一种猪瘟口服弱毒冻干疫苗、其制备方法及冻干保护剂与流程

本发明属于冻干疫苗领域，更具体地涉及一种猪瘟口服弱毒冻干疫苗、其制备方法及冻干保护剂。

背景技术：

冻干疫苗主要由抗原和冻干保护剂组成，抗原可以包括蛋白、病毒、细菌等。目前，兽用冻干疫苗的市场应用较为普遍。虽然冻干疫苗具有保存方便、可集中批量生产等优点，但其冻干工艺或冻干效果也存在一些问题，因而制约了冻干苗的发展。抗原保存和疫苗冻干过程中病毒粒子或细菌的失活是制约疫苗质量的重要因素之一。

为了保持冻干疫苗中病毒或细菌的免疫反应性，减少冷冻干燥对病毒或细菌的破坏，在制作冻干活疫苗时需添加冻干保护剂，保证疫苗制品中抗原的免疫原性和免疫反应性有良好效果。

由于冻干过程时间较长，病毒或细菌的活性会受其中冻干保护剂的物理化学变化的影响，因而增加了冻干保护剂配方的复杂性。常用的冻干保护剂按其作用机理可分为如下几类：防冻剂，如甘油、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、二甲亚砜、蔗糖等；抗氧化剂，如维生素C、维生素E、硫代硫酸钠等；填充剂，如甘露醇、乳糖、明胶等；pH调节剂，如磷酸、山梨醇、EDTA、氨基酸等；其他物质，如葡聚糖、脱脂乳、谷氨酸钠、硫脲等。

牛奶、蔗糖、明胶等是我国常用的传统生物制品的冻干保护剂，但是，这些材料的保护性能一般，而且有的不适用于病毒的冻干保护。一般来说，适用于病毒的保护剂主要有蔗糖4％～6％、谷氨酸钠0.3％、牛血清蛋白0.11％、精氨酸3％、蔗糖5％、明胶0.2％、谷氨酸钠0.1％，这些成分的不同配伍对病毒活性的保护程度也不一。

任何一种病原都有专属于各自的冻干保护剂，而根据病原的抗原性不同，在选择冻干保护剂上也有差别。虽然目前针对猪瘟疫苗的冻干保护剂 也有多种类型，但这些都是针对注射型疫苗筛选出的保护剂。由于猪瘟是消化道疾病，因此有针对性的诱导消化道部位的免疫反应，可以获得更好的防治效果，这对于猪瘟疫苗的研发也是一个新的突破口。

口服疫苗可通过共同膜机制遍布全身膜系统，明显刺激全身性的细胞免疫和体液免疫应答，可有效激发肠黏膜免疫。此外，口服疫苗不仅给药途径简单、安全，而且不会给免疫个体引起应激等不良反应。现有的猪瘟病毒口服疫苗一般是由猪瘟病毒和冻干保护剂组成，但是，这样的口服疫苗抗原递呈效率较差，黏膜免疫效果不好。

在冻干疫苗中，加入黏膜免疫佐剂，开发口服冻干疫苗，这样不仅可以使疫苗的保存期延长，而且可提高其黏膜免疫效果，目前，已报道的黏膜免疫佐剂主要分为四类：第一类是细菌性物质；第二类是各种细胞因子；第三类是某些无机成分；第四类是可增强抗原递呈的相关载体。其中应用较多的细菌毒素中作为黏膜免疫佐剂最常使用的是霍乱毒素(Cholera toxin，CT)和大肠杆菌不耐热肠毒素(Heat-labile enterotoxin，LT)。

中国专利CN101560247中已成功构建无毒性的LTR72/G192双突变体，试验证实，将LTR72/G192蛋白与猪瘟病毒按一定比例配伍后免疫小鼠后，可有效提高小鼠体内的抗体水平，特别是黏膜IgA抗体，进一步证实了LTR72/G192蛋白的黏膜佐剂功能。目前，尚无LTR72/G192双突变体用于冻干疫苗的报道。

一般添加黏膜免疫佐剂后，会增加冻干保护剂筛选的难度。由于病毒和蛋白的结构与功能差异，因此适用于病毒或蛋白的保护剂一般都不同。不论是猪瘟病毒还是黏膜免疫佐剂，其活性在冻干过程中都容易受损，所以必须筛选出一组既能保护猪瘟病毒，又能保护黏膜免疫佐剂活性的冻干保护剂，才能研制出有效的口服冻干疫苗。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种猪瘟口服弱毒冻干疫苗、其制备方法及冻干保护剂，该猪瘟口服弱毒冻干疫苗能较好的保护猪瘟病毒(CSFV)的活性，减少活病毒损失，而且在口服免疫小鼠试验中，能诱导更高水平的IgG和IgA抗体，并促进胸腺和脾脏中I型干扰素的表达，具有保护抗原 活性、提高口服猪瘟抗原免疫效力的作用，可作为口服猪瘟疫苗保护剂进行产业开发。

为了达到以上目的，本发明提供的技术方案如下：

一种猪瘟口服弱毒冻干疫苗，其包括抗原猪瘟病毒、黏膜佐剂和冻干保护剂；其中，所述冻干保护剂包括：1～3wt.％明胶，1～3wt.％甘氨酸，余量为水，所述黏膜佐剂为大肠杆菌热敏性肠毒素突变体(LTRG)蛋白。

进一步，所述的黏膜佐剂为大肠杆菌热敏性肠毒素突变体(LTR72/G192)蛋白，其可作为大多数病毒、细菌等抗原的免疫佐剂。

一种猪瘟弱毒冻干疫苗的制备方法，包括如下步骤：

1)获得猪瘟病毒

设计并合成猪瘟病毒的PCR常规检测引物，增殖猪瘟病毒，分离并测定猪瘟病毒的半数组织培养感染剂量TCID₅₀；

2)配制冻干保护剂和猪瘟口服弱毒疫苗

将明胶和甘氨酸按上述比例配制冻干保护剂，除菌；然后将冻干保护剂与猪瘟病毒、黏膜佐剂混合配制成猪瘟口服弱毒疫苗，并分装；其中，猪瘟病毒和黏膜佐剂的体积比为25:2～5:6，冻干保护剂中的明胶和甘氨酸总质量与疫苗总体积的比值为0.02～0.04，g/ml；

3)冻干猪瘟口服弱毒疫苗

将配制好的样品于-80～-40℃进行预冻，预冻时间24～48h，再进行冻干，获得由猪瘟病毒、黏膜佐剂和冻干保护剂组成的猪瘟口服弱毒冻干疫苗。

进一步，步骤1)中利用PK15细胞增殖猪瘟病毒。

进一步，所述猪瘟病毒的半数组织培养感染剂量为10⁵～10⁶TCID₅₀/0.1ml。

优选地，步骤2)中配制的猪瘟口服弱毒疫苗中黏膜佐剂的浓度为4～6μg/0.1ml或400～600μg/0.1ml。

本发明提供的猪瘟口服弱毒冻干疫苗的冻干保护剂，包括：1～3％明胶，1～3％甘氨酸，余量为水。

本发明以CSFV疫苗毒为研究对象，联合无毒性的黏膜佐剂LTR72/G192，与明胶和甘氨酸按一定比例配比冻干，可以同时很好的保护CSFV和LTRG活性。

本发明的冻干保护剂仅添加了明胶和甘氨酸，但其冻干制品表面平整，均匀一致，避免了添加其他冻干物质时出现的冻干制品萎缩、内部孔径过大、呈蜂窝状的现象，最小限度的降低了CSFV和LTRG活性的损失，提高了LTRG的佐剂功效，使得CSFV的递呈更有利。这对于黏膜免疫是至关重要的。

明胶属于聚合物，在本发明中起到了良好的骨架作用，不仅保护了CSFV和LTRG蛋白在冻干时不受加热的影响，而且防止了配方中的甘氨酸在冻干过程中的碳化和氧化，从而使冻干制品外观较好。此外，甘氨酸可修复因冻干受损伤的CSFV和LTRG蛋白的活性，并对水分子起缓解作用，使冻干制品中含有一定的水分，直接发挥了保护抗原的作用。因而，本发明提高了猪瘟病毒疫苗经口服途径的免疫效果，并进一步证实了LTRG的黏膜佐剂功能。

将本发明的CSFV冻干苗口服免疫小鼠，诱导小鼠产生较CSFV组、CSFV+LTRG组更高水平的IgG和IgA抗体，且小鼠脾脏中IFN-γ和IL-4细胞因子的表达量也极显著高于其他组。因此，在冻干过程中，本发明的冻干保护剂中的明胶和甘氨酸对猪瘟病毒和LTR72/G192蛋白都起到了良好的保护作用，使黏膜佐剂LTRG充分发挥其佐剂作用，提高黏膜免疫效果。

本发明的有益效果：

本发明的冻干保护剂成分简单，仅添加了明胶和甘氨酸，但其冻干制品表面平整，均匀一致，避免了添加其他冻干物质时出现的冻干制品萎缩、内部孔径过大、呈蜂窝状的现象。

利用本发明的冻干保护剂，能同时保护猪瘟病毒和黏膜佐剂的活性，最小限度的降低猪瘟病毒和黏膜佐剂LTRG活性的损失，提高了LTRG的佐剂功效，使得CSFV的递呈更有利，从而诱导机体产生较强的黏膜免疫反应，为后续猪瘟口服疫苗的研制奠定基础。

附图说明

图1为本发明实施例中的CSFV的RT-PCR检测结果。

图2为本发明实施例中冻干疫苗的状态图。

图3为对比冻干保护剂1冻干疫苗的状态图。

图4为对比冻干保护剂2冻干疫苗的状态图。

图5为对比冻干保护剂3冻干疫苗的状态图。

图6为本发明实施例中的口服免疫小鼠的诱导血清IgG水平。

图7为本发明实施例中的口服免疫小鼠诱导黏膜IgA水平。

图8为本发明实施例中的小鼠脾脏IFN-γ表达量。

图9为本发明实施例中的小鼠脾脏IL-4表达量。

图10为本发明实施例中的小鼠胸腺IFN-γ表达量。

图11为本发明实施例中的小鼠胸腺IL-4表达量。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

材料和试剂：

PK-15细胞由上海市农业科学院畜牧兽医研究所人畜共患病实验室保存；

猪瘟活疫苗(细胞源)购自乾元浩生物公司；

DMEM粉末、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自Gibico公司；DL2000DNA Maker、rTaq DNA聚合酶、RNAiso Plus、M-MLV Reverse Transcriptase(RNase H-)、dNTP、PrimeScriptRT reagent Kit RT with gDNA Eraser均购自Takara公司。

胰酶购自北京拜尔迪公司。

DyLight 488Goat anti-mouse IgG购自Biolegend公司。

TransStart Top Green qPCR SuperMix购自全式金生物公司。

其他常规试剂均为国产分析纯级产品。

实施例 猪瘟口服弱毒冻干疫苗的制备方法及其评价，包括：

1.引物设计及合成

根据CSFV E2基因序列，设计并合成1对PCR检测引物，PCR产物大小为287bp，具体序列如下：

CSFV-F1:CAGGTATGCGATCTCGTCAACCA

CSFV-R1:GGGCACAGCCCAAATCCGAAGT

根据小鼠IFN-γ和IL-4基因，分别设计并合成1对IFN-γ和IL-4的荧光定量PCR引物，引物由华大基因科技服务公司合成，具体序列如下：

IFN-γ-1：CCATCGGCTGACCTAGAGAA

IFN-γ-2：GATGCAGTGTGTAGCGTTCA

IL-4-1：GGTCTCAACCCCCAGCTAGT

IL-4-2：GCCGATGATCTCTCTCAAGTGAT

2.猪瘟病毒CSFV的分离与鉴定

利用PK15细胞增殖猪瘟病毒CSFV，待PK15单层细胞融合度达80％左右时，弃去细胞上清，PBS洗涤一次；加入200μl稀释后的猪瘟活疫苗，37℃吸附1h；然后弃去细胞上清，加入含2％FBS的DMEM维持液继续培养。每天观察细胞状态，72h后收毒，将细胞放于-20℃/室温反复冻融3次，然后12000rpm离心10min，去除细胞碎片，吸取200μl上清继续重复上述操作，进行病毒的传代培养。

参照TAKARA Trizol说明书，进行病毒总RNA的提取和反转录，以cDNA为模板，利用合成的CSFV引物，进行PCR检测。

具体反应体系为(50μl)：cDNA 10-100ng、上游引物(10pm)2μl、下游引物(10pm)2μl、10×rTaq Buffer 5μl、dNTP 4μl、rTaq DNA polymerase1μl，然后加ddH₂O补齐到50μl。

优化的PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃45s、57℃45s、72℃45s(35个循环)，72℃延伸10min，最后4℃作用。

利用合成的CSFV的PCR检测引物，对PK15细胞上繁殖的CSFV进行RT-PCR检测，结果如图1所示，能扩增出约287bp的特异性条带，大小正确，与预期相符，说明在PK15细胞上成功增殖CSFV。

3.猪瘟病毒TCID₅₀的测定

将PK15细胞消化后铺于96孔细胞板中，24h后待细胞长至80-90％，将CSFV细胞毒进行10倍梯度稀释，然后每孔接种100μl病毒液，每个稀释度重复8个孔，并设定空白对照；37℃吸附1h，然后弃去细胞上清，加入200μl含2％FBS的DMEM维持液，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；3-5d后，弃去96孔细胞板中上清培养液，PBS洗涤2遍；每孔加入100μl预冷的70％乙醇，-20℃固定细胞15min；弃去固定液，用PBS洗细胞2遍，每孔加入100μl 1％TritonX-100，4℃孵育10min；弃去孔内液体，PBS洗涤2遍，每孔加入100μl鼠抗CSFV多克隆抗体(1：100稀释)，37℃湿盒孵育2h；弃去一抗，PBS洗3遍，每孔加入100μl Dylight488羊抗鼠IgG二抗(1：2500稀释)，37℃孵育45min；弃去二抗，PBS洗3遍，然后在荧光显微镜下观察，并按Reed-Muench法计算TCID₅₀，测得CSFV的毒价为10^5.3TCID₅₀/0.1mL。

4.配制冻干保护剂及CSFV弱毒疫苗

配制本发明冻干保护剂：1％明胶，3％甘氨酸，余量为超纯水。

同时配制对比冻干保护剂：(1)1％明胶，5％乳糖，余量为超纯水；(2)1％明胶，5％乳糖，3％甘氨酸，余量为超纯水；(3)1％明胶，余量为超纯水。

再将配制好的冻干保护剂高压或过滤除菌，然后在超净台中与猪瘟病毒、LTRG蛋白配制成CSFV弱毒疫苗，分装在洁净的青霉素瓶中，每瓶装10头份，每头份为0.1ml。其中，冻干保护剂中的明胶和甘氨酸总质量与疫苗总体积的比值为0.02g/ml，CSFV 10⁵TCID₅₀/头份，LTRG蛋白4μg/头份。

5.冻干CSFV弱毒疫苗

将配制好的样品放于-80℃进行预冻，预冻时间30h，然后放入已调试好的冻干机中进行冻干。

冻干结束后，对各冻干制品进行外观检查，结果参见图2～图5，本发明冻干保护剂配方和对比冻干剂配方(3)的制品表面平整，均匀一致； 而对比冻干保护剂配方(1)与配方(3)的制品出现萎缩，内部孔径过大，呈蜂窝状，各冻干制品用PBS复溶后，均呈现澄清状态。

将不同配方的冻干制品用原体积复溶，并测定CSFV滴度。结果表明，4种冻干苗中CSFV的TCID₅₀分别为10^4.106、10⁴、10^3.7、10^3.38，说明利用本发明的冻干保护剂进行冻干后，CSFV滴度下降最少，冻干保护效果好。

6.冻干CSFV弱毒疫苗的免疫效果评价

1)实验动物分组

小鼠共35只，每组5只，随机分成7组，分别为对照组、CSFV组、CSFV+LTRG组、本发明组、对比配方一组、对比配方二组、对比配方三组。

2)免疫剂量

口服免疫，1头份/只，每只小鼠喂服100μl。免疫前，每只小鼠灌服5％NaHCO₃中和胃酸，2周后，进行二免，共免疫2次。

3)样品的采集与处理

血清的制备：分别在第0、7、14、22、29天断尾采血，采集的血样置于4℃过夜，然后5000rpm离心5min，收集血清用于检测。

粪便样品的收集：分别在第0、7、14、22、29天收集各组小鼠粪便，并称取相同重量的粪便，用400μl PBS溶解，10000rpm离心5min，收集上清用于检测。

小鼠脾脏组织的采集：分别在一免后24h、48h、72h时从各组取一只小鼠，断颈处死并解剖，采集脾脏组织。

所有样品保存在-20℃，备用。

4)间接ELISA检测血清IgG、肛拭子IgA抗体水平

包被：全病毒疫苗作为包被抗原，置4度包被16小时后甩掉板孔中溶液，每孔加入洗涤液200μl，静置3min倒掉，在吸水纸上拍干，共计洗涤4次。

封闭：每孔加入含5％脱脂乳的PBST 200μl，置37℃封闭2小时后清洗4次。

加入样品：血样用含5％脱脂乳的PBST进行20倍稀释，血清1:20 稀释、肛拭子1:5稀释。各取100μl加入到板孔，每个样设2孔，置37℃孵育1.5h后清洗4次。

加入二抗：加入以含5％脱脂乳的PBST稀释的相应酶标抗体(Goat anti-Mouse IgG、Goat anti-Mouse IgA)，每孔100μl，置37℃作用1h后清洗。

显色：每孔加入配制好的显色液50μl，于37℃避光显色10分钟。

终止：每孔加入终止液50μl，10分钟内用酶标仪450nm波长测定结果。

5)统计学分析

用统计学软件SPSS 19.0对ELISA检测数据进行统计学处理，差异显著水平取p<0.05，差异极显著p<0.001。

结果分析：ELISA结果显示，在一免后7天，本发明组和对比配方三组小鼠的IgG水平较其他组有极显著的增高(p<0.01)。对比配方二组小鼠在二免后7天的IgG水平显著高于CSFV组和CSFV+LT组(p<0.05)，但仍低于本发明和对比配方二组(参见图6)。

间接ELISA检测小鼠粪便IgA抗体水平，结果参见图7，可以看出，一免7天、14天后，不同配方组小鼠的粪便IgA水平基本一致，但在二免7天后，本发明组小鼠的IgA水平与其他组相比有极显著差异(p<0.01)，二免14天后，对比配方三组小鼠的IgA较对比配方二组相比也有显著升高(p<0.05)。

6)荧光定量PCR检测细胞因子变化

将采集的小鼠胸腺和脾脏组织研磨，取250μl研磨后的组织悬液，进行总RNA的提取，然后按照TAKARA公司的RT reagent kit with gDNA eraser试剂盒说明书进行反转录。

具体步骤为：首先将提取的总RNA进行去除基因组DNA反应，在冰上配制反应混合液：5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl、gDNA Eraser 1.0μl、Total RNA 1μg、RNase Free dH₂O up to 10μl；然后42℃反应2min，4℃保存。接着在上述溶液中加入PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μl、RT Primer Mix 1.0μl、5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)4.0μl、RNase Free dH₂O 4.0μl，然后在PCR仪上反转录：37℃反应15min，85℃灭活5s，然 后4℃保存。

以上述cDNA为模板，按照TransStart Top Green qPCR SuperMix说明书进行Real-time PCR反应。

具体反应体系为：cDNA，2μl；上游引物(10μM)，0.4μl；下游引物(10uM)，0.4μl；2X TransStart Top Green qPCR SuperMix，10μl；Passive Reference Dye(50×)，0.4μl；ddH₂O，6.8μl；Total volume，20μl。

反应程序为：94℃30sec，94℃5sec，60℃34sec(40cycles)。

数据分析：采用2^-△△Ct方法对荧光定量PCR数据进行统计，并利用SPSS19.0软件进行差异显著性分析。

结果分析：利用荧光定量PCR检测各组小鼠脾脏和胸腺中IFN-γ和IL-4的表达差异，结果如图8，图9，图10，图11所示，CSFV组、CSFV+LTRG组以及本发明组的小鼠脾脏和胸腺中IFN-γ和IL-4的表达量在免疫后12h表达量最高，而对照组基本无变化；且本发明组小鼠脾脏的IFN-γ和IL-4在免疫后12h的表达量极显著高于其他组(p<0.01)。

综上表明，本发明的冻干保护剂可在冻干过程中较好的保护CSFV和LTRG的活性，从而增强小鼠体内的细胞和体液免疫反应，产生持久的IgG和IgA抗体水平，本发明的冻干保护剂可用作猪瘟弱毒口服疫苗。