专利名称：：糖模拟肽及其在药物制剂中的用途的制作方法糖模拟肽及其在药物制剂中的用途发明领域本发明涉及医药领域，特别地涉及用于预防性或治疗性应用的新型疫苗制剂的开发，所述新型疫苗制剂允许诱导或增强针对特定抗原的免疫应答以4氐抗不同来源的疾病。
背景技术：
：具有通过(a2-8)键连接的、N-取代的神经氨酸重复单元的化学结构的糖类例如作为脑膜炎奈瑟氏球菌(#e/Mer/a迈e/7/z^/7/V/s)B血清群的多糖荚膜的组分而存在。特别地，这种细菌的荚膜由通过(a2-8)键连接的N-乙酰基神经氨酸的重复单元组成(BhattacharjeeA.K.等人，1975.5Yrw"wra/cf"er/z7//23〃ooo尸f力e"'a7/cac/d^s力dCfr/f力C3r6cw/"c7ear/zw《"eZ/c了e5^/7s刀ce.J.Biol.Chem.250:1926-1932)。脑膜炎奈瑟氏球菌是革兰氏阴性细菌，其唯一的宿主是人，并且组成了脑膜炎球菌病(meningococcaldisease)的致病因子。通常，在寄居于称为携带者的健康个体的上呼吸道中的天然暂居^:生物群体之中发现这种细菌。这是分离林的最常见来源。2岁以下的儿童最容易感染脑膜炎球菌性脑膜炎，该疾病是脑膜炎球菌病的最常见的临床并发症。然而，青少年和成年人也可受到影响。未治疗的脑膜炎球菌病在大多数患病个体中是致命的，疫苗接种可以预防这种情形，甚至预防早期阶段例如细菌移居。脑膜炎奈瑟氏球菌临床分离林通常是有荚膜的。分离林的荚膜的结构差异引起抗原性的差异，并且为将这种细菌分类为几个血清群的基础(RosensteinN.E.和PerkinsB.A.2000.o/Pediatr.Clin.North.Am.，47:337-352)。从临床观点来看，A、B、C、Y和W-135血清群在目前报导的13种脑膜炎奈瑟氏球菌血清群中是最重要的。A血清群是撒哈拉南部非洲中该病流行的主要原因。B和C血清群与发达国家中发生的大多数病例相关。Y和W-135血清群是造成在美国一些地区中报导的该疾病和感染的其余病例中大多数的原因，过去几年出现显著增加(RosensteinN.等人，2001.#e/7//^cocca/crease.N.Engl.J.Med，344，1378-1388)。B血清群是造成50-70%的在婴儿和儿童中报导的细菌性脑膜炎病例的原因，其可在^皮感染的青少年中造成致命的脓毒症(RomeroJ.D和0utschoornI.M.1997.7"/e/鹏u/zerespoose&Mecapsw/ai*/70//sacc力ar2'cfeyv^/sser/a/pe///^/,/^//^gro";7及Zentralbl.Bakteriol.285:331-340)。设法抵抗由脑膜炎球菌B血清群引起的疾病的策略之一是将在指数生长期期间从细菌外膜释放的外突物用作免疫yf、。这些夕卜突物称为夕卜膜囊夕包(outermembranevesicle)(OMV)。为了在疫苗中使用，纯化所述嚢泡，其中通过去污剂处理来除去脂多糖类(LPS)。这些嚢泡中的抗原主要是细菌外膜蛋白(FraschC.E.等人，1988.J/7〃60cO^res/7o/7seo尸adu/"&a/2a/咖2'/7咖/7i*c^e/"-^T("/7"/707/i^cc力sr/deF"c/"e.J.Infect.Dis.158:710-718)。已在临床试验中分析了几种基于0MV的疫苗(RosenqvistE.等人，1991.^y^2/7s/7/76od/Tespaosesa/7er7ac￡//7af/oow/f力f力eAorfreg/a"group"/z7e/ji刀gococca7oufe,J27e/n6rai3eres/cieF縱/ze..r證7"/濯iX，W油'ei.NIPHAnn.14:169-79;SierraG.V.等人，1991.「scci/eaga/./2Stgrow;5iYe/^er/sC"6a.NIPHAnn.14:195-207)。基于血清学分类B:4:PI.19，15的菌林(来自古巴的病例的最常见分离林)的古巴疫苗，商业上称为VA-MENGOC-BC，在实地临床试验(fieldclinicaltrial)中显示出83%的功效。作为在古巴大规模应用该疫苗的结果，脑膜炎球菌病的发病率从1983年的每100OOO个居民中14.4个被感染减少至1994年的每100000个居民中0.45个病例(SierraG.V.等人，1991.&cc//7e鹏5^7acc//7"/0/7resw/"NIPHAnn.14:195-207;DiazR.J.和OutschoornI.M.1994.Curre/2fo尸/z7e/z//zgococca/^tow/^yacc/zzeca/d/c^fes..ca/su/aror"o/zcs/^w/arClin.Microbiol.Rev.7:559-575)。这种疫苗从1989年至1990年在SaoPaulo(巴西)的应用控制了在该地区中的流行性暴发(deMoraesJ.C.等人，1992.尸r0fec〃7ee/77cac/o尸asero^roi/pA/z7e/3//7gc>cocca/7acc//2e/刀夕ao尸3w/0,"raz//.Lancet340:1074—1078)。然而，这些疫苗只从一个菌株产生，从而使保护作用是血清型或亚型特异性的，主要限于源菌林。另一方面，脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群菌林的循环在时间和地理上发生变化。因此，该类型的疫苗的应用局限于隔离的地理区域(其中菌林的循环受到限制)或者局限于具有流行性暴发的地区(在该地区中，造成暴发的菌抹是经充分表征的，并且产生了终止这些流行病的特异性疫苗)(HoistJ.等人，2005.r力ec0/2cej^aga//2"/z7e"//zgococca/crease.Vaccine23:2202-2205)。来自几种菌抹的OMV的不同制剂的简单组合不是有效的选择，因为其可以获得高水平的LPS含量/剂疫苗，从而具有引起副作用的危险(DiazR.J.和OutschoornI.M.1994.fi/rre/2ffi/so尸/z7e/7/z7goc(cca/grow/^7acc2'/2eca"tZ/if"e5vca/7sw/aror/70/7ca/^w/盯？Clin.Microbiol.Rev.7:559-575)。基于从脑膜炎奈瑟氏球菌的细胞中纯化的荚膜多糖的疫苗已能够提供针对由A、C、Y和W135血清群引起的脑膜炎球菌病的保护。这些疫苗能够在成人中诱导杀菌性和保护性抗体，以及有效控制流行性暴发(RosensteinN.等人，2001.j1/e/7/7i/7^ccocca_/d/sease.N.Engl.J.Med，344:1378-1388)。基于从C血清群细菌中纯化的、缀合至载体蛋白的多糖的新一代疫苗可在市场上商购获得。在英国进行的实地临床试验中，这些疫苗不仅在成人中而且在儿童中显示了它们诱导杀菌性和保护性抗体的能力(MillerE.等人，2002.尸/s/2"//^，<2^2//75^/ze/72'/《ococca/serc^Tow/7Cdisease/刀f力essi/cce5^Vaccine20;s58-s67)。此外，所述经缀合的疫苗允许克服与使用单纯的多糖作为免疫原相关的主要困难，例如诱导了非胸腺依赖性和短期的免疫应答、不存在具有亲和力成熟的记忆免疫应答的刺激。此外，已在例如该疾病的高发病率地区，在反复用这些疫苗进行接种的个体中，描述了在C血清群的情况下被充分证明的低应答性现象(hyporesponsivenessphenomenon)的诱导(JenningsH.和LugowskiC.1981.//M7w/oc力eyz7/sfr/^row;^^，^a/7"CImmunol127:1011-1018;GoldR.和LepowM.L.1975."/刀/ca/e卩a/wat/o"o_fgroupXa/idC迈6/2//2^0(70^^3/po/ysaccAar/deyacc/ze51//2//2/"a/7f51.J.ClinInvest56:1536-47;BorrowR.等人，2001./"/7we"ce0//rioriZ7e/7//7《0cocca7Cp0/7sacc力ar/'deyacc//7af/c>/2f力eres/(/7sea力d/ge/7erat/o/迈e迈orja/YerInfectDis184:377-380)。几种针对A血清群的缀合物疫苗正在经历临床研究，其已证明是安全的、具有免疫原性的和能够诱导免疫记忆应答(WorldHealthOrganisation.1999.iYaWartZ/za〃o/za/zd7a7i^3〃a/7ofserc7o《yca7/orf力eeKa7wa〃0/7o/i迈迈MeVaccineDevelopmentTeamoftheDepartmentofVaccineandBiologicals.Ginebra，www.who.int/gpv-documents/;CampagneG.等人，2000.5^尸ef/a/7d//ZMw/7C^e/72.d7/o尸f力reedc^eso/*a//7尸a/2"/V咖Pediatr.Infect.Dis.J.19:144—150;BorrowR.等人，2000./72i/i/cf/onC//ZMw/7o/c^7ca7/ffe忠or///7//7尸3/2f夕67a/e/7//7《ococca_/J/Cco/7乂w^2feEpidemiol.Infect.124:427—432;ChooS.等人，2000.//ZM7w/70ge/7/ci.^rcomparedw/f力s^row/爿+C/ne/22'/2gococca7poZ/s^ccAary^/e7acc//7eVaccine18:2686-2692)。B血清群荚膜多糖的弱免疫原性已排除了基于该化合物的疫苗制剂(ColinoJ.和OutschoornI.1998./j72a/z72'cso/*^e力wz7。ra///ZM7w/7eresponsefoiVe/wer/a迈6/7//^/〃^/<gr卯/5capsw/ar/70//sacc/ar2Ve.Infect.I鹏un.66:505-513)。脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群荚膜多糖由唾液酸组成，特别是由具有大约200个通过a(2-8)键连接的N-乙酰基神经氨酸的重复单元的线性同聚物组成(BhattacharjeeA.K.等人，1975.57ri/"w"7^^erm/zzs〃ozo尸f力es/a7/csc/'d/70//sacc力sry^eai2f/gei351o/iVe/515^//3re濯露e.J.Biol.Chem.250:1926-1932;FroschM.和EdwardsU.1993.#o/ecw/ar迈ec力a/2.57Z7o尸ca/sw/eej7re51570/72'T2^/^^￡/^/ge/H'/^'tWsserc^rowp及p49-57inJ.Roth，U.Rutishauser和F.A.Troy(ed)，Polysialicacid,frommicrobestoman.BirkhauserVerlag，Basel,Switzerland)。这些长的糖链在细菌表面上采取螺旋形式的空间排布，其中采取了特征性的三维结构，在该三维結构的形成中细菌外膜的蛋白质和其他组分也作出了贡献(ColinoJ.和OutschoornI.1998.//z7a迈/cso尸f力e/Hf/r/i2e力u/wora/一/躯由r油.InfectImmun66:505-513)。这种同聚物不限于m.面"勿'8661'Iujooqos,—tou"o;):S8Z10口9i與'G7ojquio)i)》善:ppT耍，W啤梦^^争'+l^拟到'蕃^W、銘,f效^森枯梦畔#'+TT(^漆显梦承，梦。^FSW蟹^W绍蹄承一^U^、dT梦廿^绍瑕^W^^争^+Y，'W(g。《^^Y晷f4^女^善每^逸*争哥'+郫^n^^4f4邻效^梦廿w啤^魂^争w善每輩单if°(89K-t^￡Z:t7"soj呵.j;两"s1，〃33zj/歸，j^/T》861'y余.W.33画q:))^古T罩々OS-(H'群^菊銖WTW鸣Y'W醉銖f謝^扭柴平8奥,^蓉专^教鄉^^'W赁錄一+W(WVM)去々鲁绅^啤努枯^啤钟伶^》丄Y脉彿遂fel^^古T罩W^货努枯节^^-N^辨审教(8-Z)FlF。赁衫凍^争JL^"T^T頃》^绍瑕承一^"纷Y梦U99丛〗9qiU"u9pi'1661'Y会T.S!a9qUsoi-6A01:乙H9861'Y会瓜BIPV〗89Z—Z92:011'ioummui'f.s7/7.,〃聊u譜"61'Y僉']'d"dSB3)+(钟^褂莉^孩非^I喜+絮首)("5/^g7^^〃-0Y7ff87,575v。D虔^摔葉^婆止；梦妒^r"'+(，^^*蜀貴^音罩)("〃//0ffl^5^g〃9J77^5^J)嵐^對搶2亨繁^梦甘'+都^^(^^^^^教^^1S+V^4f梦)12W:"3^W)隳^^Y^梦廿？货^(a'妞^平8廣，f^蓉普lf敦敏虽0S/9憲法能改o/*f力e/Z7wr2'/7e力w/z7ora//'/zM7W3ere5770/7sefoiVe/Mer/a膨/7//^/〃<^TOi/p5capsw/ar/707/sacc力ar/ffe.InfectImmun66:505-513)。体外实验表明，针对脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群的荚膜的抗体与人组织的聚唾液酸反应(FinneJ.等人，1987.J//g《迈o/oc7o/7Wa/7f/60c^Fto^T0i/;i/z/e/72./2gococc/cross—reacitsv/f力^7/co/7rofe//^///zewra/eA^ra/e:/ra/〃《si/e<y.J.Immunol,138:4402-4407)。这种交叉反应性可解释脑膜炎球菌B血清群荚膜多糖的低免疫原性，其通过可能形成了免疫耐受而引起(由于其与存在于宿主组织中的多糖的同源性)。已警示了这样的可能性，即在体外已显示出识别人组织的抗脑膜炎球菌多糖B抗体可能将导致形成自身免疫性疾病。然而，迄今仍不可能在体内证明抗多糖B抗体与人组织的有效结合，也不可能将任何病理学状况与在人血清中循环的高水平的抗脑膜炎球菌多糖B抗体的存在联系在一起。几个研究报导了，通常，在享有良好健康的个体(包括已有健康孩子的母亲)的血清中，循环着识别脑膜炎球菌多糖B的抗体。除此以外，在南非进行的研究中，在用蛋白质-脑膜炎球菌多糖B缀合物疫苗免疫接种500多位成年人和2000位儿童后，没有报导副作用(Mandrel1R.E.和Zol1ingerW.D.1982.,easwre迈e/Uo/a/7〃6oc^'e51to/力gococca7^rou/5c譜"/".J.Im隱o1129:2172-2178;ZollingerW.D.等人，1984.Sa尸e^Ko/*73cc/z2esco"fa//2'/7g历e/22'/7gococca/grow/5po7j^acc力aT/cfe.Lancet2:166'，DeviS.J.等人，爿72f/6c^2'es/o7/----《j一37/;力a-yV一3ceO^刀ewra迈yi3/ca刀dpo/y/Y2----_^—3//7力3—#一<2060^/76〃7*3/7//7/匚sc/c//aree//c/7e(/6/i/n迈w//zaf/0/20/迈/ce五scAer2'c力/aco/if夕2co/7_/t;ga/70te/2t/a/7acc2'/7es尸orgro"/^^a/2dC/z7e/2/;2gococcya"cfi".co7//丄Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7175—7179;KabatE.A.等人，1988.r力ee/7/fo/eassoc/afpt/^力f力e6//zi///2g0/t力eJ.Exp.Med.168:699—711;GranoffD.M.等人，1995.J/7".60c^respo/3sestot力ecapsu/arpo//sacc/ar!.￡/eo/"A^'sser/aClin.Diagn.Lab.Immunol.2:574-582;RomeroJ.D.和OutschoornI.M.1997.7力e/迈历"/7eres/o/7sefof力eca/sw/ar;7o7/sacc力ar/(/e。/TYe/weWa《ro"/7及Zentralbl.Bakteriol.285:331-340;SteinD.M.等人，2005.irea/7/76o^.ei1foZ力ei5^c力er/c力/aco//s5^0c/'afedy/f力/yzMw/70/7afAo/c^/..Vaccine.即将出版的论文(Articleinpress))。继续研究脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群荚膜多糖在疫苗制剂中用作免疫应答的靶标的用途主要有两个原因。首先，该多糖是B血清群中最保守的结构，因此基于多糖的疫苗可在高数目的病例中提供针对感染的保护，其数目比可由基于细菌外膜蛋白(其诱导具有有限的与其他菌株的交叉反应的抗体)的疫苗所覆盖的病例的数目多得多。第二，如之前所讨论的，在具有于血清中循环的抗脑膜炎球菌多糖B抗体的个体中不存在免疫病理学副作用。已使用了几种策略，目的是增加多糖B的免疫原性(BartoloniA.等人，1995.//M7u/3oge/3/ci77iZe/72'/zgococca7po/ysaccAar/deco/2yw^2tedfefs/7i/sfo义02.f/orC/#_/^7.y/aad/p/cac/dd/一，流Vaccine,13:463-470;DeviS.J.等人，1997.7acc/z7e512'/2yi/7e/22'7er力es:/s迈anire/s1.Infect.Immun.65:1045-1052)。例如，使用经修饰的B血清群荚膜多糖(其中用N-丙酰基替代N-乙酰基)的糖缀合物进行免疫接种诱导了两种抗体群体的产生一种占小部分的抗体群体，其可用从细菌中纯化的多糖B的溶200680053451.5液吸附，并且不具有杀菌性和保护性活性；一种占大部分的抗体群体，其不能用纯化的脑膜炎球菌多糖B吸附，属于IgG同种型，显示出针对几种来自脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群的菌株的杀菌活性，能够减轻或甚至消除用致死剂量的脑膜炎球菌攻击的小鼠中的菌血症，并且不识别人组织(JenningsH.J.等人，1987.N-propionylatedgroupBmeningococcalpolysaccharidemimicsauniqueepitopeongroupBNeisseriameningitidis.JExpMed165:1207-1211;JenningsH.J等人，1986。InductionofmeningococcalgroupBpolysaccharide-specificIgGantibodiesinmicebyusinganN-propionylatedBpolysaccharide-tetanustoxoidconjugatevaccine.JImmunol137:1708-1713;AshtonF.E.等人，1989.ProtectiveefficacyofmouseserumtotheN-propuonyldetivativeofmeningococcalgroupBpolysaccharide.MicrobPathog6:455-458;MichonF.等人,1987.Conformationaldifferencesbetweenlinearalpha(2----8)-linkedhomosialooligosaccharidesandtheepitopeofthegroupBmeningpcoccalpolysaccharide.Biochemistry26:8399-8405;PonR.A.等人，1997.N-PropionylatedgroupBmeningococcalpolysaccharidemimicsauniquebactericidalcapsularepitopein-groupBNeisseriameningitidis.J.Exp.Med.185:1929-1938)。这些结果表明，在来自脑膜炎奈瑟氏球菌的多糖B中存在两种主要表位当该多糖以短链的形式(如在人细胞的表面上显现的)或以随机构象(在纯化的多糖的溶液中常常发现的)存在时可被检测的第一种表位(DiazR.J.和OutschoornI.M.1994.CurrentstatusofmeningococcalgroupBvaccinecandidates:capsularornoncapsularCline.Microbiol.Rev.7:559-575).该表位产生不杀菌的自身抗体。第二种表位只有在该天然多糖保持其高分子量且在空间上以螺旋形式排列(如在细菌的表面上)时才可检测到。构象本质的该第二种表位负责产生不识别人组织的杀菌性和保护性抗体。已报导了单克隆抗体的分离，所述单克隆抗体根据它们的特异性和性质被分类为正好相应于先前描述的两类抗体的两个群体(PonR.A.等人，1997.^-尸ro//o/7j^"edgrow/7"me"//^ococca///2-^To";7_g^Ye/^er/aWs.J.Exp.Med.185:1929-1938;GranoffD.M.等人，1998.万acter/c/da//zo/2oc/o"a/a刀f/6od/esdoci"c^s—reacf力wz/a刀poJ/siaJicJImmunol160:5028-5036)。在从细菌中纯化的多糖B的溶液中主要发现无构象的、与人N-CAM共有的表位，这解释了多糖B的低免疫原性和在免疫后在其所诱导的抗体中检测到的极少的杀菌活性。通过用N-丙酰基替代N-乙酰基而在该多糖中引入的构象变化诱导了非自体反应性、杀菌性和保护性抗体的主要群体的产生。然而，N-丙酰基化的多糖B也诱导了部分的自身抗体(尽管以低的比例)，这在其用作疫苗时引起人们的注意，甚至当最近的研究显示其在人中用作免疫原具有安全性时(BrugeJ.等人，2004.^7//2.ca/eya/i/a〃o/7ofa^to"/^/ze/7/;^ococca/鹏/e70/i//^eerAVaccine.22:1087-1096)。为了设计针对脑膜炎球菌B血清群的疫苗，将荚膜多糖用作免疫应答的靶标的另一种备选方案是将肽序列用作免疫原，所述肽序列组成了对于负责保护作用、当糖以其天然构象存在于细菌表面上时存在于多糖B中的构象表位而言特异的分子模拟物(模拟表位)。鉴定荚膜多糖的模拟表位的方法是用在丝状噬菌体中展示的抗体随机肽文库进行的淘选。该技术基于丝状噬菌体在它们的表面上展示与病毒荚膜蛋白质融合的外源肽序列的能力。在病毒颗粒的表面上展示的肽序列可容易地接近，并且潜在地能够结合用于选择的分子，从而可基于这种亲和力来选择它们。可容易地从所选噬菌体的基因组的核苷酸序列推导出通过某一性质选择出的噬菌体文库的肽序列(ParmleyS.F.等人，1988.Antibody-selectablefilamentousfdphagevectors:affinitypurificationoftargetgenes.Gene73:305-318;SmithG.P.等人，1993.Librariesofpeptidesandproteinsdisplayedonfilamentousphage.MethodsEnzymol.217:228-257;CwirlaS.E.等人，1990.Peptidesonphage:avastlibraryofpeptidesforidentifyingligands.Proc.Natl.Acad.Sci.USA;87:6378-6382)。为了成为可能的疫苗候选物，这些肽必须首先能够结合针对原始抗原的特异性抗体和抑制这些抗体与该抗原的结合。第二，它们必须诱导免疫应答，所述免疫应答的特征在于存在识别该病原体和提供针对其所引起的感染的保护作用的抗体。这些肽具有确定的和可重现的结构，并且可以在疫苗制作中代替天然抗原，另外的优点是它们诱导的抗体的靶标是充分确定的，消除了诱导能够识别人组织的自身抗体的可能性，从而避免了形成自身免疫性疾病的可能'f生(Monzavi—KarbassiB.等人，2002.Peptidemimotopesassurrogateantigensofcarbohydratesinvaccinediscovery.Trends.Biotechnol.20:207-214)，这在来自脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群的荚膜多糖的情况下是特别重要的。在另一方面，可能使用展示肽的噬菌体直接免疫接种实验动物。这加快了可能的疫苗候选物的免疫评估的过程，因为这可能避免肽合成和缀合至蛋白质载体的常规程序。已证明，丝状噬菌体是有效的载体蛋白，其能够有效地将肽呈递给免疫系统(MeolaA.等人，1995.Derivationofvaccinesfromminmotopes:ImmunologicpropertiesofhumanhepatitisBvirussurfaceantigenmimotopesdisplayedonfilamentousphage.J.Immunol.154:3162—3172:delaCruzV.F.等人，1988.Immunogenicityandepitopemappingofforeighsequencesviageneticallyengineeredfilamentousphage.J.Biol.Chem.263:4318-4322;Gree画odJ.等人，1991.Multipledisplayofforeighpeptidesonafilamentousbacteriophage.PeptidesfromPlasmodiumfalciparumcircumsporozoiteproteinasa/2">e/^.J.Mol.Biol.220:821-827;WillisA.E.等人，1993./卿w2c^o^7ca/prefer〃es尸ore/g"pep〃des/'/7迈w/〃/7ed/577/ay0/2a/7/諸e/7fow516a"er/o;7力age.Gene128:79—83;Galfr6G.等人，1996.//zM/wn'zaf2'o/w^7力；7力age—cf/sp/a/ed迈/访c^o/;es.MethodsEnzymol.267:109-115;BastienN.等人，1997.尸rWe"细//zM7w/eresponses//dwcei/6/f力e/迈迈w//zsf/o/7c尸/7/ce<2reccw6/'/7a/7t6acfer/0;7力a《e^75^/3//'/7《a/7e/7/7o/7eoff力eAi//z72/7res/7/r"07ysj77cy〃a/Virology234:118-122;Men6ndezT.等人，2001.//H迈w2/safio/7y/f力/7力age—d/s/7/a/edKar2.a6/e2/Vo/z7/z7e"7/《ococca7owfer范e/16ra/2e/^rofe///"c^cesImmunol.Lett.39:143-148)。通过使用这种方法，除其他以外，已鉴定了几种多肽，其构成新型隐球酵母(Crj7^ococcws/zeo/or则/7s)、A群链球菌(i7repfococcwsgroupA)、B群链球菌(5Yr一ococ面groupB)的荚膜多糖和弗氏志贺氏菌(5^2>e//a/7e;r/er2')的脂寡糖的分子模拟物(ValadonP.等人，1996.户e/7f/de/2.6rar/esde/7力ef力e/7/zespec/ZVci^Fo/*Mol.Biol.261:11-22;HarrisS.L.等人，1997.i>/7or//^Me6aWs/7e/7〃de-cflr60/7j^/racrossreac〃".We"Ve/ce尸ord/scr/'j!Z/2V3af/a/6/pe;,/i/es6effree力c7ose7/re/afeda力t/一car6o/j^/i"aa/7f/60d/es.Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:2454—2459;PincusS.H.等人，1998.户e;^/cfes^Aaf/zz/zw/cf力e^row;Immunol.160:293-298;PhaliponA.等人，1997.//3c^c〃0/2o尸/z2./z/cs.Eur.J.Immunol.27:2620-2625)。在针对脑膜炎奈瑟氏球菌的疫苗开发领域中，还进行了涉及细菌荚膜多糖的分子模拟物的鉴定的工作。例如，已报导了，通过使用对于这种多糖特异的单克隆抗体对在丝状噬菌体上展示的随机肽文库进行选择来鉴定A血清群的荚膜多糖的分子模拟物。所述模拟表位能够抑制人超免疫血清与天然抗原的结合和能够在免疫接种实验动物后诱导高水平的抗多糖抗体的产生(GrothausM.C.等人，2000.t/2'^7ay//6rs/r.Vaccine18:1253-1263)。在脑膜炎球菌C血清群的情况下，合成具有相应于抗独特型抗体的轻链和重链高变区的序列的肽(模拟了脑膜炎球菌多糖C)，并用所述合成的肽进行免疫接种，导致在经免疫接种的动物的血清中检测到高水平的保护性抗脑膜炎球菌多糖C抗体(WesterinkM.A.等人，1995.尸e/7〃de迈/zz7/cr/f力e/ffe/7//7gc>coccW^row/7Cca;si/7ar/^7/5^cc力a"'de.Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:4021-4025)。由于可能将免疫应答准确地导向针对存在于所述血清群的多糖中的保护性构象表位(其不与人N-CAM共有)，模拟表位的鉴定技术的应用在搜寻针对脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群的疫苗候选物中是至关重要的。已报导了使用四种单克隆抗体以及线性和环状的七氨基酸长的肽的两个文库来鉴定此类结构，但在出版物中没有反映此类结构的免疫学评估(ShinJ.S.等人，2001.#o/7oc/offa/a/〃6od/e51s/7ec/Z7c尸or^e/sseWa/pe///7g/〃c^^r0"/75/70//sacc力aride^e/r;7e/^2'de/z72'/z70fo/7es.Infect.Immun.69:3335—3342)。后来，在2004年的出版物中，通过使用以前工作的单克隆抗体之一和展示出线性的12氨基酸长的肽的噬菌体文库，报导了三种新结构的鉴定，并在动物模型中进行了免疫学评估。所述血清很好地识别脑膜炎球菌B血清群，但在出版物中没有反映这些抗体的功能活性的评估(ParkI.等人，2004.尸e/7〃t/e迈/膨fo;e51oTiYe/5^er/a/pe//i7^g7〃t//51sero^ro"/5cs;7Si/7ar;o7/5^cc力s"Ve.YonseiMedicalJournal.45:755-758)。Granoff和Moe(GranoffD.M.和MoeG.R.2003."epHopes.美国专利6,642,354B2)保护67种肽序列在疫苗制剂中的用途，所述肽序列基于它们结合针对B血清群荚膜多糖的单克隆抗体的能力而选自在噬菌体中展示的肽库。合成了它们中的两种以选择用于免疫学研究，并且将它们缀合至脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜嚢泡，所述嚢泡纯化自荚膜突变型脑膜炎球菌B血清群菌林。在该专利中公开了，使用此类缀合物之一进行的免疫接种诱导产生显示出针对脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群的杀菌活性的抗体。考虑到将该肽缀合至脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜嚢泡(所述嚢泡的主要组分是该细菌外膜的蛋白质)和考虑到充分证明了它们诱导具有针对脑膜炎球菌的杀菌活性的抗体的能力，解释这些结果是非常困难的。在该研究中使用OMV作为载体妨碍了直接评估该肽诱导具有杀菌活性的抗体的能力。作者认为在这些血清中检测到的杀菌活性的级分是由于存在抗肽抗体，因为所述血清与未缀合的肽的温育在测定法中增加了细菌的存活。然而，在反映这些结果的科学出版物中，它们报告了，在用肽-OMV缀合物免疫接种后所引发的抗体微弱地识别原始抗原，并且未报导对血清的杀菌活性的评估(MoeG.R.等人，1999，#o/ecw7arpolysaccharidepputopesascaccinecandidatesforpreventionofNeisseriameningitidiesserogruopBdisease.FEMSImmunnol.Med.Microdiol.26和GranoffD.M.2001./o7"acc力ar/de.Int.Rev.Immunol.20:201-20)。特别是在针对脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群的疫苗的领域内，鉴定模拟表位的这一备选方案是重要的，因为根据该方法选择出的肽，即使与原始抗原完全不同，仍然能够导致产生针对处于其夭然情形中(即，在细菌的表面上，在这种情况下形成在多糖B上存在的保护性构象表位)的抗原的抗体。这些肽诱导产生具有针对脑膜炎奈瑟氏球菌的杀菌性和保护性活性的抗体。此外，因为这些肽引发的抗体不与由存在于某些人组织上的聚唾液酸短链所形成的表位交叉反应，从而消除了引起自身免疫性应答的可能性。因此，它们组成了备选的抗原来源，以允许开发在疾病的诊断、治疗或预防中具有潜在用途的新一代试剂。发明详述在本发明中，第一次报导了肽NMGBPS1、NMGBPS2、NMGBPS3和NMGBPS4作为用于诊断或疫苗制剂的试剂的组分，所述疫苗制剂具有针对脑膜炎球菌病或者由奈瑟氏球菌属(^e/^er/a)的成员或由任何其他细菌、病毒或寄生虫引起的任何感染的治疗或预防特性。本发明的创新在于第一次描述了肽NMGBPS1、NMGBPS2、NMGBPS3和NMGBPS4作为存在于脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群的荚膜多糖中的表位的分子模拟表位，其能够诱导针对该血清群的脑膜炎球菌菌林的杀菌性抗体的产生。所述肽可用作试剂以用于诊断和/或用在疫苗制剂中，以便治疗或预防由奈瑟氏球菌属的成员或其他细菌、病毒或寄生虫引起的疾病。在本发明中，使用单字母代码(例如A-丙氨酸、W-色氨酸、S-丝氨酸、E-谷氨酸、Y-酪氨酸、K-赖氨酸、F-苯丙氨酸、I-异亮氨酸、V-缬氨酸、P-脯氨酸等)来表示氨基酸。附图简述图1.将在使用抗多糖B单克隆抗体淘选噬菌体展示肽文库后选择出的噬菌体施加于硝酸纤维素膜上，并且使其与选择抗体(selectorantibody)反应。每个点相应于30pg的选择出的独个谨菌体克隆。将对照噬菌体施加于位置G5和15。图2.在三轮文库淘选后吸附至选择抗体的噬菌体的ELISA反应性的评估。独个地纯化噬菌体，并将其用于包被ELISA平板。该图显示了13个经评估的噬菌体在492nm处的ELISA吸光度(A492nm)。图3.在两轮文库淘选后吸附至选择抗体的噬菌体的ELISA反应性的评估。独个地纯化谨菌体，并将其用于包被ELISA平板。该图显示了16个经评估的噬菌体在492nm处的ELISA吸光度(A492nm)。图4.按照实施例9中的解释，使用3个ELISA系统(常规ELISA、夹心ELISA和抑制ELISA)进行的噬菌体的反应性的评估，所述噬菌体在它们的表面上展示通过用抗多糖B单克隆抗体淘选噬菌体展示肽文库而选择出的肽。图5.通过ELISA评估的在使用在丝状噬菌体中展示的肽NMGBPS1-NMGBPS4免疫接种Balb/c小鼠后诱导的IgG抗体的水平。该图显示了对于用每种所述噬菌体免疫接种的组，与相应的在免疫接种前收集的免疫前血清相比，在三次剂量后收集的免疫血清中检测到的特异性抗体的增加。图6.在纤维素膜上合成的肽片段，其用于确定由抗多糖B单克隆抗体和经诱导的针对肽NMGBPS1的鼠类血清所识别的表位。图7.抗多糖B单克隆抗体(左图)和经诱导的针对肽NMGBPS1的鼠类血清(右图)与来源于肽NMGBPS1的肽片段的集合物(collection)的反应性。所述肽片段的集合物的设计显示于图6中。图8.在针上合成的肽的集合物，其来源于引入肽NMGBPS1中的修饰，所述修饰由下列组成a)在各位置处，在位置7和8处用Ala同时置换Pro,和b)在结合抗多糖B单克隆抗体的序列中引入1至3个点置换。肽1相应于NMGBPS1的序列。图9.图8中显示的在针上合成的肽的集合物与抗多糖B单克隆抗体的反应性。肽的编号与图8中所示的列表中的一样。条块l显示了与肽NMGBPS1的反应性。图10.来源于NMGBPS1的序列的肽与抗多糖B单克隆抗体的反应性。各肽的置换如下用A置换V12(肽5)、用S置换V12(肽11)、用E置换V12(肽12)、用A置换V9(肽16)、用E置换Yu(肽14)、用I置换Yn(肽2)。在每种情况下，P7和Ps在各位置处同时被A置换。肽的编号与图8中所示的列表中的一样。条块1(肽7)显示了P7和Ps在各位置处同时被A置换的肽NMGBPS1的反应性。图11.抗多糖B单克隆抗体与基于序列NMGBPS1的肽的反应性，其中图8中的残基Eu和另外的残基被置换。在所有情况下，P,和P8在各位置处同时被A置换。肽的编号相应于图8中所示的列表。条块1(肽7)显示了P7和Ps在各位置处同时被A置换的肽NMGBPS1的反应性。图12.在针上合成的肽的集合物，其来源于引入肽NMGBPS1中的修饰，所述修饰由下列组成a)用A12、Su和Eu置换V12，和b)用A7置换P或用As置换Ps。肽1相应于NMGBPS1的序列。图13.图12中显示的在针上合成的肽的集合物与抗多糖B单克隆抗体的反应性。图14.抗多糖B单克隆抗体与基于序列NMGBPS1的肽(条块l)的反应性，在所述肽中引入下列修饰1)用F,。置换Wm和2)用A7置换P,或用As置换Ps。该图还显示了各个肽的序列。图15.抗多糖B单克隆抗体与脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群的荚膜多糖的结合的抑制，所述抑制通过使用下列物质作为配体来进行a)以串联方式包含3个拷贝的最小序列的肽，所述最小序列对于肽NMGBPS1与抗多糖B单克隆抗体的结合来说是必需的，b)肽NMGBPS1,和c)对照肽。本发明的优选实施方案的详述实施例1.使用抗脑膜炎奈瑟氏球菌的多糖B的单克隆抗体来淘选在噬菌体上展示的肽文库为了选择在本发明中描述的肽，构建在丝状噬菌体的P8区域中表达的15个氨基酸残基的线性随机肽文库。使用不识别人组织的、具有针对脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群的杀菌活性的鼠类单克隆抗体作为选择性分子来淘选所述文库(PonR.A.等人，1997.N-propionylatedgroupBmeningococcalpolysaccharidemimicsaunique6a"er/c油7capsw/arep/帥e//7-gr卯/A^e/sser/a應s.J.Exp.Med.185:1929-1938)。基本上如文献(SmithG.P.等人，1993."6rar/e"/卿〃desprofe//^(//》7a/ef/o/7/7/猪e/^ows;力age.MethodsEnzymol.217:228-257)中所描述的，循环进行文库的淘选，除了将抗体直接用于包被固体支持物外。在噬菌体和单克隆抗体反应后，收集和滴定未吸附至抗体的噬菌体级分(级分Nl)。此外，收集吸附至抗体的噬菌体级分(级分Al)，并测定噬菌体的滴度。计算滴度N1/滴度A1比率。扩增级分A1并允许其与抗多糖B单克隆抗体反应，并且再次收集和滴定吸附至抗体和未吸附至抗体的噬菌体级分。重复这些循环直至滴度N/滴度A比率低于103。进行四轮淘选。表1显示了在各轮淘选后在滴定所收集的级分A和N后获得的值。该表还显示了在进行扩增和纯化以用于随后的轮次后，在各轮淘选中获得的级分A的滴度。表l.各轮淘选后获得的滴度，其表示为级分A和N的氨千青霉素抗性的转导单元(TransductionUnit)(TU/mU;以及相应的滴度比率N/A。Aamp:经扩增和纯化的级分A。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>将在4轮文库淘选后吸附至选择抗体的噬菌体用于感染大肠杆菌XL-1blue细胞，将几个稀释物倒在包含培养基2XYT的琼脂平板上。选择独个噬菌体并且在液体培养中进行扩增。通过使用聚乙二醇进行沉淀来纯化噬菌体。实施例2.选择抗体与在4轮文库淘选后选择出的噬菌体的反应。将纯化的噬菌体(30网)施加至硝酸纤维素膜上。还施加等量的对照噬菌体。在用脱脂牛奶封闭后，将膜与抗多糖B单克隆抗体一起温育。通过与缀合至辣根过氧化物酶的特异性地识别小鼠IgG的抗体以及包含H202和生色团二氨基联苯胺的溶液一起温育来检测反应性。图1显示了结果。选择出相应于具有更大强度的点的25个噬菌体以用于进一步的工作。实施例3.在用抗多糖B单克隆抗体进行4轮文库淘选后选择出的噬菌体的DNA的纯化和测序。纯化25个在免疫鉴定实验中呈阳性的噬菌体的DM,并且测定核苷酸序列。如先前所述，进行噬菌体DNA的纯化(SambrookJ.等人，1989.MolecularCloning,aLaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,USA)。使用自动测序仪ALFexpressII(TermoSequenaseCyTM5DyeTerminadorKit,AmershamBiosciences)，通过使用M13/pUC测序引物(-47)#1224，NewEnglandBiolabsInc.,USA)和M13/pUC反向测序引物(-48)#1233，NewEnglandBiolabsInc.,USA)这些寡核苷酸对病毒DNA进行测序。如序列表中所示，所有克隆具有相同的序列(SEQIDNO:1)。相应于该DNA序列翻译成蛋白质序列的肽显示于序列表中(SEQIDNO:5)。实施例4.在使用抗多糖B单克隆抗体进行4轮文库淘选后选择出的噬菌体中所展示的肽序列的表征。为了分析在4轮文库淘选后选择出的在噬菌体中展示的序列，将其与先前报道的脑膜炎奈瑟氏球菌多糖B的模拟结构的其他序列迈油帥es.Infect.Immun.69:3335-3342;ParkI.等人，2004.ca/75^/ar/70//i^cc力a"Ve.YonseiMedicalJournal.45:755-758;MoeG.R.等人，1999.#o/ecw/ar历/迈e〃cso/p0/7sacc力ar/dee//fopesasFacc/z/eca/3d/cf"es尸orpre7e/7〃0/7o/*iYe/5^er/a迈6/7//2^/^/^//夕serogro^p_gt//sease.FEMSImmunol.Med.Microbiol.26:209—269;MoeG.R和GranoffD.M.2001.￥o7eci//ar迈/zz7e"'"。/iVe/5^er/a/ge/7j./^7.〃^.s^e/"。^Tow/7/70//i^cc力3r2.de.Int.Rev.Immunol.20:201-20;GranoffD.M.和MoeG.R.2003.5ep〃o;es.USP6,642,354B2)进行比对，在任何情况下，都没有发现相似性百分比大于29%。使用软件ClustalW来进行比对(ThompsonJ.D.等人，1994.a^ST"於/.范;77^W/^Me5"e/2s/fi>/^/o尸pro^Tess/ye/z/i//f///esegweiJceaZ/g/2迈e/^f力rowg力/Z7afr/;rc力o/ce.NucleicAcidsRes.22:4673—80)。还通过使用软件BLASTP2.2.10在NCBI的数据库中进行相似性搜索来表征所述序列(AltschulS.F.等人1997.^/7/7ed见^5Ts/dNucleicAcidsRes.25:3389-3402)。该搜索限定于包含在数据库SwissProt(http://www.ebi.ac.uk/swissprot/)和NCBI(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的细菌基因和蛋白质的序歹'J。这一过程的结果表明，肽NMGBPS1与储存在这些数据库中的序列的相似性百分比不大于30%。实施例5.选择抗体与在第三轮文库淘选后选择出的噬菌体的反应性。为了鉴定脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群的荚膜多糖的其他模拟结构，通过ELISA来评估在第三轮文库淘选后吸附至抗多糖B抗体的噬菌体。独个地纯化噬菌体并将其用于包被ELISA平板。在该实验中还包括对照噬菌体和展示出肽NMGBPS1的噬菌体。在使用脱脂牛奶封闭后，将平板与抗多糖B单克隆抗体一起温育。在与缀合至辣根过氧化物酶的对于小鼠IgG特异的抗体以及包含H202和生色团邻苯二胺(OPD)的溶液一起温育后，揭示出反应性。使用2.5N硫酸来终止反应，并在ELISA平板阅读器中读取A"^。图2显示了对于几个纯化的噬菌体而获得的结果。选择ELISA信号的强度比对照噬菌体更大的20个噬菌体以进行进一步的工作。实施例6.在用抗多糖B单克隆抗体进行的第三轮文库淘选后选择出的谨菌体的DNA的纯化和测序。根据与实施例3中描述的相同的程序，对20个在通过ELISA进行的免疫鉴定实验中呈阳性的噬菌体的DM进行纯化和测序。所有的克隆具有与在第四轮文库淘选后分离的噬菌体的序列相同的序列。该序列显示于序列表的SEQIDNO:l中。相应于该DNA序列翻译成蛋白质序列的氨基酸序列显示于序列表的SEQIDNO:5中。实施例7.选择抗体与在第二轮文库淘选后选择出的噬菌体的反应性。为了继续搜索脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群的荚膜多糖的其他模拟结构，通过ELISA来评估在第二轮文库淘选后吸附至抗多糖B抗体的噬菌体。独个地纯化噬菌体并将其用于包被ELISA平板。在该实验中还包括对照噬菌体和展示出肽NMGBPS1的噬菌体。在使用脱脂牛奶封闭后，将平板与抗多糖B单克隆抗体一起温育。在与缀合至辣根过氧化物酶的对于小鼠IgG特异的抗体以及包含H202和生色团邻苯二胺(OPD)的溶液一起温育后，揭示出反应性。使用2.5N硫酸来终止反应，并在ELISA平板阅读器中读取Aw^。图3显示了对于几个纯化的噬菌体而获得的结果。选择ELISA信号的强度比对照噬菌体更大的15个噬菌体以进行进一步的工作。图8.在用抗多糖B单克隆抗体进行的第二轮文库淘选后选择出的噬菌体的DNA的纯化和测序。根据与实施例3中描述的相同的程序，对15个在免疫鉴定实验中呈阳性的噬菌体的DNA进行纯化和测序。鉴定出了总共5个独特的序列。表2概述了在噬菌体中展示的每一个序列的出现频率。序列l相应于肽NMGBPS1。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>实施例9.展示于通过文库淘选而选择出的噬菌体上的肽的反应性的ELISA表征。纯化表达在实施例8中鉴定的独特序列中的每一个序列的谨菌体，并研究它们与抗多糖B单克隆抗体的反应性。进行3个BLISA实验1)常规ELISA，其中将噬菌体直接施加至聚丙烯平板上，然后加入抗多糖B单克隆抗体，最后加入对小鼠IgG特异的免疫球蛋白；2)夹心ELISA，其中将抗多糖B单克隆抗体直接施加至ELISA平板上，然后加入噬菌体，随后加入在兔子中获得的抗野生型M13-噬菌体血清，最后加入对兔IgG特异的免疫球蛋白；3)抑制ELISA,其中用从细菌中纯化出的多糖B的溶液包被平板，并加入抗多糖B单克隆抗体与噬菌体的混合物，最后加入对小鼠IgG特异的免疫球蛋白。在所有情况下，将在最终加入的免疫球蛋白缀合至辣根过氧化物酶，并使用包含11202和生色团邻苯二胺(OPD)的溶液来揭示反应性。使用2.5N疏酸来终止反应，并在ELISA平板阅读器中读取A,9h。图4显示了所获得的结果。表达表2中所显示的独特序列2、3和5的噬菌体克隆在3个ELISA中的表现与肽NMGBPS1类似，然而表达表2中所显示的独特序列4的噬菌体在3个ELISA中的表现与对照噬菌体类似。被选择用于进一步工作的肽2、3和5分别重新命名为腦BPS2、腦BPS3和NMGBPS4。相应于NMGBPS2、NMGBPS3和NMGBPS4的DNA序列显示于序列表中(分別为SEQIDNO:2、3和4)。相应于这些DM序列翻译成蛋白质序列的肽显示于序列表中(分别为SEQIDNO:6、7和8)。表2显示了鉴定出的噬菌体与序列标识号之间的对应。实施例10.在用抗多糖B单克隆抗体进行的第二轮文库淘选后选择出的噬菌体中表达的肽序列的表征。为了分析在第二轮文库淘选后选择出的噬菌体中展示的序列，将其与在出版物中报导的脑膜炎奈瑟氏球菌多糖B的模拟结构的其他序歹寸(ShinJ.S.等人，2001.Vo刀oc7o/7a7a/7"6od/e51s/7ec/Z7c/z/2'/z^。拜.Infect.Immun.69:3335-3342;ParkI.等人，2004.ca;7S^/ar/o/j^acc力ar/de.YonseiMedicalJournal.45:755-758;MoeG.R.等人，1999.历/i!!7e〃cs/o7/5^cc力aWdee;y,o/e51asp^c"'/eca;2(l/(/a/or/7re7e/2〃0/7o尸AWsser/a/Z7e"i.力^7〃c^sero》ro";7Wsease.FEMSImmunol.Med.Microbiol.26:209-269'，MoeG.R和GranoffD.M.2001.#o/ecu/ar/z7/.zz7e〃"o尸iVe/^er/a/zye/72./ff"油'sserogro";5po7ysacc/ar/de.Int.Rev.Immunol.20:201-20;GranoffD.M.和MoeG.R.2003.^e;7〃0pes.USP6,642,354B2)进行比对，在任何情况下，对于肽NMGBPS2没有发现相似性百分比大于30%,对于肽NMGBPS3没有发现相似性百分比大于33%,和对于肽NMGBPS4没有发现相似性百分比大于40%。使用ClustalW程序来进行比对(ThompsonJ.D.等人，1994.CLUSTALW:improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,position-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice.NucleicAcidsRes.22:4673-80)。还通过使用软件BLASTP2.2.10在NCBI的数据库中进行相似性搜索来表征所述序列(AltschulS.F.等人1997.&/7/7ecTWASTa/dNucleicAcidsRes.25:3389-3402)。该搜索限定于包含在数据库SwissProt(http://www.ebi.ac.uk/swissprot/)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的细菌基因和蛋白质的序列。这一过禾呈的结果表明，对于肽NMGBPS2和4,针对在这些数据库中储存的序列而检测到的相似性百分比低于30%,和对于肽NMGBPS3低于35%。实施例11.使用在其表面上展示出肽NMGBPS1-NMGBPS4的噬菌体，通过腹膜内途径来免疫接种Balb/c小鼠。为了评估肽NMGBPS1-NMGBPS4的免疫原性，在Balb/c小鼠中进行免疫接种方案，其中用展示所述肽的噬菌体直接接种动物。按照由delaCruz及合作者(delaCruzF.V.等人，1988.7/ZM//7c>《e/3/c//7s/d/77a历e/^oM/7力age.J.Biol.Chem.25:4318—4322)4葛述的对于纯化操作程序1(LinT.C.等人，1980./i^"〃o/s刀dc力aracfer/zaf/o力o,f力eC3/7^"/7rofe//7^coded67《e/es/dge/7eK/"f力e/7/a/Z7e/7"i/516a"eWo/7力age/7a/7d/V.J.Biol.Chem.255:10331-10337)的改进，通过氯化铯梯度来纯化噬菌体。用每种噬菌体免疫接种7只Balb/c小鼠(H-2d雌性，7-8周龄)的组。每只小鼠在每次接种中接受IO"个病毒颗粒。在每一次用缀合至人血清白蛋白(HSA)的、N-丙酰化的脑膜炎奈瑟氏球菌多糖B(pPSC-B)(pPSC-B/HSA)进行的接种中，以5ug/小鼠免疫接种另一组小鼠(JenningsH.J.等人，1986.//2dwc〃0/7o尸/z7e/7/'/7gcicc7cca/Mcc//2e.JImmunol137:1708-1713)。通过腹膜内途径进4亍3次免疫接种，其中间隔15天。在第一剂中使用完全弗氏佐剂来乳化所有免疫原，在相继的剂中使用不完全弗氏佐剂来进行乳化。表3描述了各组所接受的免疫原。表3.用于肽的免疫学评估的小鼠和免疫原的组，所述肽是通过使用抗多糖B单克隆抗体淘选展示在噬菌体上的肽文库而选择出来的。组免疫原1谨菌体NMGBPS12嗟菌体NMGBPS23谨菌体NMGBPS34谨菌体NMGBPS45对照噬菌体6pPSC-B/HSA实施例12.肽NMGBPS1-薩BPS4的免疫原性的ELISA评估。通过ELISA来评估由在丝状噬菌体中展示的肽NMGBPS1-NMGBPS4所诱导的抗体(IgG)的水平。通过使用具有经鉴定的肽的序列的合成肽作为用于包被ELISA平板的抗原，来评估在第三次接种后获得的动物的血清。图5显示了，在3次免疫接种后，针对展示于噬菌体上的肽的特异性IgG抗体的水平显著增加。为了进行所述结果的统计学分析，使用通过Kruska1-Wallis等级进行的简单分类的方差分析的非参数方法，因为根据Bartlett检验，组间的方差不是同质的。为了进行非参数多重比较，使用Dunns检验。实施例13.由肽诱导的抗体的血清杀菌活性的评估，所迷肽是通过使用抗多糖B单克隆抗体淘选展示在噬菌体上的肽文库而选择出来的。通过血清杀菌活性测定法来评估来自用各免疫原接种的每组小鼠的血清的混合物。Ashton及合作者所使用的测定法(AshtonF.E.等人，1989.户rc^ec〃ree/77cac/C迈卯seser咖fof力ejV-z^to;////der/r<2/7</^row/^/o7/5^cc力siV'f/e.Microb.Pathog.6:455-458)适用于评估针对脑膜炎球菌多糖B的抗体，但其中并不使用这些研究者所推荐的緩冲溶液，而使用补充有BSA的Veronal溶液。当评估针对脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群的荚膜的抗体时，推荐该溶液用于增加杀菌活性测定法的灵敏度(MandrellR.E.等人，1995.Co/z^/effle/^ie^//""6a"er/c/da/ac"V"yo尸a/^/^od/estopo//a/p力a2一->《y—aceO^/2ei/ra迈2'/2/cac/《t力eca/5^/ar;70/7^acc力ar/fl^c/迈e/z/./7^^cocca/^ro://7及J.Infect.Dis.172:1279-1289)。将血清学分类B:4:Pl.19，15的脑膜炎奈瑟氏球菌菌林CU385用于该测定法。杀菌抗体的滴度表示为与对照相比能够杀死至少50。/。的细菌的所评估抗体的更大稀释度的倒数。表4显示了结果。表4.评估在用展示出肽的噬菌体进行免疫接种的小鼠血清中的杀菌活性，所述肽是通过用抗多糖B单克隆抗体淘选肽文库而选择出的。针对脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群菌抹CU385，来评估来自用各免疫原接种的小鼠的血清混合物。SBT:血清杀菌滴度。NT:无滴度。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>实施例14.由抗多糖B单克隆抗体和由鼠类血清所识别的肽区域的作图。为了研究由抗多糖B单克隆抗体和由用展示这些肽的丝状噬菌体免疫接种的小鼠血清所识别的肽NMGBPS1-4的区域，在纤维素膜上合成重叠有4个残基且覆盖肽NMGBPS1-4的整个序列的五残基肽片段的集合物，还合成了包含下列连续氨基酸残基缺失的这些肽的片段1)从氨基末端；2)从羧基末端；和3)同时从两个末端。图6显示了合成的肽片段的设计，其用于肽NMGBPS1的区域的作图。图7(左图)显示了当将纤维素膜与抗多糖B单克隆抗体一起温育时获得的结果。在五氨基酸残基肽中，识别出具有序列VWYVE和WYVEG的那些。该结果和使用其余的肽所获得的反应性模式的分析允许得出结论在肽NMGBPS1内的对于抗多糖B单克隆抗体的结合而言所必需的最小序列是四肽WYVE。图7(右图)显示了，将在纸上合成的肽集合物与用在丝状噬菌体上展示的肽NMGBPS1免疫接种的小鼠血清混合物进行温育使得能够识别具有序列WYVEG的肽片段，这与对于单克隆抗体所获得的结果一致。该血清混合物还识别相应于具有序列RPPVW和PPVWY的肽片段的点，这表明在肽NMGBPS1中第二表位的形成能够诱导抗体的产生。根据肽NMGBPS1的结构预测，得出这样的结论，即对于该第二表位的形成，两个P的存在是极其重要的，因为它们将转角引入该肽的结构中，这有利于将肽的该区域呈递给免疫系统。实施例15.通过对肽NMGBPS1-4进行点突变而衍生出的肽集合物的合成，和所述肽与抗多糖B单克隆抗体的反应性。通过考虑来自根据实施例14实施的实验的结果，我们考虑进行肽NMGBPS1-4的变体的搜索，所述变体1)除了结合抗多糖B单克隆抗体的区域外不包含任何额外的区域，其具有诱导免疫应答的能力；和/或2)具有更大的与抗多糖B单克隆抗体的亲和力。为了获得这一点，我们选择了肽集合物的合成方法，在所述肽集合物中，将肽的各个P(位点7和8)用A进行置换，并将1至3个点变化(相对于原始氨基酸)引入相应于对于结合抗多糖B单克隆抗体所必需的序列的位置中。另外，通过考虑在电荷、疏水性和亲水性、极性、结构同源性和氨基酸侧链的体积方面的相似性来改变原始氨基酸。此外，还合成了其中在各位置处引入一个A的肽。图8显示了合成的肽集合物，其用于肽NMGBPS1的优化。肽l相应于NMGBPS1序列。在所有肽中，在7和8这两个位置处用Ala同时置换位置7和8处的Pro。在相应于对于结合抗多糖B单克隆抗体所必需的氨基酸的位置中，通过考虑在之前段落中解释的标准，引入1至3个点改变。图9显示了图8中所示肽集合物与抗多糖B单克隆抗体的反应性。A7对P7和As对Ps的同时置换(肽7，图9)减少了肽NMGBPS1(肽l,图9)与抗多糖B抗体的结合的亲和力。考虑到这一点，在抗多糖B单克隆抗体与其他合成肽的反应性的分析中，选择保留了对于结合单克隆抗体所必需的完整表位、但在位置7和8的每个处具有Ala的肽作为阳性对照(肽7，图9)。这允许我们鉴定出位置12(该位置在原始肽中为V)作为用于引入变化的有利位置。例如，与阳性对照(肽7，图10)相比，Au对Vu的置换(肽5，图IO)增加了与单克隆抗体的亲和力，然而与阳性对照(肽7，图10)相比，Su对Vu的置换(肽ll，图IO)或Eu对Vu的置换(肽12，图10)产生了保留超过85%的与单克隆抗体的反应性。在其中用A9置换V9(肽16，图IO)和用Eu置换Yn(肽14，图10)或/和用Iu置换Yu(肽2，图IO)的肽中，与阳性对照相比，保留了超过75%的与抗多糖B单克隆抗体的反应性(肽7，图IO)。其他位置处的变化使肽与单克隆抗体的反应性降至低于相对于阳性对照的75%。相应于在图8中显示为2、5、7、11、12、14和16的肽的序列以Seq.IDNo.9、Seq.IDNo.10、Seq.IDNo.11、Seq.IDNo.12、Seq.IDNo.13、Seq.IDNo.14和Seq.IDNo.15显示于序列表中。图11显示了具有在位置13处进行了置换的肽。应当注意，该位置(在原始的肽中为E)不利于突变的引入，因为置换该氨基酸将导致与单克隆抗体的反应性相对于阳性对照(肽7,图ll)的反应性而言非常低。当改变氨基酸13时，其他氨基酸位置处的其他变化的引入不提高与抗体的反应性。因此，存在于该肽序列中的谷氨酸对于识别是必需的。考虑到前述结果，合成了新的肽集合物，其中用A只置换两个P中的一个，并且只考虑了在与抗多糖B抗体结合的序列中的置换，其与阳性对照肽相比保持了超过85。/。的与抗多糖B抗体的反应性。图12显示了第二肽集合物，其被合成用于继续肽NMGBPS1的序列的优化。序列1相应于肽NMGBPS1。我们合成了其中用于结合抗多糖B抗体的序列只包含下述变化的肽Au对Vu的置换、Su对Vu的置换和Eu对L的置换以及包含A对一些P的置换。作为实验的对照，合成了包含原始肽的所有P或包含所有同时被A置换的P的相似的肽。图13显示了图12中所述的肽集合物与抗多糖B单克隆抗体的反应性。当结合抗多糖B抗体的表位保持完整时，A7对P7的置换允许恢复97。/。的与抗体的反应性，并且当引入额外的Au对Vu的置换时，与肽NMGBPS1相比恢复了8U的反应性。相应于在图8中显示为2-12的肽的序列以Seq.IDNo.16、Seq.IDNo.17、Seq.IDNo.18、Seq.IDNo.19、Seq.IDNo.20、Seq.IDNo.21、Seq.IDNo.22、Seq.IDNo.23、Seq.IDNo.24、Seq.IDNo.25和Seq.IDNo.26显示于序列表中。在另一个实验中，评估了其中用F置换氨基酸W的肽的反应性。图14显示了抗多糖B单克隆抗体与源自NMGBPS1的肽(其中，引入了F!。对W!。的置换，以及A7对P7或As对Ps的额外置换)的反应性。图10显示了所述合成肽的序列。与肽NMGBPS1相比，在其中同时引入A7对P7和F,。对l。的置换的肽(肽2，图14)中保留了86。/。的与抗体的反应性。相应于在图14中在条块2、3和4的底部中所显示的肽的序列以Seq.IDNo.27、Seq.IDNo.28和Seq.IDNo.29显示于序列表中。实施例16.肽的合成，所述肽包含几个拷贝的对于抗多糖B单克隆体与肽NMGBPS1-4结合而言所必需的最小序列。被建议用于确定具有更大的与抗多糖B单克隆抗体的亲和力的肽的其他策略是合成这样的肽，所述肽以串联的方式包含几个拷贝的对于抗多糖B单克隆抗体与肽NMGBPS1-4结合而言所必需的最小序列。另外地，该策略将免疫应答限定于只针对在肽NMGBPS1—4中对于结合抗多糖B单克隆抗体所必需的区域。与原始的肽相比，就抑制抗多糖B单克隆抗体与脑膜炎球菌多糖B的结合方面，通过ELISA来评估所述合成肽。用细菌多糖B的溶液包被聚苯乙烯平板。向ELISA平板中加入固定浓度(5ug/ml)的抗多糖B单克隆抗体与不同浓度的肽的混合物。然后，加入缀合至辣根过氧化物酶的对于小鼠IgG特异的免疫球蛋白，并用包含11202和生色团邻苯二胺(0PD)的溶液来揭示反应性。使用2.5N硫酸来终止反应，并在ELISA平板阅读器中读取A图15显示了用所述合成的肽(其包含3个拷贝的对于抗多糖B单克隆抗体与肽NMGBPS1结合而言所必需的最小序列)获得的结果。该肽能够比肽NMGBPS1更有效地抑制抗多糖B单克隆抗体与多糖B的结合。权利要求1.命名为NMGBPS1-25的肽，其特征在于，其是能够在受者生物体中产生针对糖的免疫应答的抗原，并且具有在序列表中Seq.IDNo.5-Seq.IDNo.29所示的氨基酸序列，所述糖具有通过(α2-8)键连接的、N-取代的神经氨酸重复单元的化学结构。2.权利要求1的命名为NMGBPS1、NMGBPS2、NMGBPS3和NMGBPS4的肽，其特征在于，其由在序列表中Seq.IDNo.1、Seq.IDNo.2、Seq.IDNo.3和Seq.IDNo.4所示的称为ADN-NMGBPS1、ADN-NMGBPS2、ADN-NMGBPS3和ADN-NMGBPS4的DNA片段编码。3.称为ADN-NMGBPS1、ADN-NMGBPS2、ADN-NMGBPS3和ADN-NMGBPS4的DNA片段，其特征在于，其具有在序列表中Seq.IDNo.1、Seq.IDNo.2、Seq.IDNo.3和Seq.IDNo.4所示的碱基序列，并且编码肽NMGBPSl-4,所述肽的特征在于具有在序列表中Seq.IDNo.5、Seq.IDNo.6、Seq.IDNo.7和Seq.IDNo.8所示的氨基酸序列。4.权利要求1的命名为NMGBPS1—25的肽或其片段，其特征在于，其是能够在受者生物体中产生针对糖的免疫应答的药物制剂的活性组分，所述糖具有通过(a2-8)键连接的、N-取代的神经氨酸重复单元的化学结构。5.权利要求4的药物制剂，其特征在于，其包含多糖抗原。6.权利要求4和5的药物制剂，其特征在于，所述制剂的组分之一是脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖。7.权利要求4、5和6的药物制剂，其特征在于，其包含蛋白质-多糖缀合物。8.权利要求4、5、6和7的药物制剂，其特征在于，其为通过肠胃外、粘膜或口服途径施用的制剂。9.权利要求4、5、6、7和8的药物制剂，其特征在于，其包含肽NMGBPS1-25中至少一种肽的模拟结构或模拟表位。10.权利要求1和8的命名为NMGBPSSeq.IDNo.5-8、16-26和27-29的肽，其特征在于，脯氨酸被丙氨酸置换。11.权利要求1和9的命名为NMGBPSSeq.IDNo.7-26的肽，其特征在于，色氨酸被苯丙氨酸置换。12.权利要求1和9的命名为NMGBPSSeq.IDNo.5－6，8－29的肽，其特征在于，缬氨酸被丙氨酸置换。13.权利要求1和9的命名为NMGBPSSeq.IDNo.5－6，8－29的肽，其特征在于，缬氨酸被丝氨酸置换。14.权利要求1和9的命名为NMGBPSSeq.IDNo.5－6，8－29的肽，其特征在于，缬氨酸被谷氨酸置换。15.权利要求1和9的命名为NMGBPSSeq.IDNo.5，9－13和16-29的肽，其特征在于，酪氨酸被谷氨酸置换。16.权利要求1和9的命名为NMGBPSSeq.IDNo.5，9－13和16-29的肽，其特征在于，酪氨酸被异亮氨酸置换。17.权利要求1和9的命名为NMGBPS1-25的肽，其特征在于，所述肽序列中的任何谷氨酸对于由它们诱导的针对脑膜炎奈瑟氏球菌的保护性抗体的识别来说是必需的。18.药物制剂，其包含权利要求4、5、6、7、8和9的至少一种肽或至少一种蛋白质作为各种不同性质的抗原的载体。19.权利要求1的命名为NMGBPSl-25的肽或其片段，其特征在于，其是用于诊断疾病的组分，在所述疾病中免疫应答的靶标是糖，所述糖具有通过(oc2-8)键连接的、N-取代的神经氨酸重复单元的化学结构。全文摘要本发明涉及制药工业和生物技术学，特别地涉及用于针对细菌、病毒、癌症或其他来源的疾病的疫苗抗原。本发明涉及开发能够保护或增加现有疫苗的保护谱并将其扩展至抗不同病原体的制剂，其中使用由(α2-8)神经氨酸的N-取代的重复单元形成的糖作为免疫应答的靶标。根据本发明，分离出了几种肽并鉴定为脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)B血清群的荚膜多糖的分子模拟物，所述荚膜多糖由(α2-8)N-乙酰基神经氨酸的重复单元形成。在动物生物模型中评估所述肽的免疫原性，证明了它们作为能够诱导抗体的抗原的价值，所述抗体能够特异性地识别B血清群的脑膜炎奈瑟氏球菌并显示出抗所述细菌的杀菌活性。所得的本发明制剂可应用于制药工业，以作为用于人类使用的疫苗制剂。文档编号A61K38/16GK101389643SQ200680053451公开日2009年3月18日申请日期2006年12月28日优先权日2005年12月29日发明者E·古伊斯阿鲁罗德里格斯,G·E·古伊伦尼尔托,G·奇内亚圣地亚哥,H·E·加雷佩雷兹,N·F·圣地亚哥比斯波,O·雷伊斯阿考斯塔,T·梅南德斯麦迪纳,Y·格鲁斯雷阿申请人:遗传工程与生物技术中心