var. mongholicus (Bge. ) Hsiao 或膜荚黄苗 Astragalus membranaceus (Fisch. ) Bge.的干燥根。 有益气固表、敛汗固脱、托疮生肌、利水消肿之功效。用于治疗气虚乏力，中气下陷，久泻脱 肛，便血崩漏，表虚自汗，痈疽难溃，久溃不敛，血虚萎黄，内热消渴，慢性肾炎，蛋白尿，糖尿 病等。炙黄芪益气补中，生用固表托疮。
[0003] 黄芪中的主要活性成分为以黄芪甲苷为代表的皂苷类及多糖。黄芪总皂苷的动物 实验研究表明，能明显抑制中性粒细胞的增生和降低炎症关节局部的细胞因子，如白细胞 介素-1和一氧化氮的水平，减轻一氧化氮引起的软骨细胞凋亡等，而且毒性低，副作用小。
[0004] 近年来，已有较多关于黄芪总皂苷成分提取方法的研究，目标是提高黄芪总皂苷 的含量，降低大分子等杂质的含量，以提高黄芪制剂的有效性及安全性。
[0005] ZL02155002. 6公开了黄芪总皂苷的制备方法，该方法包括步骤：黄芪经水热回流 提取2次以上，提取液过滤后直接上大孔吸附树脂柱，进行脱糖，脱色处理，再分离纯化得 到黄芪总皂苷混合物。该方法将含大量杂质的提取液直接经由大孔吸附树脂柱分离纯化， 造成去除杂质的同时有效成分损失也较大的缺点。
[0006] ZL200610014211. 6公开了一种黄芪总皂苷的制备方法，该方法包括步骤：取黄芪 药材加入溶剂，将溶液调至碱性后再进行提取，得提取液；提取液上大孔型碱性阴离子交换 柱，先用碱水和纯水冲洗，冲洗液弃去，再用含水乙醇洗脱，洗脱液浓缩，即得黄芪总皂苷。 该方法仅经一次树脂纯化，存在杂质去除不彻底的缺点。
[0007] CN102488742A公开了一种黄芪总皂苷的制备方法，该方法包括步骤：黄芪煎煮 1?3次，合并过滤；浓缩提取液，加入2?5倍量的80 %?100 %的乙醇，过滤浓缩至清膏； 将清膏放入大孔树脂柱中洗脱后，即得黄芪总皂苷。该方法存在只经一次醇沉一次树脂纯 化，杂质去除不彻底的缺点。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种改进的黄芪总皂苷提取物的制备方法。
[0009] 为了实现本发明目的，本发明的一种黄芪总皂苷提取物的制备方法，包括对黄芪 的水提液进行两次醇沉一次水沉，再使用大孔树脂吸附三次，浓缩后即得黄芪总皂苷提取 物。
[0010] 上述方法具体包括以下步骤：
[0011] (1)用水煎煮提取黄芪药材，浓缩，得到黄芪水煎膏；
[0012] (2)对步骤⑴得到的黄芪水煎膏进行一次醇沉，浓缩，得到黄芪总皂苷一次醇沉 膏；
[0013] (3)对步骤（2)得到的黄芪总皂苷一次醇沉膏进行二次醇沉，浓缩，得到黄芪总皂 苷二次醇沉膏；
[0014] (4)对步骤（3)得到的黄芪总皂苷二次醇沉膏进行水沉，浓缩，得到黄芪总皂苷水 沉膏；
[0015] (5)步骤（4)得到的黄芪总皂苷水沉膏经水稀释后经过大孔树脂进行一次吸附， 收集洗脱液；
[0016] (6)步骤（5)收集的洗脱液经过大孔树脂进行二次吸附，收集洗脱液；
[0017] (7)步骤（6)收集的洗脱液经过大孔弱碱性阴离子树脂进行三次吸附，浓缩，得到 黄芪总皂苷提取物。
[0018] 更具体地，上述方法包括以下步骤：
[0019] 1)提取：用黄芪药材6-12倍重量的水煎煮提取黄芪药材2-3次，每次提取1-2小 时，合并提取液，浓缩，得到黄芪水煎膏；
[0020] 2) -次醇沉：在搅拌条件下，向步骤1)得到的黄芪水煎膏中加入浓度93%以上的 乙醇，使含醇量达74. 5% -75. 5%，搅拌，静置12小时以上，过滤，收集滤液挥干乙醇至无醇 味，并浓缩至在80°C测定相对密度为1. 11-1. 20,得到黄芪总皂苷一次醇沉膏；
[0021] 3)二次醇沉：在搅拌条件下，向步骤2)得到的醇沉膏中加入浓度93%以上的乙 醇，使含醇量达84. 5% -85. 5%，搅拌15min，冷藏12小时以上，滤取上清液（剩余药渣离心 后过滤取上清液），挥干乙醇至无醇味，并浓缩至在80°C测定相对密度为1. 11-1. 20,得到 黄芪总皂苷二次醇沉膏；
[0022] 4)水沉：在搅拌条件下，向步骤3)得到的醇沉膏中加水稀释至1ml溶液中含醇沉 膏0. 5-1. 0g，搅拌15min，冷藏12小时以上，滤取上清液（剩余药渣离心后过滤取上清液）， 浓缩至在80°C测定相对密度为1. 11-1. 20,得到黄芪总皂苷水沉膏；
[0023] 5)大孔树脂一次吸附：向黄芪总皂苷水沉膏中加水稀释至每1ml含水沉膏5g，药 液经0. 45 μ m微孔滤膜过滤后，滤液以lBV/h速度通过大孔吸附树脂，上样量为树脂体积的 8倍，经树脂吸附后用2倍树脂体积的水洗脱，洗脱流速为3BV/h，弃去洗脱液，再使用2倍 树脂体积的30%乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/h，弃去洗脱液，再用3倍树脂体积的50%乙醇 洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集洗脱液；
[0024] 6)大孔树脂二次吸附：将步骤5)收集的洗脱液，以lBV/h速度过大孔吸附树脂， 上样量为树脂体积的8倍，经树脂吸附后分别用2倍树脂体积的水和2倍树脂体积的30% 乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/h，弃去洗脱液，再用3倍树脂体积的50%乙醇洗脱，洗脱流速为 2BV/h，收集洗脱液；
[0025] 7)大孔弱碱性阴离子树脂三次吸附：将步骤6)收集的洗脱液直接以2.5? 3. 5BV/h的流速过弱碱性阴离子树脂柱，待露出树脂面时，加入树脂等重量的浓度为85% 的乙醇以相同流速冲洗树脂柱，合并初流液和洗脱液，真空减压干燥后即得黄芪总皂苷提 取物。
[0026] 本发明中使用的水为纯化水、蒸馏水或注射用水。
[0027] 利用大孔树脂进行一次吸附和二次吸附，使用的大孔树脂的型号为D10UADS-F8、 ADS-17、HPD750、HPD100、HPD450、AB-8 或 DM130 等。
[0028] 优选使用的大孔树脂的型号为D101。D101树脂是一种非极性吸附剂，比表面积 480-520m2/g，平均孔径25-28A。
[0029] 本发明中使用的大孔弱碱性阴离子树脂的型号为D900、D301R、D301G、D370、D371、 D380 或 D382 等。
[0030] 优选使用的大孔弱碱性阴离子树脂的型号为D900。D900树脂是一种弱碱性阴离 子交换树脂，交换容量mm〇l/g(干）彡8.0,粒度％ (0.315-1.25)mm彡90。
[0031] 采用上述方法制备的黄芪总皂苷提取物中，黄芪总皂苷含量98?100%，黄芪甲 苷含量70?80%。
[0032] 由于黄芪总皂苷含量较低，且药材含大量糖类物质，提取分离比较困难。本发明能 够显著降低无效杂质含量，保留了药物的有效成分，极大地提高了样品纯度，进而提高了皂 苷的提取率，是一种有效的黄芪总皂苷的提取分离方法。
【具体实施方式】
[0033] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0034] 若未特别指明，以下实施例中涉及的百分号"％"为体积百分比；"倍量"是指重量 倍数；水为纯化水、蒸馏水或注射用水。
[0035] 实施例1黄芪总皂苷提取物的制备方法 [0036] 包括如下步骤：
[0037] (1)提取：用黄芪药材12倍量的水煎煮提取黄芪药材3次，每次提取2小时，合并 提取液，浓缩，得到黄芪水煎膏，备用；
[0038] (2) -次醇沉：在搅拌条件下，向步骤（1)得到的黄芪水煎膏中加入浓度95%的乙 醇，使含醇量达75%，充分搅拌，静置14小时，过滤，收集滤液挥干乙醇至无醇味并浓缩至 在80°C测定相对密度为1. 13,得到黄芪总皂苷一次醇沉膏，备用；
[0039] (3)二次醇沉：在搅拌条件下，向步骤⑵得到的醇沉膏中加入浓度95%的乙醇， 使含醇量达85%，搅拌15min，冷藏12小时，滤取上清液（剩余药渣离心后过滤取上清液）， 收集滤液挥干乙醇至无醇味并浓缩至在80°C测定相对密度为1. 14,收膏得黄芪总皂苷二 次醇沉膏，备用；
[0040] (4)水沉：在搅拌条件下，向步骤（3)得到的醇沉膏中加入注射用水稀释至1ml含 醇沉膏约1. 〇g，搅拌15min，冷藏12小时，滤取上清液（剩余药渣离心后过滤取上清液），滤 液浓缩至在80°C测定相对密度为1. 12,收膏得黄芪总皂苷水沉膏，备用；
[0041] (5)D101大孔树脂精制：取步骤（4)得到黄芪总皂苷水沉膏，加入注射用水稀释至 每lml含水沉膏5g，药液经0. 45 μ m微孔滤膜过滤澄清后，滤液以lBV/h速度过D101大孔 吸附树脂（上柱液：树脂=8:1，体积比）吸附，吸附后用2BV (即2个柱体积）纯化水洗脱， 洗脱流速为38￥/11，弃去洗脱液，再使用28￥的30(%乙醇洗脱，洗脱流速为38￥/11，弃去洗脱 液，再用38￥的70%乙醇洗脱，洗脱流速为28￥/11，收集洗脱液。
[0042] (6) ADS-7大孔树脂精制：自D101树脂流出来的洗脱液，以lBV/h速度过ADS-7大 孔吸附树脂（上柱液：树脂=8:1，体积比）吸附，吸附后分别用2BV纯化水和2BV的30% 乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/h，弃去洗脱液，再用3BV的50%乙醇洗脱，洗脱流速为2BV/h，收 集洗脱液。
[0043] (7)D900树脂脱色：自ADS-7树脂流出来的洗脱液直接以3BV/h的流速过生药量 2/3的D900脱色树脂，待露出树脂面时，加入树脂1倍量的85%的乙醇以相同流速冲洗树 脂柱，合并初流液和洗脱液，真空减压干燥，得到黄芪总皂苷。
[0044] 经检测，本实施例中制备的黄芪总皂苷，HPLC法测定含黄芪甲苷80%，紫外分光 光度法测定含总皂苷100%。
[0045] 实施例2黄芪总皂苷提取物的制备方法
[0046] 包括如下步骤：
[0047] (1)提取：用黄芪药材6倍量的水煎煮提取黄芪药材2次，每次提取1小时，合并 提取液，浓缩，得到黄芪水煎膏，备用；
[0048] (2) -次醇沉：在搅拌条件下，向步骤（1)得到的黄芪水煎膏中加入浓度93%的乙 醇，使含醇量达74. 5%，充分搅拌，静置12小时，过滤，收集滤液挥干乙醇至无醇味并浓缩 至在80°C测定相对密度为1. 11，得到黄芪总皂苷一次醇沉膏，备用；
[0049] (3)二次醇沉：在搅拌条件下，向步骤（2)得到的醇沉膏中加入浓度93%的乙醇， 使含醇量达84. 5,搅拌15min，冷藏12小时，滤取上清液（剩余药渣离心后过滤取上清液）， 收集滤液挥干乙醇至无醇味并浓缩至在80°C测定相对密度为1. 12,收膏得黄芪总皂苷二 次醇沉膏，备用；
[0050] (4)水沉：在搅拌条件下，向步骤⑶得到的醇沉膏中加入注射用水稀释至1ml含 醇沉膏约〇. 5,搅拌15min，冷藏12小时，滤取上清液（剩余药渣离心后过滤取上清液），滤 液浓缩至在80°C测定相对密度为1. 11，收膏得黄芪总皂苷水沉膏，备用；
[0051] (5) D101大孔树脂精制：取黄芪总皂苷水沉膏适量，加入注射用水稀释至每1ml含 水沉膏5g，药液经0. 45 μ m微孔滤膜过滤澄清后，滤液以lBV/h速度过D101大孔吸附树脂 (上柱液：树脂=10:1)吸附，吸附后用2BV纯化水洗脱，洗脱流速为3BV/h，弃去洗脱液，再 使用1BV的30 %乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/h，弃去洗脱液，再用2BV的70 %乙醇洗脱，洗脱 流速为2BV/h，收集洗脱液。
[0052] (6) ADS-7大孔树脂精制：自D101树脂流出来的洗脱液，以lBV/h速度过ADS-7大 孔吸附树脂（上柱液：树脂=10:1)吸附，吸附后分别用2BV纯化水和2BV的30%乙醇洗 脱，洗脱流速为2BV/h，弃去洗脱液，再用2BV的50%乙醇洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集洗脱 液。
[0053] (7) D900树脂脱色：自ADS-7树脂流出来的洗脱液直接以3. 5BV/h的流速过生药 量2/3的D900脱色树脂，待露出树脂面时，加入树脂1倍量的85%的乙醇以相同流速冲洗 树脂柱，合并初流液和洗脱液，真空减压干燥，得到黄芪总皂苷。
[0054] 经检测，本实施例中制备的黄芪总皂苷，HPLC法测定含黄芪甲苷74%，紫外分光 光度法测定含总皂苷98%。
[0055] 实施例3黄芪总皂苷提取物的制备方法
[0056] 包括如下步骤：
[0057] (1)提取：用黄芪药材10倍量的水煎煮提取黄芪药材3次，每次提取1. 5小时，合 并提取液，浓缩，得到黄芪水煎膏，备用；
[0058] (2) -次醇沉：在搅拌条件下，向步骤（1)得到的黄芪水煎膏中加入浓度95%的乙 醇，使含醇量达74. 5%，充分搅拌，静置16小时，过滤，收集滤液挥干乙醇至无醇味并浓缩 至在80°C测定相对密度为1. 14,得到黄芪总皂苷一次醇沉膏，备用；
[0059] (3)二次醇沉：在搅拌条件下，向步骤⑵得到的醇沉膏中加入浓度95%的乙醇， 使含醇量达85. 5%，搅拌16min，冷藏13小时，滤取上清液（剩余药渣离心后过滤取上清 液），收集滤液挥干乙醇至无醇味并浓缩至在80°C测定相对密度为1. 12,收膏得黄芪总皂 苷二次醇沉膏，备用；
[0060] (4)水沉：在搅拌条件下，向步骤⑶得到的醇沉膏中加入注射用水稀释至1ml含 醇沉膏约〇. 8g，搅拌15min，冷藏14小时，滤取上清液（剩余药渣离心后过滤取上清液），滤 液浓缩至在80°C测定相对密度为1. 15,收膏得黄芪总皂苷水沉膏，备用；
[0061] (5)大孔树脂吸附：取黄芪总皂苷水沉膏适量，加入注射用水稀释至每1ml含水沉 膏4g，药液经0. 45 μ m微孔滤膜过滤澄清后，滤液以lBV/h速度过大孔吸附树脂（上柱液： 树脂=8: 1，体积比）吸附，吸附后用2BV纯化水洗脱，洗脱流速为3BV/h，弃去洗脱液，再使 用2BV的30%乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/h，弃去洗脱液，再用4BV的50%乙醇洗脱，洗脱流 速为2BV/h，收集洗脱液。
[0062] (6)大孔树脂精制：自步骤（5)树脂流出来的洗脱液，以lBV/h速度过大孔吸附树 脂（上柱液：树脂=8:1，体积比）吸附，吸附后分别用2BV纯化水和2BV的30%乙醇洗脱， 洗脱流速为3BV/h，弃去洗脱液，再用4BV的50%乙醇洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集洗脱液。
[0063] (7)阴离子树脂脱色：自步骤（6)树脂流出来的洗脱液直接以2. 5BV/h的流速过 生药量2/3的阴离子脱色树脂，待露出树脂面时，加入树脂2倍量的85%的乙醇以相同流速 冲洗树脂柱，合并初流液和洗脱液，真空减压干燥，得到黄芪总皂苷。
[0064] 经检测，本实施例中制备的黄芪总皂苷，HPLC法测定含黄芪甲苷77%，紫外分光 光度法测定含总皂苷99%。
[0065] 对比例1 :参照ZL200610014211. 6实施例2中公开的方法制备黄芪总皂苷提取 物。
[0066] 对比例2 :参照CN102488742A实施例2中公开的方法制备黄芪总皂苷提取物。 [0067] 表1本发明实施例1-3与对比例1-2的黄芪总皂苷提取物成分分析比较 [0068]
【权利要求】
1. 黄芪总皂苷提取物的制备方法，其特征在于，包括对黄芪的水提液进行两次醇沉一 次水沉，再使用大孔树脂吸附三次，浓缩后即得黄芪总皂苷提取物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 用水煎煮提取黄芪药材，浓缩，得到黄芪水煎膏； (2) 对步骤（1)得到的黄芪水煎膏进行一次醇沉，浓缩，得到黄芪总皂苷一次醇沉膏； (3) 对步骤（2)得到的黄芪总皂苷一次醇沉膏进行二次醇沉，浓缩，得到黄芪总皂苷二 次醇沉膏； (4) 对步骤（3)得到的黄芪总皂苷二次醇沉膏进行水沉，浓缩，得到黄芪总皂苷水沉 膏； (5) 步骤（4)得到的黄芪总皂苷水沉膏经水稀释后经过大孔树脂进行一次吸附，收集 洗脱液； (6) 步骤（5)收集的洗脱液经过大孔树脂进行二次吸附，收集洗脱液； (7) 步骤（6)收集的洗脱液经过大孔弱碱性阴离子树脂进行三次吸附，浓缩，得到黄芪 总皂苷提取物。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 提取：用黄芪药材6-12倍重量的水煎煮提取黄芪药材2-3次，每次提取1-2小时， 合并提取液，浓缩，得到黄芪水煎膏； 2) -次醇沉：在搅拌条件下，向步骤1)得到的黄芪水煎膏中加入浓度93%以上的乙 醇，使含醇量达74. 5% -75. 5%，搅拌，静置12小时以上，过滤，收集滤液挥干乙醇至无醇 味，并浓缩至在80°C测定相对密度为1. 11-1. 20,得到黄芪总皂苷一次醇沉膏； 3) 二次醇沉：在搅拌条件下，向步骤2)得到的醇沉膏中加入浓度93%以上的乙醇，使 含醇量达84. 5% -85. 5%，搅拌15min，冷藏12小时以上，滤取上清液挥干乙醇至无醇味，并 浓缩至在80°C测定相对密度为1. 11-1. 20,得到黄芪总皂苷二次醇沉膏； 4) 水沉：在搅拌条件下，向步骤3)得到的醇沉膏中加水稀释至lml溶液中含醇沉 膏0.5-1. 0g，搅拌15min，冷藏12小时以上，滤取上清液浓缩至在80°C测定相对密度为 1. 11-1. 20,得到黄芪总皂苷水沉膏； 5) 大孔树脂一次吸附：向黄芪总皂苷水沉膏中加水稀释至每lml含水沉膏5g，药液经 0. 45 μ m微孔滤膜过滤后，滤液以lBV/h速度通过大孔吸附树脂，上样量为树脂体积的8倍， 经树脂吸附后用2倍树脂体积的水洗脱，洗脱流速为3BV/h，弃去洗脱液，再使用2倍树脂体 积的30%乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/h，弃去洗脱液，再用3倍树脂体积的50%乙醇洗脱，洗 脱流速为2BV/h，收集洗脱液； 6) 大孔树脂二次吸附：将步骤5)收集的洗脱液，以lBV/h速度过大孔吸附树脂，上样 量为树脂体积的8倍，经树脂吸附后分别用2倍树脂体积的水和2倍树脂体积的30%乙醇 洗脱，洗脱流速为3BV/h，弃去洗脱液，再用3倍树脂体积的50%乙醇洗脱，洗脱流速为2BV/ h，收集洗脱液； 7) 大孔弱碱性阴离子树脂三次吸附：将步骤6)收集的洗脱液直接以2. 5?3. 5BV/h的 流速过弱碱性阴离子树脂柱，待露出树脂面时，加入树脂等重量的浓度为85%的乙醇以相 同流速冲洗树脂柱，合并初流液和洗脱液，真空减压干燥后即得黄芪总皂苷提取物。
4. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，使用的水为纯化水、蒸馏水或注射用 水。
5. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，利用大孔树脂进行一次吸附和二次 吸附，使用的大孔树脂的型号为 D101、ADS-F8、ADS-17、HPD750、HPD100、HPD450、AB-8 或 DM130。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，大孔树脂进行一次吸附和二次吸附使用 的大孔树脂的型号为D101。
7. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，使用的大孔弱碱性阴离子树脂的型号 为 D900、D301R、D301G、D370、D371、D380 或 D382。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，使用的大孔弱碱性阴离子树脂的型号为 D900。
【文档编号】A61K36/481GK104107211SQ201410366504
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】方同华, 徐秀杰, 王博, 董丽丽, 周广红, 范玉奇 申请人:黑龙江珍宝岛药业股份有限公司