本发明涉及本发明涉及包含肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，hgf)或上述肝细胞生长因子的异构体及基质细胞衍生因子1α(stromalcellderivedfactor1α，sdf-1α)或者编码上述蛋白质的多核苷酸作为有效成分的用于预防或治疗外周动脉疾病的药剂学组合物。
背景技术：
：：本专利申请主张对于在2014年9月26日提交于韩国知识产权局的韩国专利申请第10-2014-0129361号的优先权，上述专利申请的公开事项记载于本说明书中作为参照。心血管疾病(cadiovasculardisease)为由于血管硬化等的原因而使血管变狭窄或堵塞的疾病，大体可分为冠状动脉疾病(coronaryarterydisease，cad)和外周动脉疾病(peripheralarterydisease，pad)。其中，作为典型的外周动脉疾病的种类包括缺血性肢体疾病(ischemiclimbdisease)。迄今为止，在治疗心血管疾病的方面上大多数使用扩张血管的药物或利用外科手术。但在缺血性肢体疾病的情况下因被腐烂的痛苦过于严重而根据患者服用全身性抗止痛药，若发展至严重则存在导致切割腿部或死亡的情况，因此实情为需要从根本上治疗这些病情的方案。另一方面，作为用于基因治疗的基因载体的表达运载体记载于wo2000/040737中。并且，在wo2003/078568中记载了对于利用肝细胞生长因子基因的下肢缺血性疾病的治疗效果。在本说明书全文中，参照了多项论文及专利文献并表示了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容全部插入于本说明书中作为参照，由此更加明确地说明本发明所属领域的
技术领域：
：和本发明的内容。技术实现要素：技术问题本发明人努力开发对于可以预防或治疗外周动脉疾病的药物的研究。其结果，确认出：在并用肝细胞生长因子或上述肝细胞生长因子的异构体及基质细胞衍生因子1α，或者编码上述蛋白质的多核苷酸的情况下，比单独利用各个编码肝细胞生长因子、基质细胞衍生因子1α或上述基质细胞衍生因子1α的蛋白质的多核苷酸的情况，更加有效地治疗外周动脉疾病，由此完成了本发明。因此，本发明的目的在于，提供用于预防或治疗外周动脉疾病的药剂学组合物。本发明的其他目的在于，用于预防或治疗外周动脉疾病的方法。根据以下发明的详细说明、发明要求保护范围及附图更加明确地说明本发明的其他目的和优点。解决问题的方案根据本发明的一实施方式，本发明提供包含(a)肝细胞生长因子或上述肝细胞生长因子的异构体及基质细胞衍生因子1α或者(b)编码肝细胞生长因子的多核苷酸及编码基质细胞衍生因子1α的多核苷酸作为有效成分的用于预防或治疗外周动脉疾病的药剂学组合物。本发明人努力开发对于可以预防或治疗外周动脉疾病的药物的研究.其结果，确认出：在并用肝细胞生长因子或上述肝细胞生长因子的异构体及基质细胞衍生因子1α，或者编码上述蛋白质的多核苷酸的情况下，比单独利用各个编码肝细胞生长因子、基质细胞衍生因子1α或上述基质细胞衍生因子1α的蛋白质的多核苷酸的情况，更加有效地治疗外周动脉疾病。本发明的治疗战略大体可分为两个方式，即，蛋白质治疗和基因治疗。根据本发明的蛋白质治疗剂的战略，并用肝细胞生长因子或上述肝细胞生长因子的异构体、以及基质细胞衍生因子1α蛋白质。另一方面，根据本发明的基因治疗剂的战略，给药编码肝细胞生长因子的一个以上的核苷酸序列及编码基质细胞衍生因子1α的一个以上的核苷酸序列。编码肝细胞生长因子的一个以上的核苷酸序列及编码基质细胞衍生因子1α的一个以上的核苷酸序列可以用一个多核苷酸来提供，或者可以用额外的多核苷酸来提供。根据本发明的一实施例，本发明的编码肝细胞生长因子的一个以上的核苷酸序列及编码基质细胞衍生因子1α的一个以上的核苷酸序列可以用额外的多核苷酸来提供。以下，对本发明进行详细说明。本说明书中所使用的术语“肝细胞生长因子的异构体(isoform)”指包含所有的对立基因异构体(variants)的、具有从动物中自然产生(naturallyoccurring)的肝细胞生长因子的氨基酸序列和至少80％相同的氨基酸序列的肝细胞生长因子的多肽。例如，肝细胞生长因子的异构体均包括肝细胞生长因子的正常型(normalform)或野生型(wildtype)，以及肝细胞生长因子的多样异构体(例如，剪接异构体和缺损突异构体)。本说明书中所使用的术语“预防”指通过本发明的组合物的给药来抑制外周动脉疾病或延迟疾病进行的所有行为。本说明书中所使用的术语“治疗”指(a)用于抑制外周动脉疾病的发展的治疗、(b)用于减轻外周动脉疾病的治疗以及(c)用于去除外周动脉疾病的治疗。根据本发明的一实施例，本发明的肝细胞生长因子包含重组的人肝细胞生长因子的蛋白质。根据本发明的其他实施例，本发明的肝细胞生长因子包括序列表中序列1的氨基酸序列。根据本发明的一实施例，本发明的肝细胞生长因子的异构体包含全长肝细胞生长因子(fulllengthhgf，flhgf)和缺损的变异性肝细胞生长因子(deletedvarianthgf，dhgf)。本说明书中所使用的术语“全长肝细胞生长因子”指动物肝细胞生长因子的1-728氨基酸序列，根据一实施例的术语“全长肝细胞生长因子”指哺乳动物的肝细胞生长因子的1-728氨基酸序列，根据其他实施例的术语“全长肝细胞生长因子”指人肝细胞生长因子的1-728氨基酸序列。本说明书中所使用的术语“缺损的变异性肝细胞生长因子”指动物肝细胞生长因子基因，根据一实施例“缺损的变异性肝细胞生长因子”指通过哺乳动物的肝细胞生长因子基因的选择性剪接来生成的肝细胞生长因子的蛋白质的缺损的异构体。根据本发明的其他实施例，本发明的缺损的变异性肝细胞生长因子为由全长肝细胞生长因子序列中的α链的第一kringle域中被缺损5个氨基酸(f、l、p、s及s)之后的723个氨基酸形成的人肝细胞生长因子。根据本发明的一实施例，本发明的全长肝细胞生长因子包括序列表中序列2的氨基酸序列，本发明的缺损的变异性肝细胞生长因子包括序列表中序列3的氨基酸序列。根据本发明的一实施例，本发明的基质细胞衍生因子1α包括序列表中序列4氨基酸序列或序列表中序列8的氨基酸序列。如下实施例中所证明，确认出：在将本发明的肝细胞生长因子和基质细胞衍生因子1α的蛋白质并用处理在人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcell，huvec)的情况下，比单独处理各个蛋白质的情况，更加有效地促进血管内皮细胞迁移程度和血管生成程度，由此在以并用肝细胞生长因子和基质细胞衍生因子1α的蛋白质的方式给药的情况下，可以更加有效地利用于外周动脉疾病的预防或治疗上。根据本发明的一实施例，本发明的肝细胞生长因子的异构体是由额外的核苷酸序列来进行编码，或由单一的多核苷酸来进行编码。在本发明的药剂学组合物中，肝细胞生长因子的异构体在由额外的多核苷酸来进行编码的情况下，包含两个以上的多核苷酸，并肝细胞生长因子的异构体在根据单一的多核苷酸来进行编码的情况下包含包含上述单一多核苷酸的一个以上的多核苷酸。本发明的多核苷酸能够以操作可能的方式与用于调节肝细胞生长因子的异构体的表达的一个以上的调节序列(例如，启动子或增强子)相连接。肝细胞生长因子的异构体在由额外的多核苷酸来进行编码的情况下，可以由两个方式来构建表达盒。根据第一方式，通过在对各个异构体的编码序列(codingsequence，cds)上连接表达调节序列，来构建表达盒。根据第二方式，利用如“表达调节序列-第一异构体cds-ires-第二异构体cds-转录终止序列”等的方式，利用内部核糖体进入位点(internalribosomalentrysite，ires)或2a肽来构建表达盒。内部核糖体进入位点使基因的转变从内部核糖体进入位点的序列开始进行，使得两个以上的关心基因从相同的结构物中表达。肝细胞生长因子的异构体在由单一的多核苷酸来进行编码的情况下，均对上述异构体进行编码的多核苷酸以操作可能的方式与单一的表达调节序列相连接。在本发明中，肝细胞生长因子的异构体可以由两个以上的不同种类的异构体，例如同时表达全长肝细胞生长因子和缺损的变异性肝细胞生长因子的杂交(hybrid)的肝细胞生长因子基因来进行编码。根据本发明的一实施例，上述杂交的肝细胞生长因子基因包括属于人肝细胞生长因子基因的外显子1至4的序列、人肝细胞生长因子基因的内含子4或该片段序列及属于人肝细胞生长因子基因的外显子5至18的序列。包括上述内含子4的杂交的肝细胞生长因子基因具有7113bp的长度，包括序列表中序列7的核苷酸序列。上述杂交的肝细胞生长因子基因可以在肝细胞生长因子cdna的外显子4与5之间选择性地包括内含子4的片段。根据本发明的特定实施例，上述杂交的肝细胞生长因子基因包括序列表中序列5的核苷酸序列。对于本发明的“肝细胞生长因子的异构体”、杂交的肝细胞生长因子基因(例如，肝细胞生长因子-x7)已公开在wo2003/078568，上述专利文献的公开内容以整体来记载于本说明书中作为参照。在本发明中被解释成如下，即，能够利用的肝细胞生长因子的异构体的氨基酸序列或核苷酸序列还包括同野生型人肝细胞生长因子的异构体的序列表示实质同一性的氨基酸序列或核苷酸序列。上述实质同一性指包括如下内容的序列，即，以使野生型人肝细胞生长因子的异构体的氨基酸序列或核苷酸序列与任意的其他序列在最大程度上相对应的方式进行对准，并利用在本发明的所属领域上通常所使用的算法，来分析经过对准的序列时，最少示出80％的同源性、更优选为最少示出90％的同源性、最优选为最少示出95％的同源性的氨基酸序列或核苷酸序列。用于序列比较地对准方法已公知在本发明所属领域。对于对准的多种方法及算法已公开在smithandwaterman，adv.appl.math.2：482(1981)；needlemanandwunsch，j.mol.bio.48：443(1970)；pearsonandlipman，methodsinmol.biol.24：307-31(1988)；higginsandsharp，gene73：237-44(1988)；higginsandsharp，cabios5：151-3(1989)；corpetetal.，nuc.acidsres.16：10881-90(1988)；huangetal.，comp.appl.biosci.8：155-65(1992)及pearsonetal.，meth.mol.biol.24：307-31(1994)。ncbibasiclocalalignmentsearchtool(blast)(altschuletal.，j.mol.biol.215：403-10(1990))可以在nbci(nationalcenterforbiologicalinformation)等中连接，并在互联网中能够以与如blastp、blasm、blastx、tblastn及tblastx等的序列分析程序相连接的方式使用。blsat可以在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/中连接。利用这些程序的序列同源性比方法可以在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast_help.html中得到确认。根据本发明的一实施例，本发明的编码基质细胞衍生因子1α的多核苷酸包括序列表中序列6。根据本发明的一实施例，本发明的外周动脉疾病为缺血性肢体疾病。如在以下实施例中所确认，与在诱导下肢缺血的小鼠模型中的pck给药组、pck-基质细胞衍生因子1α给药组及pck-肝细胞生长因子给药组中出现腿部状态恶化的现象不同，本发明的组合物具有继续保持正常状态的效果。根据本发明的一实施例，本发明的多核苷酸为包含在裸露dna(nakeddna)或基因载体的核苷酸。本发明的组合物可以利用在基因治疗领域中通常被公知的多种方法来适用于生体内，上述基因载体包括例如运载体、质粒及病毒运载体，但不仅局限于此。(ⅰ)质粒(运载体)作为用于运输本发明的多核苷酸的载体，可以使用质粒(运载体)。优选地，包含在运载体的多核苷酸存在于适当的表达盒内。优选地，在上述表达盒中多核苷酸以操作的方式与启动子相连接。本说明书中所使用的术语“以操作的方式连接”指在与核酸表达调节序列(例：启动子、信号序列或转录调节因子的结合位置的陈列)不同的核酸序列之间的功能性结合，由此上述调节序列可以调节上述其他核酸序列的转录和/或解读。在本发明中，结合在多核苷酸序列的启动子可通过从一实施例中的动物细胞、其他实施例中的哺乳动物细胞、特定实施例中的人体细胞中的操作，来调节核苷酸序列的转录，包括源自哺乳动物病毒的启动子和源自哺乳动物细胞的基因组的启动子包含例如，巨细胞病毒(cytomegalovirus，cmv)启动子，腺病毒晚期启动子，牛痘病毒7.5k启动子、sv40启动子、hsv的tk启动子、rsv启动子、ef1α启动子、金属硫堇启动子、β-肌动蛋白启动子、人il-2基因的启动子、人ifn基因的启动子、人il-4基因的启动子、人淋巴毒素基因的启动子及人gm-csf基因的启动子，但不仅局限于此。根据本发明的一实施例，本发明中所使用的启动子为源自人巨细胞病毒(humancytomegalovirus，hcmv)的极早期(immediatelyearly，ie)基因的启动子或ef1α启动子，根据其他实施例，本发明中所使用的启动子为巨细胞病毒的极早期基因的启动子/增强子及从外显子1的整个序列开始包括至外显子2的atg起始密码子之前的部分的5'-非编码区(untranslatedregion，utr)。本发明中所使用的表达盒可以包括多聚腺苷酸序列，例如包括牛生长激素终止序列(gimmi，e.r.，etal.，nucleicacidsres.17：6983-6998(1989))、源自sv40的多聚腺苷酸序列(schek，n，etal.，mol.cellbiol.12：5386-5393(1992))、hiv-1polya(klasens，b.i.f.，etal.，nucleicacidsres.26：1870-1876(1998))、β-珠蛋白polya(gil，a.，etal，cell49：399-406(1987))、hsvtkpolya(cole，c.n.andt.p.stacy，mol.cell.biol.5：2104-2113(1985))或多瘤病毒polya(batt，d.bandg.g.carmichael，mol.cell.biol.15：4783-4790(1995))，但不仅局限于此。根据本发明的其他实施例，本发明的基因载体可以利用pck运载体、pcp运载体、pvax1运载体或pc运载体，根据本发明的特定实施例可以利用pck运载体。上述pck运载体详细记载于wo2000/040737中，上述专利文献的公开内容以整体来记载在本说明书中作为参照。(ⅱ)逆转录病毒逆转录病毒可通过使自身的基因插入于宿主基因组之中，来运输大量的外缘遗传物质，而且由于能够引起传染的细胞的光谱广，因此被广泛用于基因转移运载体。为了构建逆转录病毒运载体，而本发明的多核苷酸序列不是插入于逆转录病毒的序列，而是插入于逆转录病毒基因组中，来生产无法复制的病毒。为了生产病毒体，而包含gag基因、pol基因及env基因，但是构建没有长末端重复(longterminalrepeat，ltr)序列和ψ序列的包装细胞系(mannetal.，cell，33：153-159(1983))。若将包括本发明的多核苷酸序列、ltr及ψ序列的重组质粒移入于上述细胞系中，则ψ序列能够生产重组质粒的rna转录体，进而这些转录体被病毒包装，病毒被排出至培养基(nicolasandrubinstein“retroviralvectors，”in：vectors：asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses，rodriguezanddenhardt(eds.)，stoneham：butterworth，494-513(1988))。收集病浓缩包含重组逆转录病毒的培养基之后，用作基因转移系统来使用。利用第二代逆转录病毒运载体的基因转移已公布。kasahara等(science，266：1373-1376(1994))制备了莫洛尼(氏)鼠白血病病毒的异构体，其中通过将促红细胞生成素(erythropoietin，epo)序列插入于膜部位，来生产了具有新的结合特性的插入蛋白。本发明的多核苷酸序列也可根据如此的第二代逆转录病毒运载体的构建战略搭载在逆转录病毒。(ⅲ)腺病毒腺病毒由于具有中等程度的基因组大小、操作上的方便、高滴度、广泛的靶细胞及优秀的感染性的特征，因此被广泛用于基因转移运载体。基因组的两个末端包括100-200bp的末端反向重复(invertedterminalrepeat，itr)序列，这些是在dna复制及包装中必要的顺式元件。基因组的e1区域(e1a及e1b)对用于调节转录及宿主细胞基因的转录的蛋白质进行编码。e2区域(e2a及e2b)对参与病毒dna复制的蛋白质进行编码。在目前已开发的腺病毒运载体中大多使用e1区域被欠缺的无法复制的腺病毒。另一方面，e3区域从通常的腺病毒运载体中被去除，而提供插入有外源基因的位置(thimmappaya，b.etal.，cell，31：543-551(1982)；及riordan，j.r.etal.，science，245：1066-1073(1989))。因此，优选地，本发明的多核苷酸序列插入于缺损的e1区域(e1a区域及/或e1b区域)或e3区域。并且，上述核苷酸序列可以插入于缺损的e4区域。在本说明书中，与病毒基因组序列相关的术语“缺损”不仅包括该当序列完全缺损的情况，而且包括该当序列的一部分缺损的情况。并且，由于腺病毒可以包装野生型基因组的约105％，因此还可以包装约2kb(ghosh-choudhuryetal.，emboj.，6：1733-1739(1987))。因此，还可以使插入于腺病毒的上述外源序列结合在腺病毒的基因组。腺病毒具有42个不同的血清型及a-f的子基。其中，属于子基c的腺病毒型5用于获得本发明的腺病毒运载体的最优选的起始原料。对于腺病毒型5的生化和遗传信息都众所周知。由腺病毒来运输的外源基因以与附加体相同的方式被复制，由此对于宿主细胞的遗传毒性非常低。因此，被判断为利用腺病毒基因转移系统的基因治疗是安全的。(ⅳ)腺相关病毒运载体腺相关病毒(adeno-associatedvirus，aav)可以使非分裂细胞得到感染，而且具有感染到各种种类的细胞的功能，因此适合于本发明的基因转移系统。对于腺相关病毒运载体的制备及用途的详细说明详细地公开在美国专利第5139941号和美国专利第4797368号。对于作为基因转移系统的腺相关病毒研究公开在lafaceetal，viology，162：483486(1988)，zhouetal.，exp.hematol.(ny)，21：928-933(1993)，walshetal，j.clin.invest.，94：1440-1448(1994)及flotteetal.，genetherapy，2：29-37(1995)。最近，将腺相关病毒运载体用作囊性纤维化的治疗剂来实施了临床i实验。在通常的情况下，腺相关病毒病毒通过共传染包括位于两个腺相关病毒的末端重复序列的侧面的目的的基因列的质粒(mclaughlinetal.，j.virol.，62：1963-1973(1988)；以及samulskietal.，j.virol.，63：3822-3828(1989))和包括没有末端重复序列的野生型腺相关病毒编码序列的表达质粒(mccartyetal.，j.virol.，65：2936-2945(1991))，来制备。(ⅴ)其他病毒运载体其他病毒运载体也可以用作将本发明的多核苷酸序列向生体内运输的载体来使用。源自牛痘病毒(puhlmannm.etal.，humangenetherapy10：649-657(1999)；ridgeway，“mammalianexpressionvectors，”in：vectors：asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses.rodriguezanddenhardt，eds.stoneham：butterworth，467-492(1988)；baichwalandsugden，“vectorsforgenetransferderivedfromanimaldnaviruses：transientandstableexpressionoftransferredgenes，”in：kucherlapatir，ed.genetransfer.newyork：plenumpress，117-148(1986)及couparetal.，gene，68：1-10(1988))、慢病毒(wangg.etal.，j.clin.invest.104(11)：r55-62(1999))或单纯疱疹病毒(chamberr.，etal.，proc.natl.acad.sciusa92：1411-1415(1995))的运载体也可以用作可将上述多核苷酸向细胞内运输的运输系统来使用。(ⅵ)脂质体脂质体由分散在水中的磷脂来自动形成。作为将外源dna分子利用脂质体来成功地向细胞内运输的例子公开在nicolau和sene，biochim.biophys.acta，721：185-190(1982)及nicolauetal.，methodsenzymol.，149：157-176(1987)。包括本发明的多核苷酸序列的脂质体通过内吞作用、对于细胞表面的吸附或与等离子细胞膜之间的融合等的机制，来与细胞发挥相互作用，进而向细胞内运输多核苷酸序列。在本发明中，本发明的多核苷酸序列在搭载在裸露重组dna分子或质粒(运载体)的情况下，可通过显微注射法(capecchi，m.r.，cell，22：479(1980))；以及harland和weintraub，j.cellbiol.101：1094-1099(1985))、磷酸钙沉淀法(graham，f.l.etal.，virology，52：456(1973)；以及chen和okayama，mol.cell.biol.7：2745-2752(1987))、电穿孔法(neumann，e.etal.，emboj.，1：841(1982)；以及tur-kaspaetal.，mol.cellbiol.，6：716-718(1986))、脂质体介导转染法(wong，t.k.etal.，gene，10：87(1980)；nicolau及sene，biochim.biophys.acta，721：185-190(1982)；以及nicolauetal.，methodsenzymol.，149：157-176(1987))、deae-右旋糖酐治疗法(gopal，mol.cellbiol.，5：1188-1190(1985))及基因轰击法(yangetal.，proc.natl.acad.sci.，87：9568-9572(1990))，来将多核苷酸序列向细胞内移入。在基于病毒运载体来制备本发明的多核苷酸序列的情况下，可根据在本发明所属领域中被公知的各种病毒感染方法，来将多核苷酸序列向细胞内运输。对于利用病毒运载体的宿主细胞的感染内容记载于上述的引用文献。根据本发明的其他实施例，本发明的基因载体为运载体。根据本发明的某些具体例，本发明的运载体为质粒，根据本发明的特定实施例，本发明的质粒为pck。包含利用pck来表达肝细胞生长因子的两个以上的异构体的单一多核苷酸的多个重组运载体详细地记载于wo2000/040737和wo2003/078568中。本发明的组合物可以包含药剂学上可接受的载体。包含在本发明的组合物的药剂学上可接受的载体为制剂制备时通常所使用的载体，具体地包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但不仅局限于此。本发明的药剂学组合物除了上述成分之外还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂及防腐剂等。适合的药剂学上可接受的载体及制剂详细地记载在remington'spharmaceuticalsciences(19thed.，1995)。根据本发明的一实施例，本发明的药剂学组合物是通过利用非经口的方式来给药的。例如可以通过静脉内给药、腹膜内给药、皮下给药、皮内给药、脊柱内给药、鞘内给药、脑室内给药、脑实质给药、颅内给药、肌内给药或局部给药来进行给药。根据本发明的其他实施例本发明的药剂学组合物可以给要到肌内、脊柱内、鞘内、脑室内、脑实质内及颅内。本发明的药剂学组合物可以配制成注射的形式给药。对于本发明的药剂学组合物的适当的给药量是可根据配制方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、疾病症状的程度、给药时间、给药途径、排泄率及反应灵敏度等的因素具有多样形式，通常，熟练的医生可容易地确定并处方在所需的治疗上需要的有效的给药量。根据本发明的一实施例，本发明的肝细胞生长因子、肝细胞生长因子的异构体及基质细胞衍生因子1α的各自以10ng至100mg的给药量来给药，编码上述蛋白质的多核苷酸各自以1μg至100mg的给药量来给药。当上述肝细胞生长因子、肝细胞生长因子的异构体、基质细胞衍生因子1α或编码基质细胞衍生因子1α的多核苷酸的给药次数超过一次并反复进行时，每次使用的给药量可以相同或不同。本发明的药剂学组合物可根据本发明所属领域的普通技术人员可容易实施的方法，利用药剂学上可接受的载体及/或赋形剂来制备成，因此能够以单位剂量形式来制备或以放入多剂量容器的方式制备。此时，剂型可以为油或水介质中的溶液形态、悬浮液形态或乳液形态，或者浓缩剂形态、粉末剂形态、颗粒剂形态、片剂形态或胶囊剂形态，而且还可以包含分散剂或稳定剂。根据本发明的其他实施方式，本发明提供包括将包含(a)肝细胞生长因子或上述肝细胞生长因子的异构体及基质细胞衍生因子1α或者(b)编码肝细胞生长因子的多核苷酸及编码基质细胞衍生因子1α的多核苷酸作为有效成分的组合物给药到需要上述组合物的个体的步骤的用于预防或治疗外周动脉疾病的方法。本说明书中所使用的术语，“给药”或“给药到”指通过将本发明的组合物的治疗有效量直接给药到需要上述组合物的个体(即，对象)，来在对象的体内中形成相同的量的过程。因此，术语“给药“包括将本发明组合物注射到病变部位的过程，因此术语“给药到”以与“注射”相同的意义来使用。组合物的“治疗有效量”指在向需要组合物的给药的个体提供治疗效果或预防效果的方面上，足够发挥其效果的组合物的含量，对此包括“预防有效量”的含义。本说明书中所使用的术语“个体”不受局限性，包括人类、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、猴、黑猩猩、狒狒或恒河猴。具体地，本发明的个体为人类。本发明的用于预防或治疗外周动脉疾病的方法为包括给药本发明的一实施方式的用于预防或治疗外周动脉疾病的药学剂组合物的步骤，因此为了避免本说明书中的记载上的过多的复杂性，而省略说明重复的内容。发明的效果概括本发明的特征及优点如下。(a)本发明提供用于预防或治疗外周动脉疾病药学组合物。(b)在利用本发明的组合物的情况下，比单独利用通过血管内皮细胞迁移剂血管生成的显著促进，来编码肝细胞生长因子、肝细胞生长因子的异构体、基质细胞衍生因子1α或基质细胞衍生因子1α的蛋白质的多核苷酸的情况，可更加有效地预防或治疗外周动脉疾病(例如，缺血性肢体疾病)。附图说明图1为示出肝细胞生长因子和基质细胞衍生因子1α的并用对人脐静脉内皮细胞的细胞迁移产生的影响的图。图2a及图2b为示出肝细胞生长因子和基质细胞衍生因子1α的并用对血管生成产生的影响的图。图3为示出随着时间的经过，pck-肝细胞生长因子和pck-基质细胞衍生因子1α的并用对下肢缺血小鼠模型的腿部状态产生的影响的图。具体实施方式以下，利用实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例仅用于更加详细地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围并不局限于这些实施例，这对于本发明的所属领域的普通技术人员来说是显而易见的。实施例实施例1.肝细胞生长因子和基质细胞衍生因子1α的组合对人脐静脉内皮细胞的细胞迁移产生的影响的功效确认实验方法从lonza购买了以从人脐带中仅采取静脉的内皮细胞之后，进行单一细胞化之后培养的方式获得的人脐静脉内皮细胞。为了确认从人脐静脉内皮细胞的细胞迁移中的肝细胞生长因子(序列表中序列1，r&dsystemscatno.294-hg-025/cf，美国)和基质细胞衍生因子1α(序列表中序列4，r&dsystemscatno.350-ns-010/cf，美国)的影响，而用1％的明胶涂敷transwell(corning，cat#3422)之后，在每个transwell中接种2×104个细胞。能够使细胞附着，培养一个小时之后，安排了如下的各个实验群(50ng/ml的肝细胞生长因子、50ng/ml的基质细胞衍生因子1α、25ng/ml的肝细胞生长因子+25ng/ml的基质细胞衍生因子1α)。在各个实验群处理了该当蛋白质，为了测定细胞迁移的程度，而利用结晶紫来染色细胞之后，利用显微镜测定移动了transwell的细胞的数量。其结果，在单独处理50ng/ml的肝细胞生长因子的情况下，细胞迁移比对照组增加了1.8倍，在单独处理50ng/ml的基质细胞衍生因子1α的情况下，细胞迁移比对照组增加了1.5倍。在一并处理各个25ng/ml的肝细胞生长因子和基质细胞衍生因子1α的情况下，确认出：细胞迁移比对照组增加了2.5倍，而且细胞迁移的效果比各自单独处理的情况更佳(图1)。实施例2.在基质胶塞实验(matrigelplugassay)中肝细胞生长因子和基质细胞衍生因子1α的组合对血管生成产生的影响的功能确认利用基质胶塞实验确认了肝细胞生长因子和基质细胞衍生因子1α对血管生成产生的影响。将5周龄的c57bl/6小鼠分成如下的实验组(pbs、300ng的肝细胞生长因子、150ng的肝细胞生长因子+150ng的基质细胞衍生因子1α)。在400μl的基底膜基质(corning，cat#356231)中放入肝素1单位之后，添加了属于各个实验组的蛋白质。将利用这种方法制备的基底膜混合物皮下注射到小鼠腹部。7天后，牺牲小鼠之后分离了被植入的基底膜基质，并为了定量化血管生成程度，而利用drabkin’sassay测定了包含在各个基底膜的血红蛋白(hemoglobin)数据。其结果，确认出：在放入300ng的肝细胞生长因子的实验组的情况下，血红蛋白数据比放入pbs的是实验组增加了约1.8倍，在各放入150ng的肝细胞生长因子和基质细胞衍生因子1α的情况下，血红蛋白数据比pbs组增加了约2.3倍，血管生成程度比单独给药肝细胞生长因子时得到了提高(图2a及图2b)。实施例3.将肝细胞生长因子和基质细胞衍生因子1α给药到下肢缺血(hindlimbischemia，hli)小鼠模型时的功能确认实施例3-1：质粒dna的制备pck-肝细胞生长因子质粒的制备在进行下肢缺血小鼠模型的实验之前，通过如下的方法来制备了所需的质粒dna。pck运载体为以使需要表达的对象处于人巨细胞病毒(hcmv)的增强子/启动子的调节下的方式被构建的运载体，并详细记载于leeetal.，biochem.biophys.res.commun.272：230(2000)；wo2000/040737。本发明中利用的pck-肝细胞生长因子质粒是根据记载于wo2003/078568的方法来制备的，即，利用pck运载体来插入在人肝细胞生长因子基因的外显子4及5之间插入有人肝细胞生长因子基因的内含子4的片段序列的杂交基因(即，肝细胞生长因子-x7基因、序列表中序列5)的方法来完成。pck-基质细胞衍生因子1α质粒的制备将人基质细胞衍生因子1α的基因信息(ncbireferencesequence：nm_199168.3)为基础，通过在两端追加nhei和noti的限制酵素序列来合成了基因合成。利用nhei和noti在pck运载体插入经过合成的人基质细胞衍生因子1α片段。插入在pck运载体的人基质细胞衍生因子1α基因的序列与序列表中序列6相同。实施例3-2：下肢缺血小鼠模型制造及质粒dna的给药下肢缺血小鼠模型为模仿人体的严重下肢缺血(criticallimbischemia；cli)的最典型的小鼠模型(1，2)。上述小鼠模型的制造方法为如下。利用zoletil和rumpun混合液麻醉了balb/c小鼠7周龄雄性之后，切开了约1cm的大腿侧的皮肤。之后，找出位于大腿内侧的股动脉(femoralartery)的位置之后，利用6-0厚度的线扎好约1cm左右长度的动脉，并切断在此之间的组织之后去除了血管。通过这些方法，来去除向大腿下侧垂下的血管，从而可诱导缺血条件。一边诱导下肢缺血，一边将需要评价的质粒dna给药到去除血管的附近的肌肉中。此后，缝好被切开的部位之后，观察了小鼠是否从麻醉中良好地恢复。对于下肢缺血小鼠模型，每组由6只小鼠组成，并分别给药如下的质粒：200μg的pck、200μg的pck-hgf、200μg的pck-基质细胞衍生因子1α、200μg的pck-hgf+200μg的pck-基质细胞衍生因子1α。给药之后，分别在第三天、第七天、第十天、第十七天、第二十二天及第二十七天，观察腿部的状态，并通过一定的基准来计分之后体实施数值化。此时使用的基准为如下：[3]：0＝正常状态、1＝爪子坏死、2＝脚趾坏死、3＝脚部组织坏死。其结果，诱导下肢缺血之后，在pck给药组的情况下，腿部的平均状态逐渐变差，两周后的分数上升到1.83左右。在pck-肝细胞生长因子的给药组的情况下也是随着时间的经过，分数上升到0.66-0.83左右。相反，在并用pck-肝细胞生长因子及pck-基质细胞衍生因子1α的给药组的情况下，诱导下肢缺血之后，分数保持了0的状态(图3)。结果，通过上述实施例1～实施例3可确认出如下：在并用肝细胞生长因子和基质细胞衍生因子1α的给药、并用编码各个肝细胞生长因子和基质细胞衍生因子1α的多核苷酸的给药的情况下，比单独给药各个蛋白质或多核苷酸的情况，更加具有促进血管内皮细胞的迁移及血管生成的效果，并且对于缺血性肢体疾病的治疗效果显著。参考文献1.limbourg，a.，etal.，evaluationofpostnatalarteriogenesisandangiogenesisinamousemodelofhind-limbischemia.natprotoc.4(12)：p.1737-46，2009.2.couffinhal，t.，etal.，mousemodelofangiogenesis.amjpathol.152(6)：p.1667-79，1998.3.clayton，j.a.，d.chalothorn，andj.e.faber，vascularendothelialgrowthfactor-aspecifiesformationofnativecollateralsandregulatescollateralgrowthinischemia.circres.103(9)：p.1027-36，2008.以上，对本发明的特定部分进行了说明，但这些具体的技术方案只是优选的实施例，本发明的范围并不局限于此，这对于本发明所属领域的普通技术人员来说是显而易见的。本发明的实际范围应该取决于附加的发明要求保护范围及其等价物。序列表<110>viromedco.,ltd.<120>利用肝细胞生长因子和基质细胞衍生因子1α的用于预防或治疗外周动脉疾病的组合物<130>pp150098<150>kr10-2014-0129361<151>2014-09-26<160>8<170>kopatentin2.0<210>1<211>697<212>prt<213>重组人hgf蛋白的氨基酸序列<400>1glnarglysargargasnthrilehisgluphelyslysseralalys151015thrthrleuilelysileaspproalaleulysilelysthrlyslys202530valasnthralaaspglncysalaasnargcysthrargasnlysgly354045leuprophethrcyslysalaphevalpheasplysalaarglysgln505560cysleutrpphepropheasnsermetserserglyvallyslysglu65707580pheglyhisglupheaspleutyrgluasnlysasptyrileargasn859095cysileileglylysglyargsertyrlysglythrvalserilethr100105110lysserglyilelyscysglnprotrpsersermetileprohisglu115120125hisserpheleuprosersertyrargglylysaspleuglngluasn130135140tyrcysargasnproargglyglugluglyglyprotrpcysphethr145150155160serasnprogluvalargtyrgluvalcysaspileproglncysse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