续断总皂苷在制备安胎药物中的应用的制作方法

续断总皂苷在制备安胎药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了续断总皂苷在制备安胎药物中的应用。续断总皂苷能促进动物膜型的子宫、卵巢的雌激素和孕激素受体的表达，明显减少动物模型的阴道出血，显著提高了活胎数，减少流产数，降低了流产率，从多层次、多因素保护动物妊娠，其安胎作用非常显著。
【专利说明】续断总皂苷在制备安胎药物中的应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及续断有效部位的用途，尤其是续断总皂苷在制备安胎药物中的应用。

【背景技术】
[0002] 续断，来源于川续断科植物川续断Dipsacus asper Wall. Ex Henry的干燥根，首 载于《神农本草经》，具有补肝肾、强筋骨、续折伤、止崩漏、安胎等功效，广泛应用于临床各 科，治疗腰膝酸软、风湿痹痛、跌仆损伤、崩漏、胎漏、胎动不安等症。续断的化学成分主要含 有三萜皂苷类、环烯醚萜类、生物碱类、挥发油类等成分。现代药理学研究发现，其具有抑菌 消炎、免疫调节、抗氧化防衰老、促骨形成等作用。
[0003] 自然流产是常见的妊娠病，近年发病率呈增长趋势，其病因复杂，确切发病机制尚 不明确，古今中外的论述繁多。从中医角度来看，自然流产的病因，大致归纳为肾虚、脾虚、 气血不足、血热、血瘀、外伤等，病机主要为冲任气血不调，胎元不固。致病因素虽多，但多 数医家认为肾脾二脏乃病机之关键。因肾为先天之本，主生殖，主藏精而系胞胎。胎孕既 成，则有赖于先天生殖之精的滋养和肾气的巩固，后天水谷之精的充养。若肾气不足，胎失 所系，或脾虚血少，胎失所养，均可致胎元不固而殒堕。故肾不系胎，脾失摄养为本病之关 键。中药安胎作用机理可能与以下五个作用机制有关：对子宫兴奋性的影响、对妊娠期内分 泌的调节的作用、对妊娠期的免疫调节作用、改善血液流变学作用、对滋养细胞的影响等。
[0004] 从现代病因学看，导致自然流产的病因，主要有遗传因素、内分泌功能异常、免疫 因素、感染因素、生活环境因素和解剖因素等。
[0005] 遗传因素 染色体异常：包括数目异常和结构异常，可自然发生也可由外界因素（物理、化学、生 物）和遗传因素诱发。染色体异常以数量异常多见，常见染色体三体，其次是45, X0。多 倍体异常少见，其中以三倍体多见。在染色体结构异常的流产中以平衡移位携带者多见，其 次是臂间倒位及性染色体异常。
[0006] 基因异常：目前原因不明的反复自然流产（recurrent spontaneous abortion, RSA)遗传免疫学研究多集中于HLA位点，即HLA易感基因和（或）HLA易感单体，其次是 与凝血功能有关的异常基因，地中海贫血纯合子也可发生流产。HLA位于人类6号染色体 短臂（6p21，3)，全长4000kh，分为IJIJII 3个区域，其主要功能是参与免疫应答调控。 目前研究表明，Π 区域中的DQ亚区与免疫性疾病有关。遗传性血栓形成倾向不仅与妊娠血 栓栓塞有关，而且也是流产的重要原因。凝血因子V突变和活化蛋白C抵抗是导致流产的 常见原因，同时不耐热的亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR)基因多态性在凝血缺陷所导致的 流产中起一定的作用。
[0007] 内分泌功能异常 最常见为黄体功能不全，由于卵泡发育不良，排卵后黄体形成不健全；或妊娠早期卵巢 对HCG反应欠佳，孕酮分泌不足；另一方面，子宫内膜的孕激素受体（PR)不足，对孕酮的效 应低下，均可影响蜕膜及胎盘形成。
[0008] 有研究发现，反复早期自然流产的患者，其血清E2水平在卵泡期和黄体期均显著 低于正常对照组，而卵泡刺激素（FSH)、促黄体生成素（LH)、催乳素（PRL)和孕酮（P)水平 则与对照组无统计学意义差异。但子宫内膜组织雌激素受体（ER)、孕激素受体（PR)含量 却显著低于对照组。提示子宫内膜对激素的效应不良是自然流产的重要原因。
[0009] 近年的研究还发现，先兆流产或不全流产的患者血浆β -内啡肽（β -EP)水平显 著上升，而促性腺激素释放激素（Gn-RH)、人绒毛膜促性腺激素（HCG)和孕酮（P)水平则下 降（Ρ〈0· 01)。
[0010] 此外，甲状腺功能异常（甲亢或甲低)、糖尿病或其它内分泌疾患也可影响胚胎发 育而流产。
[0011] ⑶免疫因素 原因不明的反复自然流产，多数是免疫因素所致。约50%的RSA发病与免疫因素有关， 流产是母胎之间免疫状态失衡，发生免疫排斥所致。免疫因素引起的RSA可分为自身免疫 型和同种免疫型两类。
[0012] 自身免疫：通常可在患者的体内检出自身抗体，如抗磷脂抗体等。抗磷脂抗体综合 征（the antiphospholipid syndrome, APS)是最常见的自身免疫病型疾病。另外，抗甲 状腺抗体、抗凝血酶原抗体、抗核抗体等均与复发性流产（recurrent miscarriage, RM)发 病密切相关。
[0013] 同种免疫：由同种免疫病型可能因为母-胎界面的免疫耐受机制发生异常，胚胎 受到母体免疫应答的攻击而使胚胎遭受排斥、流产。主要与人类白细胞抗原（HLA)、蜕膜T 细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）、细胞因子、补体系统、凋亡因子表达异常有关。
[0014] 细胞因子：近年研究证明，Thl、Th2细胞因子平衡对妊娠结局关系密切。Th2来源 的细胞因子对妊娠有利，而Thl来源的细胞因子则不利于妊娠。对妊娠结局而言，重要的是 Thl /Th2的平衡，而不是哪一类因子的绝对值。转化生长因子-β (TGF-β 1)可能对维持妊 娠至关重要，但也可能是复发性流产的一个危险因子。
[0015] 补体系统异常：有学者推测，如果补体调节蛋白表达发生缺陷，那么补体介导的 免疫病理作用可能导致流产。李霞等的实验结果证明了血清中可溶性补体调节蛋白分子可 能与习惯性流产有关，即有习惯性流产史的非妊娠妇女血清抗补体抑制率较正常无流产的 经产妇低。据此认为有习惯性流产史的患者妊娠时,可能由于血清本身的抗补体作用低下， 难以有效地抑制补体激活，从而促发免疫病理作用，导致习惯性流产。
[0016] 凋亡因子表达异常：细胞凋亡增加可能是RSA发生的一个重要病理过程。母胎界 面存在凋亡因子受体FasL和Trai-IR，二者分别与激活的淋巴细胞表面存在的凋亡因子（ Fas和Trail)结合，诱导细胞凋亡，使胚胎逃避免疫打击。研究表明，RSA患者胎盘绒毛滋 养细胞表面FasL表达减少，导致母胎间免疫耐受的破坏，引起异常的免疫反应，从而导 致RSA的发生。
[0017] 感染因素 急性传染病、高热可引起子宫收缩而流产；细菌毒素或病毒(如风疹病毒、巨细胞病毒、 单纯疱疹病毒等)可通过胎盘进入胎儿血循环，可导致胎儿发育异常或死亡。TORCH感染与 自然流产的相关性已得到临床医生的广泛关注。近年来，对流产妇女和正常早孕妇女常规 检测风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒和弓形体抗体，人类微小病毒B19 (B19V)等。
[0018] 生殖道的支原体、衣原体感染与自然流产的相关性也是近年研究的热点。研究表 明，自然流产患者宫颈CT、UU、MH感染率显著高于正常妊娠组。其机理可能是炎症细胞浸润 子宫内膜，影响胚胎的生长；或通过垂直传播影响胚胎，导致胚胎停止发育。
[0019] 解剖因素 子宫形态异常(如双子宫、纵隔子宫或子宫发育不良)、盆腔或宫腔内占位性病变(如子 宫肌瘤等)，影响胎儿生长发育；宫颈内口松弛或宫颈重度裂伤，导致宫颈机能不全，可造成 晚期流产。
[0020] 生活环境因素 孕期接触有害的化学物质与物理因素，包括重金属、苯、甲醛、放射线、噪音、高温等以 及主动被动吸烟等，可直接或间接对胚胎或胎儿造成损害。
[0021] 目前，对于自然流产的治疗，西医多采用期待疗法、激素疗法和免疫疗法，但是这 些方法有种种局限和副作用，并不能安全有效地防治自然流产。而中医药由于其副作用少， 安全可靠且具有远期疗效，在调经、种子、安胎方面具特色和优势。


【发明内容】

[0022] 本发明的目的在于提供续断总皂苷的用途，即续断总皂苷在制药中的应用。
[0023] 实际上，本发明涉及续断总皂苷在制备安胎药物中的应用。
[0024] 本发明涉及续断总皂苷在制备减少流产率的药物中的应用。
[0025] 本发明涉及续断总皂苷在制备提高活胎数的药物的应用。
[0026] 本发明涉及续断总皂苷在制备减少阴道出血的药物中的应用。
[0027] 本发明涉及续断总皂苷在制备调节妊娠内分泌的药物中的应用。具体地，涉及续 断总皂苷作为制备提高妊娠期卵巢及子宫的孕激素受体水平药物的应用；作为制备提高妊 娠期卵巢及子宫的雌激素受体水平药物的应用。
[0028] 作为本发明的一个实施例，所述续断总皂苷的制备方法为： (1) 将续断干燥、切细、粉碎后，醇提得续断醇提物； (2) 续断醇提物除醇后，上大孔树脂，先后经水和乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙 醇后得续断总皂苷粗提物； (3) 续断总皂苷粗提物酸化，调整pH值至广2,氯仿萃取，水层部分用碱调整pH值至 ΚΓ11，氯仿萃取，水层部分减压浓缩得续断总皂苷。
[0029] 本发明所述步骤（1)中，续断经干燥、切细和粉碎后经5?7倍75%乙醇回流提取三 次，提取时间分别为2小时，I. 5hr及I. 5hr，过滤，合并三次滤液，得到续断醇提物。
[0030] 所述步骤（2)中，续断醇提物除醇后，上大孔树脂，用蒸馏水洗脱至近无色，然后 用95%乙醇洗脱，95%乙醇与续断醇提物之间的体积比为7:1~8:1. 5。
[0031] 所述大孔树脂为HP - 20大孔树脂。
[0032] 所述步骤⑶中，续断总皂苷粗提物用1 %稀盐酸酸化，调整pH值至1~2,采用等 体积氯仿进行萃取；氯仿萃取后水层部分以1%的NaOH溶液中和调整pH值至l(Tll，采用 等体积氯仿进行萃取。
[0033] 所述的续断总皂苷的治疗有效量是为个体给药后产生安胎等活性作用的剂量。而 给予个体单剂或多剂量时，给药剂量根据多种因素而不同，包括续断总皂苷的药代动力学 性质、给药途径、患者情况何特性（性别、年龄、体重、健康情况、体型）、症状程度、并存的治 疗、治疗频率和期望的效果。
[0034] 所述的续断总皂苷可由多种途径进行个体给药，给药途径包括口服、静脉注射等。 相应地，所述的续断总皂苷可以与可药用载体制备成口服制剂和注射剂。其中，口服制剂包 括片剂、胶囊剂、微胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、滴丸、口服液和散剂。注射剂包括静脉注射剂 和粉针剂。还可以根据剂型需要可配以不同的可药用载体，同时可加入抗氧化剂、乳化剂、 稳定剂和防霉剂。
[0035] 本发明研究了续断总皂苷的药理作用，根据药理学研究原则，设计了相关的实验 动物模型，进行了动物模型的流产疗效研究，经实验证明：续断总皂苷能促进动物膜型的 子宫、卵巢的雌激素和孕激素受体的表达，明显减少动物模型的阴道出血，显著提高了活胎 数，减少流产数，降低了流产率。可见，续断总皂苷的安胎作用非常显著。

【专利附图】

【附图说明】
[0036] 图1是本发明续断总皂苷的HPLC-UV指纹图谱。

【具体实施方式】
[0037] 下面结合实例及附图对本发明作进一步的详细阐述续断总皂苷在医药领域中的 新用途，尤其是安胎药物的用途。但是以下实施方式仅用于说明本发明的目的，并不限制本 发明的保护范围。
[0038] 续断总皂苷对肾虚-黄体功能抑制流产模型大鼠安胎作用的药效及作用机制研究 1实验材料 1. 1实验药物及药材商品来源： 菟丝子、续断：购自广东康美有限公司采购的地道药材。
[0039] 桑寄生：委托华南植物园采集的从化桑寄生。
[0040] 地屈孕酮片：荷兰 Solvay pharmaceuticals B. V，规格：20 片 / 盒（IOmg/片） 339430 米非司酮片：湖北葛店人福药业有限责任公司，规格：6片/盒（25mg/片)，编号： 101002U10302U10202 羟基脲片：齐鲁制药有限公司，规格：1〇〇片/盒（〇. 5g/片)，批号：005009LC、103012LC 羧甲基纤维素钠（CMC-Na):天津市福晨化学试剂厂，批号：20090320。
[0041] ?0?有关材料：1^2〇1，5父逆转录131^€61'，5\定量131^€61'，(1阶1 38，丽1^，了39酶 1. 2实验动物 SPF级SD大鼠，体重：雌220?280g，雄30(T350g，雌雄比例=2 : 1。广东省医学实 验动物中心提供。
[0042] 合格证号：0090923、0097324、0094245、0094568。
[0043] 动物实验设施合格证：0057219。
[0044] 1. 3实验仪器 超净工作台：苏州金燕净化设备有限公司，型号：JYB-1300。
[0045] 电子分析天平：上海友声衡器有限公司，型号：BS-3000A，感量0. lg。
[0046] 显微镜：日本奥林巴斯厂（OLYMPUS )，型号：CX21。
[0047] 电子分析天平：德国Sartorius，型号：BS224S3。
[0048] 高效液相色谱议：Agilent 1100 series。
[0049] 旋转蒸发仪：型号：EYELA NlOOO型旋转蒸发仪，日本东京理化。
[0050] PCR:ABI 3900台式高通量DNA合成仪，科大创新HC-3018R高速冷冻离心机， BIO-RAD定性PCR仪，ABI-7500全自动荧光定量PCR仪。
[0051] 2实验方法 2. 1实验药物的制备 2. I. 1续断总提物、续断总皂苷的制备 将3. 5kg续断干燥、切细，经粉碎机加工成碎粒，经6倍75%乙醇回流提取三次(分别 为2小时，I. 5hr及I. 5hr)。过滤后，合并三次滤液，经旋转蒸发仪减压浓缩除去乙醇，浓缩 至约1500 mL无醇味续断醇提物。减压浓缩条件：浓缩温度区间55 °C_60°C，浓缩转速70 rpm/min，真空度小于0.1 Mpa。
[0052] 续断醇提取物上HP-20大孔树脂柱（Diaion HP-20,日本三菱化成公司，直径100 mm，高I m)，先用双蒸水进行洗脱至近无色，再用8L 95%乙醇进行洗脱，收集95%乙醇洗脱 液，洗脱液经旋转蒸发仪减压浓缩除去乙醇，浓缩至IOOOml无醇味的含总生物碱及总苷的 续断总阜苷粗提物。减压浓缩条件：浓缩温度区间55 °C-60°C，浓缩转速70 rpm/min，真 空度小于0. I Mpa。其后，续断总皂苷粗提物用1 %稀盐酸酸化，调整pH值至1-2。用等体 积氯仿（IOOOml)振摇萃取，得到非极性成分共16. Ig (提取率为0. 46%)。静置30 min分 层完全，去除下层萃取液，同样操作萃取四次，水层部分以1 %的NaOH溶液中和，调整pH值 ΚΓ11，用等体积氯仿（IOOOml)振摇萃取四次，水层部分以1%盐酸中和，减压浓缩得续断 总皂苷775g(提取率22. 5%)。4°C，避光保存备用。续断水提取物的制备：将3. 35kg续断 干燥、切细，然后经粉碎机加工成碎粒，用1〇倍水煎煮两次(分别为2小时和I. 5hr)。过 滤后，减压下除去水分，得水提取物1500g (提取率44. 7 % )。保存在4°C，备用。
[0053] 2. L 2减味寿胎丸总提物的制备 将干燥药材菟丝子400g，桑寄生300g，续断300g，分别用中药粉碎机粉碎成20? 30目粗粉，混合均匀后以七倍量的95%乙醇（即7L )回流提取2次，每次为半小时，温度 30?40°C，超声频率40KHz条件下超声30分钟，过滤，合并两次滤液，用旋转蒸发仪挥干溶 齐U，减压浓缩成浸膏，浓缩温度50°c，浓缩转速70rpm(转/每分钟)，浓缩真空度0. IMpa下， 浓缩所得浸膏即为减味寿胎丸醇提物样品。
[0054] 将醇提后的滤渣，在室温下挥干溶剂至无醇味，加七倍量蒸馏水（即7L)浸泡 30min后，加热煎煮30min，水沸开始计时。四层纱布过滤，滤渔再加蒸馈水7L浸泡30min 后，加热煎煮30min，再用四层纱布过滤，合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，浓缩 条件如下：温度60°C，转速70rpm (转/每分钟)，浓缩真空度0. IMpa下，浓缩所得浸膏即为 减味寿胎丸水提物样品。
[0055] 将减味寿胎丸醇提物与水提物合并，即得减味寿胎丸总提物样品，重51. 6克，提 取率为25. 8%，避光保存在4°C，备用。
[0056] 2.2实验药物的鉴定 2. 2. 1续断的鉴定 2. 2. I. 1续断各有效部位的定性鉴定 氯仿-浓硫酸反应(定性鉴别三萜皂苷） 分别取续断乙醇总提取物、续断乙醇总提取物的纯化物、总皂苷部位部位样品的水溶 液lmL，加入氯仿2mL，再加入浓硫酸3mL进行反应，结果各反应液均分为上下两层，续断乙 醇总提取物、续断乙醇总提取物的纯化物、总皂苷部位的反应较大，其中总皂苷部位的上层 水溶液变为紫色。因此，可以确定该部位含有三萜皂苷，即验证该部位为续断的总皂苷部 位。
[0057] 2. 2. 1. 2.续断各有效部位与续断乙醇总提取物成分比照分析 HPLC-UV指纹图谱法 分别取续断乙醇总提取物、续断乙醇总提取物的纯化物、和总皂苷部位样品，分别用适 量的甲醇溶解，过0.45 μ m滤膜，备用。分别吸取以上样品注入高效液相色谱中，进行测试。 并与对照品续断总皂苷VI对照。
[0058] 色谱条件：色谱柱：Hyperisil ODS C18 柱（4. 6 mm X 250mm i. d. , 5 μ m);流 动相：〇· 1% 磷酸水溶液（A)，乙腈（B)，0?24 min，5%?17% B ;24?60 min，17%?25% B ;60?80 min, 25%?50% B，80?81 min，50%-5% B ;检测波长：212nm，254nm，270nm，360 nm ;柱温：30 °〇；流速：11111/111；[11;进样量：5以1^104匕
[0059] 结果：如图1所示，续断乙醇总提取物、续断乙醇总提取物的纯化物和总皂苷部 位、总生物碱部位与对照品续断总皂苷VI的HPLC-UV指纹图谱（212 nm)具有较好的相似 性；续断乙醇总提取物的纯化物色谱图中的色谱峰的个数明显多于总皂苷部位的色谱峰； 同时，续断总皂苷部位的色谱峰可从续断乙醇总提取物色谱图中找到相应的色谱峰，且保 留时间基本一致；通过以上样品中相同保留时间成分的紫外吸收图谱，结果发现各相同保 留时间的成分的紫外吸收图谱相同；以上结果说明总皂苷部位与续断乙醇总提取物具有相 同的化学成分，且总皂苷部位为续断乙醇总提取物成分的一部分（参见图1)。
[0060] 2. 3实验药物剂量设计 2. 3. 1实验药物剂量计算方法 按照成人常用剂量：菟丝子20g、桑寄生15g、续断15g计算。
[0061] 低剂量组(等效剂量）：大鼠每日公斤体重给药剂量（g/kg/d) =成人常用剂量 (g)/60kgX6. 25X 提取率。
[0062] 中剂量组：2· 5倍等效剂量。
[0063] 高剂量组：5倍等效剂量。
[0064] 2. 3. 2实验药物剂量计算结果 续断总提物：临床推荐剂量是每日15g (按体重60kg计算），提取率44. 7%，相当于 0· 112g · kg-1 · cf1。换算成大鼠等效剂量为0· 6984g · kg-1 · cf1，大鼠等效剂量的5倍为高 剂量组，即3. 492g · kg4 · cf1，大鼠等效剂量的2. 5倍为中剂量组，即I. 746g · kg4 · cf1， 大鼠等效剂量的1倍为低剂量组，即〇.6984g 续断总提物高剂量组简称续总高 组，续断总提物中剂量组简称续总中组，续断总提物低剂量组简称续总低组。
[0065] 续断总皂苷：临床推荐剂量是每日15g (按体重60kg计算），提取率22. 5%，相当 于0· 056g · kg4 · cf1。换算成大鼠等效剂量为0· 352g · kg4 · cf1，大鼠等效剂量的5倍为 高剂量组，即I. 76g · kg4 · cf1，大鼠等效剂量的2. 5倍为中剂量组，即0. 879g · kg4 · cf1， 大鼠等效剂量的1倍为低剂量组，即〇.352g ·(!'续断总皂苷高剂量组简称续总苷 高组，续断总皂苷中剂量组简称续总苷中组，续断总皂苷低剂量组简称续总苷低组。

【权利要求】
1. 续断总皂苷作为制备安胎药物中的应用。
2. 续断总皂苷作为制备减少流产率的药物中的应用。
3. 续断总皂苷作为制备提高活胎数的药物中的应用。
4. 续断总皂苷作为制备减少阴道出血的药物中的应用。
5. 续断总皂苷作为制备调节妊娠内分泌的药物中的应用。
6. 续断总皂苷作为制备提高妊娠期卵巢及子宫的孕激素受体水平药物的应用。
7. 续断总皂苷作为制备提高妊娠期卵巢及子宫的雌激素受体水平药物的应用。
8. -种续断总皂苷的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将续断干燥、切细、粉碎后，醇提得续断醇提物； (2) 续断醇提物除醇后，上大孔树脂，先后经水和乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙 醇后得续断总皂苷粗提物； (3) 续断总皂苷粗提物酸化，调整pH值至广2,氯仿萃取，水层部分用碱调整pH值至 ΚΓ11，氯仿萃取，水层部分减压浓缩得续断总皂苷。
9. 权利要求8所述续断总皂苷的制备方法，其特征在于，所述步骤（1)中，续断经干燥、 切细和粉碎后经5?7倍75 %乙醇回流提取三次，提取时间分别为2小时，1. 5hr及1. 5hr， 过滤，合并三次滤液，得到续断醇提物；所述步骤（2)中，续断醇提物除醇后，上大孔树脂， 用蒸馏水洗脱至近无色，然后用95%乙醇洗脱，95%乙醇与续断醇提物之间的体积比为 7:1~8:1. 5 ;所述大孔树脂为HP - 20大孔树脂；所述步骤⑶中，续断总皂苷粗提物用1 % 稀盐酸酸化，调整pH值至广2,采用等体积氯仿进行萃取；萃取后水层部分以1%的NaOH溶 液中和调整pH值至ΚΓ11，采用等体积氯仿进行萃取。
10. -种权利要求8或9所述制备方法制备的续断总皂苷。
【文档编号】A61K36/185GK104288188SQ201410482049
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月19日 优先权日:2014年9月19日
【发明者】罗颂平, 郜洁, 缪江霞 申请人:罗颂平