一种与psma膜外区靶向性结合的多肽、放射性核素标记多肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于医学领域，公开了一种与PSMA膜外区靶向性结合的多肽、放射性核素标记多肽及其应用。该多肽的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，该多肽通过偶联剂来介导放射性核素进行标记，可用于制备治疗或诊断前列腺癌的靶向性药物。
【专利说明】-种与PSMA膜外区靶向性结合的多肽、放射性核素标记多 肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学领域，涉及一种与PSM膜外区靶向性结合的多肽、放射性核素标 记多肽及其应用。
【背景技术】
[0002] 前列腺癌（PCa)已成为目前危害全球男性健康的主要恶性肿瘤，早期主要通过 外科手术和放射治疗，但早期发现困难，就诊时多数已发生远处转移。未经治疗的PCa细 胞多为雄激素依赖性，即通过阻断雄激素促使雄激素依赖性癌细胞凋亡，但雄激素依赖 性PCa经过一段时间（平均14-30月）内分泌治疗后，大多数转为非激素依赖性前列腺 癌（androgenindependentprostatecancer,AIPC)，最终转化为激素难治性前列腺癌 (Hormonerefractoryprostatecancer,HRPC),目前对于HRPC及其转移灶尚无有效的治 疗方法，临床统称为难治性前列腺癌，是导致PCa预后差、死亡率高的主要原因。
[0003]125Kltl3Pd粒子近距离放射治疗及外放疗是HRPC的治疗手段，但主要限于局部病 灶。针对多发病灶的靶向内放射性治疗近年来备受关注，mLu是理想靶向内放射治疗性核 素，常用于抗体、多肽及其类似物等的标记，且mLu通过反应堆辐射产生，具有低成本和易 得性，具有适宜的物理半衰期（6. 7d)，发射的β-粒子传能线密度及生物学效应高于1251， 组织平均射程小于200μπι，适合杀死癌细胞，发射的γ射线可用于SPECT显像，以监测和指 导治疗过程，因此，如何增加理想治疗性核素mLu在HRPC及转移灶的靶向性聚集和滞留是 改善其预后亟待解决的难题，其中受体和配体的选择尤为重要。
[0004]前列腺特异性膜抗原（prostatespecificmembraneantigen，PSMA)是一种II型 跨膜糖蛋白，其大小约为100_120kD。它由3部分构成：短的胞内段（氨基酸1-18)，跨膜段 (氨基酸19-43)和较长的胞外段（氨基酸44-750)，在高度恶性原发性PCa、HRPC及其转 移灶的肿瘤细胞表面呈高丰度表达，且随PCa恶性进展而升高，而在前列腺、肾脏、肺脏、肝 脏等正常组织、炎性增生性组织及其它良性病变细胞表面表达水平极低、甚至不表达，成为 HRPC及其转移灶靶向治疗的主要靶蛋白。
[0005] 作为配体，多肽较抗体分子量小，稳定性好，无免疫源性，不被网状内皮系统非特 异性摄取，可通过化学修饰连接ΝΟΤΑ、CB-TE2A、PCTA、DOTA等偶联物，进行放射性核素标 记，体外类合成（如固相法）过程简单、经济，为广泛临床应用提供了基础。更重要的是，多 肽作为放射性核素载体，通过结构优化可获得体内药代动力学良好如血清除快、靶向特异 性好、结合稳定的多肽。
[0006] 若能够研制出一种能与PSM胞外区特异性结合特性和具有靶向功能的多肽，对 于PCa的诊断和治疗具有较好的应用前景。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对上述技术问题提供一种与PSM膜外区靶向性结合的多肽。
[0008] 本发明的另一个目的是提供由上述多肽制备的放射性核素标记多肽。
[0009] 本发明还有一个目的是提供上述多肽制备治疗或诊断前列腺癌的靶向性药物中 的应用。
[0010] 本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
[0011] 一种与PSM膜外区靶向性结合的多肽，该多肽的氨基酸序列如SEQIDNo: 1所 /Jn〇
[0012] 一种放射性核素标记多肽，该放射性核素标记多肽是上述氨基酸序列如SEQ IDNo: 1所示的多肽通过偶联剂来介导放射性核素进行标记。
[0013] 所述的放射性核素标记多肽，其中偶联剂为D0TA、ΝΟΤΑ、CB-TE2A、PCTA或Hynic。
[0014] 所述的放射性核素标记多肽，其中放射性核素为显像性放射性核素或治疗性放射 性核素。
[0015] 所述的放射性核素标记多肽，其中显像性放射性核素如64CiU686&、11111!、 99"^，治疗 性放射性核素9°Y、mLu、89Sr。
[0016] 氨基酸序列如SEQIDNo: 1所示多肽在制备治疗或诊断前列腺癌的靶向性药物中 的应用。
[0017] 上述的放射性核素标记多肽在制备治疗或诊断前列腺癌的靶向性药物中的应用。
[0018] 本课题组首次通过体外固相法合成PSM膜外区靶向性结合的小分子直线多肽， 其结构为多肤序列为Gly-Asp-His-Ser-Pr〇-Phe-Thr_Gly-Ser(SEQIDNo:l)，即甘氛 酸-天冬氨酸-组氨酸-丝氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苏氨酸-甘氨酸-丝氨酸（以下 简称PSMATP)，可与PSMA胞外段（氨基酸44-750)靶向结合，并与偶联剂（如D0TA、ΝΟΤΑ、 CB-TE2A、PCTA、Hynic等）通过聚乙二醇（PEGn，η= 0, 1，2, 3)连接，偶联剂介导多肽的放 射性核素（如68Ga、64CU、89Sr、mIn、9°Y、mLU和99mTc)的标记。其中放射性核素可以是显像 性放射性核素如64Cu、68Ga、niIn、99mTc，也可以是治疗性放射性核素如9°Y、mLu、89Sr等。体外 实验考查其体外稳定性，体内实验考察其体内药代动力学和生物学分布，并通过MicroPET/ CT(或microSPECT/CT)显像评价其在前列腺癌肿瘤部位的放射性摄取。
[0019] 本发明的有益效果：
[0020] 本发明制备的小分子多肽PSMATP，能与PSM膜外区靶向性结合，利用该多肽制备 的放射性核素标记多肽，可作为诊断或治疗前列腺癌的靶向性药物，具有较好的效果。
[0021] 同抗体不同，该多肽无免疫源性，分子量小，血液清除快，肝脾等富网状内皮系统 摄取少且清除快，在前列腺等组织中分布少，而在前列腺癌（及其转移）病灶部位浓聚多， 且滞留时间长，可有效作为诊断和治疗用放射性核素的载体。另外，由于PSM膜外区长，高 特异性结合的多肽序列的筛选和获得困难，本小分子多肽核苷酸序列通过噬菌体展示技术 获得（噬菌体展示技术是公知技术，筛选过程不再赘述），可通过体外固相合成法制备，利 于量化和产业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图 1 是D0TA-PSMATP的结构图。
[0023]图 2 是D0TA-PSMATP的HPLC检查。
[0024]图 3 是D0TA-PSMATP质谱图。
[0025] 图4是68Ga-DOTA-PSMATP的HPLC分析的放射性峰。
[0026]图 5 是68Ga-DOTA-PSMATP的HPLC分析的紫外峰。
[0027] 图6是前列腺癌（C4-2)荷瘤鼠尾静脉注射68Ga-D0TA-PSMATP60min后行 microPET/CT显像（左侧为3D图像，右侧为横断层融合图像）。
[0028] 图7.荷瘤鼠（前列腺癌C4-2和胰腺癌PC-3)尾静脉注射mLu-DOTA-PSMATP前 后不同时间的肿瘤体积变化。
[0029] 图8.荷瘤鼠（前列腺癌C4-2和胰腺癌PC-3)尾静脉注射mLu-DOTA-PSMTP前 后不同时间的体重变化。
[0030] 图9.前列腺癌（C4-2)荷瘤鼠尾静脉注射mLu-DOTA-PSMATP后ld，5d，15d肿瘤 组织病理检查结果（HE:X10)。
【具体实施方式】
[0031] 以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
[0032] 实施例1
[0033] 一、多肽D0TA-PSMATP的合成及其质控
[0034] 1、固相法直线多肽PSMTP的合成及与1，4, 7, 10-四氮杂环十二烷-1，4, 7, 10-四 乙酸（DOTA)的偶联
[0035] ①多肽从C端到N端方向合成，先在树脂上挂第一个氨基酸，称取2.Og树脂于洁 净干燥的反应管中，加入适量二甲基甲酰胺（DMF)，活化30min左右，然后称取第一个氨基 酸Fmoc-Ser-OHO· 5mmol，4_ 二甲氛基批陡（DMAP) 75mg，N,Ν'-二异丙基碳二亚胺（DIC)Iml 加入到反应管中，DMF做溶剂反应3h。反应完毕用DMF洗4?6次，加入适量吡啶和甲醇， 体积比为1:1，反应30min。反应完毕用DMF洗4?6次。然后用哌啶溶液脱掉氨基酸的 Fmoc，脱两次共15min，10min+5min。再用DMF洗4次，甲醇洗2次，取出少量树脂用茚三酮 检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应；
[0036] ②称取第二个氛基酸Fmoc-Gly-OHLSmmol,HBTUI. 5mmo1于反应管中，加入 DIEAO. 5ml，反应40min，用DMF洗4?6次，取少量树脂用茚三酮检测试剂检测，显无色，然 后加入哌啶溶液脱Fmoc，10min+5min，然后用DMF洗4次，甲醇洗两次，取出少量树脂用茚三 酮检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应；
[0037] ③以下氨基酸反应方法同②，氨基酸种类按SEQ IDNo:1所示反向逐步增加，最终 得到SEQ IDNo:1所不多肤，即Gly-Asp-His-Ser-Pro-Phe-Thr-Gly-Ser ;
[0038]④称取0. 75mmolD0TA，苯并三氮唑-N，N，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸酯 (HBTU)L5mmol于反应管中，加入Ν，N-二异丙基乙胺（DIEA)O. 25ml，经过用茚三酮检测试 剂检测，检测为无色；
[0039] ⑤最后用三氟乙酸切割液切割2h，反应液抽滤，得多肽的三氟乙酸溶液，用乙醚沉 淀，离心，然后再用乙醚洗3?5次，得白色固体，经HPLC纯化，冻干，取少量进行质量分析。
[0040] 2、质量分析：
[0041] 使用高效液相色谱仪（HPLC)和质谱仪（MS)对目标化合物进行肽序、分子量和化 学纯度进行质量分析
[0042] HPLC分析：参数：C18柱，（4. 6*250mm)，流动相：溶剂A为含0. 1%三氟醋酸的乙 腈，溶剂B为含0.I%三氟醋酸的超纯水，流动相梯度如下：
【权利要求】
1. 一种与PSMA膜外区靶向性结合的多肽，其特征在于该多肽的氨基酸序列如SEQ ID No: 1所示。
2. -种放射性核素标记多肽，其特征在于该放射性核素标记多肽是权利要求1所述多 肽通过偶联剂来介导放射性核素进行标记。
3. 根据权利要求2所述的放射性核素标记多肽，其特征在于偶联剂为D0TA、ΝΟΤΑ、 CB-TE2A、PCTA 或 Hynic。
4. 根据权利要求2所述的放射性核素标记多肽，其特征在于放射性核素为显像性放射 性核素或治疗性放射性核素。
5. 根据权利要求4所述的放射性核素标记多肽，其特征在于显像性放射性核素如64Cu、 68Ga、mIn、99D1Tc，治疗性放射性核素 90Y、177Lu、89Sr。
6. 权利要求1所述的多肽在制备治疗或诊断前列腺癌的靶向性药物中的应用。
7. 权利要求2所述的多肽在制备治疗或诊断前列腺癌的靶向性药物中的应用。
【文档编号】A61K51/00GK104262458SQ201410438305
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年8月29日 优先权日:2014年8月29日
【发明者】邵国强, 王自正, 王峰, 杜同信 申请人:邵国强, 王自正, 王峰, 杜同信