免疫原性糖肽、包含所述糖肽的组合物及其用途的制作方法

发明领域

本发明涉及癌症的免疫疗法领域。更具体地，本发明涉及免疫原性糖肽、含所述糖肽的药物组合物及其用于增强免疫反应且尤其在癌症疗法中的用途。

发明背景

globoh(fucα1→2galβ1→3galnacβ1→3galα1→4galβ1→4glcβ1→o-cer)是一种六糖且属于过度表达于各种上皮癌细胞(包括乳腺癌细胞、结肠癌细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞和前列腺癌细胞)的表面上的大量肿瘤相关碳水化合物抗原。globoh的异常表达使其成为免疫疗法及研发表达globoh的癌症的癌症疫苗的引人注目的候选者。除了globoh之外，其它已知碳水化合物抗原，包括gm2、gd2、gd3、岩藻糖基-gm1、globo-h、lewis^y(le^y,fucα1→2galβ1→4[fucα1-3]glcnacβ1→3galβ1→o-cer)、tn(galnacα-o-ser/thr)、tf(galβ1→3galnacα-o-ser/thr)和stn(neuacα2→6galnacα-o-ser/thr)，也用作癌症免疫疗法的靶抗原(susanfslovin等人,carbohydratevaccinesasimmunotherapyforcancer,immunologyandcellbiology(2005)83,418–428；zhongwuguoandqianliwang,recentdevelopmentincarbohydrtate-basedcancervaccines,curropinchembiol.2009年12月；13(5-6):608–617；theresebuskas等人,immunotherapyforcancer:syntheticcarbohydrtate-basedvaccines,chemcommun(camb).2009年9月28日；(36):5335–5349)。

然而，大多数碳水化合物抗原通常为免疫系统所耐受，因此，由它们所诱导的免疫原性有限。另外，生产抗特异性免疫原的抗体通常涉及两种类型的淋巴细胞(b细胞和辅助t细胞)的协同相互作用。例如，globoh无法单独激活辅助t细胞，这也是因于globoh的免疫原性差。因此，以globoh的免疫接种通常具有以下特征：免疫球蛋白m(igm)的滴度低且无法类别转化为免疫球蛋白g(igg)，以及抗体亲和力成熟无效。

已开发出各种途径来解决上述缺陷。在某些研究中，具有t-表位的外来载体蛋白质或肽(诸如钥孔戚血蓝素(klh)或去毒破伤风类毒素(tt))已与碳水化合物抗原缀合，以期改善碳水化合物抗原的免疫原性。us20010048929提供一种多价免疫原性分子，其包括含至少一个功能t细胞表位的载体分子和多个各连接至该载体分子及各含至少一种功能b细胞表位的不同碳水化合物片段，其中该载体分子赋予该多个碳水化合物片段提高的免疫原性，且其中该碳水化合物片段是globoh、ley或stn。us20120328646提供一种含有经由对硝基苯基连接子以化学方式缀合至免疫原性载体白喉毒素交叉反应物质197(dt-crm197)(th表位)的globoh(b细胞表位)的基于碳水化合物的疫苗，其在乳腺癌模型中提供免疫原性，结果显示在异种移植研究中的肿瘤形成延迟。us20120263749涉及一种用于治疗癌症的多价疫苗，其包含至少两个选自包含以下的组的缀合抗原：诸如globoh、lewis抗原和神经节苷脂的糖脂抗原、多糖抗原、粘蛋白抗原、糖基化粘蛋白抗原和适合的佐剂。

尽管如此，将碳水化合物缀合至载体蛋白质带来几个新的问题。根据ingale等人，外来载体蛋白质及将载体蛋白质与碳水化合物连接在一起的连接子可引发强烈b细胞反应，从而导致抑制抗碳水化合物表位的抗体反应(ingales.等人，robustimmuneresponseselicitedbyafullysyntheticthree-componentvaccine.natchembiol.2007年10月；3(10):663-7.epub2007年9月2日)。此外，ingale等人也指出，缀合化学难以控制，得到组成及结构具有不确定性的缀合物，其可影响免疫反应的可再现性。考虑到上述因素，ingale等人认为，使用碳水化合物-蛋白质缀合物的临床前及临床研究导致混合结果并不出人意料。例如，kuduk等人教示，在佐剂qs-21存在下用缀合至klh的tn-抗原的三聚体簇的免疫接种在小鼠中引起适度igg抗体效价(kuduksd等人，syntheticandimmunologicalstudiesonclusteredmodesofmucin-relatedtnandtfo-linkedantigens:thepreparationofaglycopeptide-basedvaccineforclinicaltrialsagainstprostatecancer.jamchemsoc.1998；120:12474–12485)；而slovin等人教示，相同疫苗在复发性前列腺癌患者的临床试验中提供低中值igg及igm抗体效价(slovinsf等人，fullysyntheticcarbohydrate-basedvaccinesinbiochemicallyrelapsedprostatecancer:clinicaltrialresultswithalpha-n-acetylgalactosamine-o-serine/threonineconjugatevaccine.jclinoncol.2003；21:4292–4298)。

此外，对于具有免疫低下状态的癌症患者，具体地在接受化疗或放射疗法的患者以及晚期癌症患者中，主动免疫干预的疗效通常有限，因为这些患者可能无法产生足够引发抗肿瘤效应的抗体。

鉴于前文，此项技术中存在研发用于改良基于碳水化合物的疫苗的免疫接种和/或疗效的替代性策略的需求。

技术实现要素：

下文呈现本公开的简单概述，以供读者的基本理解。此发明内容并非本公开的详尽概述，且其并未明确本发明的关键/决定性元素或描述本发明的范围。其唯一目的是简单呈现本文所公开的一些概念，作为稍后呈现的较详细描述的引子。

在一方面，本公开涉及免疫原性糖肽或其衍生物，其中免疫原性糖肽或其衍生物可在体内引发针对globoh的高滴度的免疫球蛋白g(igg)和免疫球蛋白m(igm)抗体。

根据本公开的一个实施方案，免疫原性糖肽具有以下结构：

其中padre是泛-dr表位且具有至少10个连续氨基酸残基，其与akxvaawtlkaaa(seqidno:1)的氨基酸序列至少90％相同，其中x是环己基丙氨酸残基；且其中p是globoh、gd2、gm2、ssea4、lewisy或stn。

根据另一个实施方案，padre的氨基酸序列与seqidno:1的氨基酸序列相同。

在另一方面，本公开涉及一种用于治疗有此需要的受试者的癌症的药物组合物。

根据本公开的一个实施方案，所述药物组合物包含(1)治疗有效量的根据本公开的任何上述方面/实施方案的免疫原性糖肽，及(2)药学上可接受的载体。

根据本公开的某些实施方案，所述癌症是任何表达肿瘤相关碳水化合物的癌症；优选地，所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌或肺癌。

在又一方面，本公开涉及治疗有此需要的受试者的表达肿瘤相关碳水化合物的癌症的方法。

根据本公开的实施方案，所述方法包括向受试者施用根据本公开中描述的任何方面/实施方案的免疫原性糖肽或药物组合物。

参考以下详述结合附图考虑，将更好地理解本公开的许多伴随特征和优势。

附图简述

图1(a)和(b)提供了条形图，说明用根据本公开的一个工作实例的globoh-padre糖肽免疫接种的小鼠的igm滴度(图1(a)：稀释血清igm1:100，和图1(b)：稀释血清igm1:1000)。

图2(a)和(b)提供了条形图，说明用根据本公开的一个工作实例的globoh-padre糖肽免疫接种的小鼠的igg滴度(图2(a)：稀释血清igg1:100，和图2(b)：稀释血清igg1:1000)。

图3(a)和(b)显示抗-globohigg和igm抗体与globoh的结合亲和力(图3(a)：抗-globohigg抗体与globoh的结合亲和力，和图3(b)：抗-globohigm抗体与globoh的结合亲和力)。

图4(a)和(b)显示通过直接缀合padre至globo和qs21佐剂(2μg)用2μg糖肽免疫接种的小鼠(mmouse)展现出具有免疫增强作用的高滴度的抗-globohigg和igm。mz-11-globoh:globoh-padre,mz-11-4ka-globoh:padre-支化globoh。

图5显示来自用globoh-padre(+佐剂qs21)接种的小鼠的血清中的抗体结合至表达globoh的mcf-7细胞。mz-11-globoh:globoh-padre。

图6(a)和(b)显示糖肽globoh-padre(m)比常见载体蛋白质-globoh缀合(c)诱导更高滴度的抗-globohigg抗体。c:对照；q:佐剂qs21。图6(a)是指小鼠-抗-globoiggelisa的结果且图6(b)是指小鼠-抗-globoigmelisa的结果。

图7(a)和7(b)显示接受糖肽globoh-padre的单个小鼠中的抗体滴度一直较高，而接受载体蛋白质-globoh缀合的小鼠中的抗体滴度是可变的且大部分是低的。图7(a)是指g疫苗小鼠抗-globohiggelisa的结果，而图7(b)是指mz-11-globo疫苗小鼠抗-globoiggelisa的结果。g1-g10表示接受载体蛋白质-globoh疫苗的小鼠编号1-编号10。m1-m10表示接受糖肽globoh-padre疫苗的小鼠编号1-编号10。

图8(a)和(b)显示糖肽globoh-padre(m)诱导长期抗-globohigg，而一般载体蛋白质-globoh缀合(g)不诱导。图8(a)是指小鼠血清抗-globohigg的结果且图8(b)是指小鼠血清抗-globohigm的结果。

图9(a)和(b)显示解剖接受糖肽globoh-padre的单个小鼠显示持续长寿高滴度抗-globohigg抗体(图9(a)：d109小鼠血清抗-glibohigg和图9(b)：d109小鼠血清抗-glibohigm)。g1-g10表示接受载体蛋白质-globoh疫苗的小鼠编号1-编号10。m1-m10表示接受糖肽globoh-padre疫苗的小鼠编号1-编号10。

图10(a)和(b)显示gm2-padre糖肽诱导高滴度抗-碳水化合物igg抗体(图10(a)：诱导igg和图10(b)：诱导igm)。

图11显示由globoh-padre疫苗治疗的小鼠显示更慢的肿瘤生长。

图12显示通过过继转移来自用globoh-padre疫苗免疫接种的小鼠的血清治疗的小鼠显示小肿瘤负荷。

图13(a)至(h)显示由globoh-、gm2-、lewisy-padre缀合混合物或者ssea4-、gm2-、lewisy-padre缀合混合物组成的多价疫苗可诱导针对各个碳水化合物抗原的每一个的高滴度的igg(图13(a)：globoigg；图13(b)：globoigm；图13(c)：gm2igg；图13(d)：gm2igm；图13(e)：lewisyigg；图13(f)：lewisyigm；图13(g)：ssea4igg以及图13(h)：ssea4igm)。

发明详述

本发明至少基于以下发现：肿瘤相关的碳水化合物抗原与padre序列的糖肽缀合物能够在哺乳动物中引发免疫响应。糖肽促进b细胞和t细胞的激活，从而导致特异性结合至碳水化合物抗原的igm和igg的产生。具体地，该糖肽缀合物可用作能够诱导高滴度抗-碳水化合物igg抗体的疫苗以用于治疗癌症表达肿瘤相关的碳水化合物抗原。更具体地，多价糖肽缀合物疫苗引发高滴度多价抗-碳水化合物igg抗体以用于治疗癌症表达肿瘤相关的碳水化合物抗原。

因此，在一方面，本公开涉及免疫原性糖肽。此外，可提供根据本公开的免疫原性糖肽以用于治疗(包括预防)癌症；例如，其应制造为药剂，如包含在药物组合物中。本免疫原性糖肽及包含其的药物组合物还可应用在用于治疗和/或预防癌症的方法中。因此，本公开还考虑了用于治疗罹患癌症的受试者体内的癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所定义的糖肽或药物组合物。

定义

除非本文另有定义，否则本发明中所用科学及技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解和使用的含义。除非上下文另有要求，否则应理解，单数术语应包括其复数形式，且复数术语包括单数。具体而言，如本文和权利要求中所使用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个(a)”和“一种(an)”包括复数形式。同样，如本文和权利要求中所使用，术语“至少一个”和“一个或多个”具有相同含义，且包括一个、二个、三个或更多。

尽管描述本发明的宽广范围的数值范围和参数是近似值，但描述于具体实例中的数值尽可能精确地报告。然而，任何数值固有地包含必然由见于各次试验测量的标准偏差所导致的特定误差。同样，如本文所使用，术语“约”通常意指在给定值或范围的10％、5％、1％或0.5％内。或者，当由本领域普通技术人员考虑时，术语“约”意指在平均值的可接受标准偏差内。除在操作/工作实例中以外，或除非另有明确规定，否则本文所公开的所有数值范围、量、值及百分比(诸如那些材料的用量、持续时间、温度、操作条件、量的比率及其类似物者)应理解为在所有情形下经术语“约”修饰。因此，除非有相反指示，否则描述于本发明及附随权利要求中的数字参数为可视需要变化的近似值。至少，各数字参数应至少根据所报告的有效数字及通过应用普通舍入技术理解。

如本文所使用的术语“抗原”定义为可引起免疫反应的物质。该免疫反应可包括产生抗体或激活特定免疫机能健全的细胞，或两者。如本文所使用，术语“免疫原”是指能诱导产生抗体的抗原。同样，术语“免疫原性”通常是指免疫原或抗原刺激免疫反应的能力。

术语“表位”是指常规地通过免疫球蛋白vh/vl对结合的结构单元。表位定义抗体的最小结合部位，且因此代表抗体的特异性的目标。

如本文所用，术语"糖肽"是指其中碳水化合物共价连接至肽或寡肽的化合物。

除非另有规定，否则在本文所用的肽标记法中，按照标准用法及习惯，左手方向是氨基酸(n端)方向，且右手方向是羧基端(c端)方向。

相对于本文所确定的氨基酸序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列及视需要引入空隙以实现最大百分比的序列同一性，以及不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中的氨基酸残基与特定多肽序列中的氨基酸残基一致的百分比。为了确定序列同一性百分比的比对可以各种在专业技术内的方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，诸如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件。本领域的技术人员可测定衡量比对的适合的参数，包括达成最大限度比对所比较序列的全长所需的任何算法。基于本文目的，两个氨基酸序列的序列比较通过国立生物技术信息中心(nationcenterforbiotechnologyinformation)(ncbi)在线提供的计算机程序blastp(蛋白质-蛋白质blast)而进行。具体而言，给定氨基酸序列a相对于给定氨基酸序列b的氨基酸序列同一性百分比(其或者可表述为相对于给定氨基酸b具有某％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列a)由如下公式计算：

其中在用程序比对a与b时，x是通过序列比对程序blast记为一致匹配的氨基酸残基的数量，且其中y是a或b中氨基酸残基的总数量，以较短者为准。

如本文所述，蛋白质/多肽的氨基酸序列的少量变动视为被当前所公开及主张的发明概念所涵盖，前提是氨基酸序列的变动保持至少90％，诸如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％及99％。具体地，涵盖保守氨基酸置换。保守置换是发生在侧链相关的氨基酸家族内的那些。基因编码的氨基酸通常分成以下家族：(1)酸性天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；以及(4)不带电极性甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更优选的家族是：丝氨酸和苏氨酸是脂族羟基家族；天冬酰胺和谷氨酰胺是含酰胺家族；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸是脂族家族；且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是芳族家族。例如，可合理地预期，单独用异亮氨酸或缬氨酸置换亮氨酸，用谷氨酸置换天冬氨酸，用丝氨酸置换苏氨酸，或类似地用结构相关氨基酸置换氨基酸将不会对所得分子的结合或性质具有重大影响，特别是在该置换并未涉及框架部位内的氨基酸的情形下。可通过分析多肽衍生物的特异活性，轻易确定氨基酸变化是否产生功能肽。可由本领域普通技术人员轻易制备蛋白质/多肽的片段或类似物。片段或类似物的优选胺基-及羧基-端出现在靠近功能域边界。

除非与上下文相反，否则本文使用术语“治疗”来广泛地包括产生期望药理和/或生理效果的预防性(例如，防范性)、治愈性或缓解性措施。优选地，就部分或完全治愈或预防癌症而言，该效果是治疗性的。同样，如本文所使用的术语“治疗(treatment)”及“治疗(treating)”是指向患有癌症、具有癌症症状、继发于癌症的疾病或病症、癌症倾向的受试者施加或施用本发明免疫原性糖肽、抗体或含上述任一个的药物组合物，目的在于部分或完全缓解、改善、舒缓癌症的一种或多种症状或特征、延迟其发作、抑制其进展、减轻其严重性和/或降低其发生率。通常，“治疗”不仅包括改良症状或减少疾病标记物，而且包括中止或减缓不进行治疗将预期的症状的进展或恶化。本文也可在狭义上使用术语“治疗”，其仅是指旨在改善和/或治愈患者或受试者中已经存在的疾病状态或病状的治愈性或缓解性措施。

如本文所使用的术语“预防”是指阻止在患者或受试者中出现疾病状态或病状的预防性措施。预防也可包括减少患者或受试者中出现疾病状态或病状的可能性及阻碍或阻止该疾病状态或病状的发作。

如本文所使用，术语“治疗有效量”是指活性组分足以产生期望治疗反应的量。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过化合物或组合物的任何毒性或有害效果的量。

如本文所使用，“药学上可接受的载体”为适合受试者使用，而无不当的有害副作用(诸如毒性、刺激及过敏反应)且符合合理的效益/风险比的一种。同样，在与药物组合物的其他成分兼容的意义上，各载体必须是“可接受的”。该载体可呈固体、半固体或液体稀释剂、乳膏或胶囊的形式。在与制剂的其他成分兼容的意义上，载体必须是“可接受的”，且经选择以最大限度减少活性剂的任何降解及最大限度减少在受试者中的任何有害副作用。

如本文所用，术语"佐剂"是指修改免疫原作用的免疫试剂，同时当独自施用时基本没有(如果有的话)直接作用。其通常被包含在疫苗内以增强接受者对供应的抗原的免疫反应，同时保持注射的外来物质最少。添加佐剂以刺激免疫系统对靶抗原反应，但其本身不赋予免疫性。

如本文所用，术语“受试者”是指可用抗体治疗的哺乳动物，包括人类。术语“受试者”意指男性及女性，除非具体指明一种性别。

本发明的免疫原性糖肽

在一方面，本发明提供具有以下结构的免疫原性糖肽：

其中padre是泛-dr表位且具有至少10个连续氨基酸残基，其与akxvaawtlkaaa(seqidno.1)的氨基酸序列具有至少80％同一性，其中x是环己基丙氨酸残基；且其中p是globoh、gd2、gm2、ssea4、lewis、lewisy或stn。优选地，如上提及的序列同一性是至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

padre序列是经工程化引入锚残基用于不同的已知dr-结合基序的非天然序列。例如，位置3处的x(环己基丙氨酸)是对应于dr-结合基序的位置1的脂肪族残基，位置8处的t是对应于dr-结合的位置6的不带电的羟基化残基；而位置11处的a是对应于dr-结合基序的位置9的小疏水性残基。通常，用基本上相同的化学和/或结构性质的另一个残基取代一个残基，如用芳族f(苯丙氨酸)取代x(环己基丙氨酸)，将不显著影响padre序列的结合亲和力。

根据另一个实施方案，padre的氨基酸序列与seqidno.1的氨基酸序列相同。

根据本公开的各个实施方案，padre序列具有10至20个氨基酸残基。在一个实施方案中，可省略最后残基(k)。在某些实施方案中，省略第一残基(a)或前两个残基(a和k)。在一个实施方案中，padre序列缺乏前两个残基和最后残基。

本发明抗体的免疫原性糖肽的组成和应用

为了预防受试者感染癌症，本免疫原性糖肽或包含其的药物组合物以治疗(或免疫原性)有效量施用至受试者。因此，所述药物组合物和治疗方法也落入本发明的范围内。

在一方面，本发明提供包含如本文所述的本发明的一种或多种免疫原性糖肽的药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物是疫苗。在一个实施方案中，所述组合物是疫苗。在另一个实施方案中，所述组合物是包含如本文所述的一种或多种globoh-、gm2-、lewisy或ssea4-padre糖肽的多价疫苗。在另一个实施方案中，所述组合物是包含如本文所述的globoh-、gm2-和lewisy-padre糖肽或者ssea4-、gm2-和lewisy-padre糖肽的多价疫苗。

除了免疫原性糖肽之外，所述药物组合物还可包含药学上可接受的载体。所述药物组合物还可包含一种或多种药学上可接受的添加剂，包括粘合剂、调味剂、缓冲剂、增稠剂、着色剂、抗-氧化剂、稀释剂、稳定剂、缓冲剂、乳化剂、分散剂、助悬剂、抗菌剂等。

除了免疫原性糖肽之外，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。所述药物组合物还可包含一种或多种药学上可接受的添加剂，包括粘合剂、调味剂、缓冲剂、增稠剂、着色剂、抗氧化剂、稀释剂、稳定剂、缓冲剂、乳化剂、分散剂、助悬剂、抗菌剂等。

待与本糖肽结合使用的药学上可接受的载体的选择基本上由本组合物施用的方式确定。本发明的药物组合物可经口或皮下、静脉内、硬膜内或肌内注射施用。

用于施用的注射剂可在无菌水性或非水性溶液、混悬液和乳液中制备。非水性溶解的实例包括但不限于丙二醇、乙二醇、植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。水性载体的说明性实例包括水、醇性/水性溶液、乳液或混悬液，包括盐水和缓冲介质。常见的肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖(ringer'sdextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液(lactatedringer's)或不挥发油；而静脉内媒介物通常包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏右旋糖的那些)等。

任选地，药学上可接受的载体可为免疫原性佐剂。可替代地，本药物组合物可任选地包含免疫原性佐剂。免疫原性佐剂是当与抗原合并时与单独由抗原诱导的反应相比增加抗原免疫反应的化合物。例如，佐剂可放大体液免疫反应、细胞调节的免疫反应或两者。示例性免疫原性佐剂包括但不限于矿物盐、多核苷酸、多聚精氨酸、iscom、皂角苷、单磷酰脂质a、咪喹莫特、ccr-5抑制剂、毒素、聚磷腈、细胞因子、免疫调节蛋白、免疫刺激融合蛋白、共刺激分子及其组合。矿物盐包括但不限于aik(so4)2、alna(so4)2、alnh(so4)2、二氧化硅、矾、al(oh)3、ca3(po4)2、高岭土或碳。有用的免疫刺激多核苷酸包括但不限于具有或不具有免疫刺激复合物(iscom)的cpg寡核苷酸、具有或不具有聚精氨酸的cpg寡核苷酸、聚ic或聚au酸。毒素包括霍乱毒素。皂角苷包括但不限于qs21、qs17或qs7。此外，实例是胞壁酰二肽、n-乙酰基-胞壁酰-l-苏氨酰-d-异谷酰胺(thr-dmp)、n-乙酰基-正胞壁酰-l-丙氨酰-d-异谷酰胺、n-乙酰基胞壁酰-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺酰基-l-丙氨酸-2-(1`2`-二棕榈酰基-sn-油酰基-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺、于2％角鲨烯/tween80乳液中的ribi(mpl+tdm+cws)、脂多糖及其各自衍生物，包括脂质a、弗氏完全佐剂(freund'scompleteadjuvant，fca)、弗氏不完全佐剂(freund'sincompleteadjuvant)、默克佐剂(merckadjuvant)65、多核苷酸(如聚ic和聚au酸)、来自结核分支杆菌(mycobacteriumtuberculosis)的蜡d、在短小棒状杆菌(corynebacteriumparvum)、百日咳博德特杆菌(bordetellapertussis)及博特杆菌属的成员中发现的物质、titermax、quila、alun、脂质a衍生物、霍乱毒素衍生物、hsp衍生物、lps衍生物、合成肽基质或gmdp、montanideisa-51和qs-21、cpg寡核苷酸、聚i:c和gmcsf。还可使用佐剂的组合。优选地，所述佐剂是铝盐(诸如磷酸铝和氢氧化铝)、磷酸钙、聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚i:c)、cpg基序及皂角苷(诸如quila或qs21)。优选地，所述佐剂是氢氧化铝或qs21。

在另一方面，本发明提供用于预防和/或治疗癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的本文所述的免疫原性糖肽或其衍生物。

根据下文呈现的各种工作实例，用约2μg至54μg免疫原性糖肽免疫接种的成人c57bl/6小鼠(重量20-25g)引发了所需的免疫反应。因此，在本公开的某些实施方案中，用于小鼠的治疗有效量的免疫原性糖肽可表达为0.08-27mg/kg体重。

对于人受试者的治疗有效量可根据各种得到确认的标准或转化方法从动物剂量估计。例如，美国卫生和人类服务部食品和药物管理局(foodanddrugadministrationofu.s.departmentofhealthandhumanservices)的“关于成人健康志愿者体内的治疗剂的初始临床试验行业估计最大安全的起始剂量的指导(guidanceforindustryestimatingthemaximumsafestartingdoseininitialclinicaltrialsfortherapeuticsinadulthealthyvolunteers)”提供多种转化因子用于转化动物剂量为人等效剂量(hed)。对于重量为11至34g的小鼠，为了转化小鼠剂量(按mg/kg计)为60kg成人的hed(按mg/kg计)，将小鼠剂量乘以0.081。在这种情况下，对于成人受试者，本免疫原性糖肽的治疗有效量是0.06-2.2mg/kg体重。根据本公开的各种实施方案，当受试者是人时，免疫原性糖肽的治疗有效量可为至少1mg/kg。

根据本公开的各个实施方案，可通过免疫原性糖肽、包含其的药物组合物或本文所述的治疗方法治疗的癌症是表达肿瘤相关碳水化合物的癌症；优选地，所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌或肺癌。

提供以下实施例来阐述本发明的某些方面及协助本领域的技术人员实施本发明。这些实施例绝不应视为以任何方式限制本发明范围。无需进一步详述，据信本领域的技术人员基于本文描述即可最大限度使用本发明。本文所引用的所有公开案的全文以引用的方式并入本文中。

实施例

实施例1免疫原性globoh-padre糖肽的制备

将5.5mg定制合成的padre-叠氮化物溶解于110μldmso中，并将5mggloboh-b-n-乙酰基炔丙基(carbosynth)溶解于1ml蒸馏水中，其中padre具有如seqidno:1所示的序列。对于点击反应，将1μmolpadre-叠氮化物和1μmolgloboh-b-乙酰基炔丙基首先混合并添加蒸馏水至500μl的最终体积，然后在磁力搅拌下依序添加500μl叔丁醇(sigma)、200μl100mmcuso4·5h2o(sigma)和160μl500mm新鲜制备的na-l-抗坏血酸(sigma)。将混合物在室温下在搅拌下孵育过夜，然后添加50μl27％氢氧化铵(sigma)。将产物globoh-padre糖肽用一体积的蒸馏水进一步稀释并贮藏在4℃下。

实施例2抗-globohigg和igm抗体的产生

向成人雌性c57bl/6小鼠(每组5只5周龄，平均重量16-20gm；biolasco,taiwan,r.o.c.)皮下注射以上实施例1的globoh-padre糖肽连同作为佐剂的完全弗氏佐剂(cfa；来自sigma)至腹部区域。以2周间隔给予三次免疫接种；每次接种含有2、6或18μggloboh-padre糖肽与50μl佐剂。在最后免疫接种后一周收集血清，然后经受酶联免疫吸附测定(elisa)以测量抗-globoh抗体的产生。注射了pbs的首次接触实验小鼠的血清和仅用佐剂免疫接种的小鼠的血清用作阴性对照。针对mbr1抗体(enzolifescience；0.5μg/ml)或mz-2抗体(在以下实施例3中产生；1μg/ml)产生的血清用作阳性对照。

对于elisa，将用globoh-padre免疫接种的小鼠稀释的血清(1:100或1:1000)添加至96-孔elisa板的指定孔内，并在室温下孵育一小时。然后将孔用1xpbs中的0.1％tween-20洗涤六次。此后，将1:2500稀释的抗-小鼠igg-hrp或抗-小鼠igm-hrp(jacksonimmunoresearch)添加至孔中,并在室温下再孵育一小时，并用于1xpbs中的0.1％tween-20洗涤六次。显色通过用dmtelisa试剂盒孵育经洗涤的孔进行，并通过添加2nh2so4终止。读取信号并通过elisa读出器在o.d.450nm(参考：540nm)下记录。elisa结果描述于图1(图(a)：经稀释的血清igm1:100和图(b)：经稀释的血清igm1:1000)和图2中(图(a)：经稀释的血清igg1:100和图(b)：经稀释的血清igg1:1000)。

图1中的数据表明globoh-padre糖肽诱导抗-globohigm的产生。对于用2μggloboh-padre糖肽免疫接种的小鼠，抗-globohigm滴度随着免疫接种进行而增加。

进行细胞结合测定以阐明抗-globohigg和igm抗体与globoh的结合亲和力。简而言之，将100μl1:10经稀释的血清或于1xpbs中的10μg/ml单克隆抗体用2x10⁵个细胞在室温下孵育20分钟。将细胞用2ml1xpbs洗涤一次。离心后，弃掉洗涤缓冲液，并将细胞重悬于100μl1:100经稀释的pe抗-小鼠igg-fc(jacksonimmunoresearch)或100μl1:100经稀释的pe抗-小鼠igm(ebioscience)中，并在室温下再次孵育20分钟。将细胞用pbs洗涤并在离心后重悬于200μl1xpbs中。抗体与细胞的结合通过流式细胞术检测。细胞结合测定的结果概述于图3中(图3(a)：抗-globohigg抗体与globoh的结合亲和力和图3(b)：抗-globohigm抗体与globoh的结合亲和力)。如可从图3中所见，从用本globoh-padre糖肽免疫接种获得的抗-globohigg抗体展现了表达globoh抗原的mcf-7细胞的优良识别。

实施例3直接缀合padre与globoh诱导高滴度的抗-globohigg，具有增强作用

将c57bl/6小鼠用2ug或8ug单独的globoh缀合的疫苗(mz-11-globoh)或者8ug4globoh缀合的疫苗(mz-11-4ka-globoh)+作为佐剂的qs-21以2周的间隔免疫接种3次。在每次免疫接种之前和每次免疫接种之后7天收集血清。对于elisa测定，将1ug链霉亲和素(21135,thermo)溶解于100ul1xpbs中，并在装载生物素-globoh(0.1ug/孔)之前涂覆在96-孔costar测定板(9018,corning)上。然后将孔用1xpbs中的1％bsa阻断，且用1:1000稀释的血清在相同的阻断溶液中孵育，然后用1xpbs-0.1％tween20洗涤。将结合的小鼠igg和igm使用hrp-缀合的山羊抗-小鼠igg-fc(1:5000；115-035-071,jacksonimmunoresearch)和hrp-缀合的山羊-抗-小鼠igmμ链(1:5000；ap128p,millipore)检测。显色通过添加100ulnea-blue溶液(010116-1,clinicalsciencepruducts)进行且用50ul2n硫酸终止。o.d.在450nm下读取，减去作为对照的540nm。图4显示通过直接缀合padre至globo和qs21佐剂(2μg)用2μg糖肽免疫接种的m小鼠展现高滴度的抗-globohigg和igm，具有免疫增强作用。mz-11-globoh:globoh-padre,mz-11-4ka-globoh:padre-支化globoh。

实施例4用globoh-padre免疫接种的小鼠的血清内的igg有效结合至表达globoh的乳腺癌细胞系(mcf-7)

将c57bl/6小鼠用单独的佐剂或者2、6或18uggloboh-padre(mz-11-globoh)以2周的间隔免疫接种3次。抗-血清在最后免疫接种后7天收集。收集未进行免疫接种的小鼠的血清作为对照。对于facs，5x10⁵个mcf-7细胞用100ul的1:10稀释的血清在流动管中染色、然后用100ul的1:100稀释的pe-缀合的山羊抗-小鼠igg-fc抗体(115-116-071,jacksonimmunoresearch)和1:100稀释的apc-缀合的大鼠抗-小鼠igm(17-5790-82,ebioscience)染色。将染色的细胞使用bdfacscalibur分析。图5显示用globoh-padre(+佐剂qs21)接种的小鼠的血清内的抗体结合至表达globoh的mcf-7细胞。mz-11-globoh:globoh-padre。

实施例5globoh-padre(m)比具有类别转换的载体蛋白质-globoh(g)诱导高得多的滴度抗-globohigg

将c57bl/6小鼠用佐剂(qs2120ug/小鼠)、2ug一般载体蛋白质-globoh缀合(g)疫苗或globoh-padre缀合(mz11-globoh)疫苗以2周间隔免疫接种。抗-globoh血清在每次接种之前和每次接种之后7天收集。抗-globoh血清于汇集的血清或每只小鼠中的滴度通过elisa测定用适当的二抗检测。图6显示糖肽globoh-padre(m)比一般载体蛋白质-globoh缀合(c)诱导更高滴度的抗-globohigg抗体。c：对照；q：佐剂qs21。图7显示接受糖肽globoh-padre的单独的小鼠内的抗体滴度一直较高，而接受载体蛋白质-globoh缀合的小鼠中的抗体滴度是可变的并且大部分较低，且其代表globoh-padre(m)在单独的小鼠中稳定诱导高滴度的抗-globohigg。

实施例8globoh-padre(m)诱导长寿抗-globohigg抗体和b细胞记忆反应

抗-globoh血清在最后接种(d64和d109)后第36和81天收集。抗-globoh抗体的滴度、汇集的血清或每只小鼠中的抗-globoh血清的滴度通过elisa测定用经1/10000稀释的适当的二抗检测。图8显示糖肽globoh-padre(m)诱导长期抗-globohigg，而一般载体蛋白质-globoh缀合(g)不诱导且图9显示解剖接受糖肽globoh-padre的单独的小鼠显示持续长寿的更高滴度抗-globohigg抗体。极低水平的抗-globohigg抗体在接受载体蛋白质-globoh缀合的小鼠中是显著的。

实施例9碳水化合物-padre糖肽诱导高滴度抗-碳水化合物igg抗体(gm2作为实例)

将c57bl/6小鼠用佐剂(qs2120ug/小鼠)或gm2-padre缀合疫苗与佐剂(qs-2120ug/小鼠)以2周间隔免疫接种。抗-gm2血清在每次接种之前和每次接种之后7天收集。抗-gm2血清于汇集的血清或每只小鼠中的滴度通过elisa测定用适当的二抗检测。图10显示了gm2-padre糖肽诱导高滴度抗-碳水化合物igg抗体。

实施例10globoh-padre糖肽疫苗在免疫-感受态小鼠模型中的抗肿瘤作用

将小鼠分成3组，并以2周间隔皮下(s.c.)施用1xpbs(对照)、仅20ugqs-21或6uggloboh-padre(mz11-globoh)+20ugqs-21。第三次接种后七天，向小鼠s.c.植入1×10⁵个llc1细胞，并且同时再次接种。在肿瘤接种后免疫接种间隔变为7天。肿瘤尺寸通过侧径器在肿瘤植入后第7、10、14和18天测量，并测量为长x宽x高。图11显示用globoh-padre疫苗治疗的小鼠显示更慢的肿瘤生长(免疫-感受态小鼠中的llc1细胞皮下肿瘤模型)。

实施例11过继转移免疫接种的血清至腹膜内卵巢肿瘤模型显示显著的抗肿瘤功效

将小鼠分为2组。收集血清从组1未进行免疫接种的小鼠作为对照。血清也从以2周间隔接种globoh-padre(mz11-globoh)3次的组2小鼠收集作为抗-globoh血清。一百万个tov21g细胞腹膜内(i.p.)植入5周龄雌性nu/nu小鼠(biolascotaiwan)。4天后，每周3次通过i.p.途径向小鼠施用200μl对照血清或抗-globoh血清。未处理的小鼠用作对照。为了监测肿瘤生长，向携带肿瘤的小鼠i.p.注射200μl萤光素(3.9mg/ml)。每只小鼠的化学发光强度通过每实验批次的具有固定暴露条件的非侵入性ivis系统(xenogen)检测。图12显示可通过过继转移用globoh-padre疫苗免疫接种的小鼠的血清治疗的小鼠显示较小的肿瘤负荷(免疫受损小鼠中的人卵巢癌tov21g细胞腹腔内肿瘤模型)。

实施例12多价疫苗针对各个碳水化合物抗原的每一个有效诱导高滴度抗-碳水化合物igg抗体

将c57bl/6小鼠用单独的佐剂(qs-21)或者2μggloboh-padre或4μgssea4-padre的掺混物及2μggm2-padre和4μglewisy-padre+佐剂qs21以2周间隔免疫接种6次。抗-血清在免疫接种后第一天和每7天收集。对照血清从未进行免疫接种的小鼠收集。对于elisa测定，96-孔costar测定板(9018,corning)用于1xpbs中的1μg链霉亲和素(21135,thermo)在4℃下涂覆过夜且用于1xpbs中的1％bsa(alb001.100,bioshop)阻断。然后装载作为抗原的0.1μg生物素-缀合的碳水化合物，并用1:1000和1:10000稀释的血清于阻断溶液中孵育，然后于1xpbs0.05％tween20中洗涤。小鼠igg和igm使用hrp-缀合的山羊抗-小鼠igg-fc(1:5000115-035-071,jacksonimmunoresearch)和hrp-缀合的山羊抗-小鼠igmμ链(1:5000；ap128p,millpore)检测。显色通过添加100μlnea-blue溶液(010116-1,clinicalscienceproducts)进行，并用50μl2n硫酸终止。o.d.值在450nm下读取，减去作为对照的540nm。图13显示了由globoh-、gm2-、lewisy-padre缀合混合物或ssea4-、gm2-、lewisy-padre缀合混合物组成的多价疫苗可针对各种碳水化合物抗原的每一个诱导高滴度igg(图13(a):globohigg1000x；图13(b):globohigm1000x；图13(c):gm2igg1000x；图13(d):gm2igm1000x；图13(e):lewisyigg1000x；图13(f):lewisyigm1000x；图13(g):ssea4igg1000x；图13(h):ssea4igm1000x)。