专利名称：优化的登革病毒进入抑制肽(dn81)的制作方法
优化的登革病毒进入抑制肽(DN81)相关申请的交叉引用本国际专利申请要求2007年7月13日提交的美国临时申请号60/949，710的优 先权和利益其通过弓I用并入本文。本发明涉及能与病毒区域结合的抑制剂。更具体而言，本发明涉及能与登革病毒 包膜糖蛋白或登革病毒E蛋白，一种II类病毒E蛋白，中的区域结合的抑制剂。再具体而 言，本发明涉及肽进入抑制剂和确定这些能与登革病毒E蛋白区域结合的抑制剂作为体内 抗病毒化合物候选物的方法。
背景技术：
登革病毒是黄病毒家族成员，施加了任何蚊媒病毒病原体的最大社会和经济负担 之一。没有感染的特异性疗法，通过疫苗接种控制登革病毒已证明难以实现。几种其他的 黄病毒是重要的人病原体，包括黄热病毒、西尼罗河病毒、蜱传脑炎病毒(TBE)和日本脑炎 病毒(JE)。包膜病毒通过膜融合进入细胞。黄病毒的结构蛋白E介导受体结合和融合两者， 是所谓的“II类”病毒融合蛋白。目前为止已鉴定了两类病毒“融合器(fusion machine)”。 I类病毒融合蛋白包括粘和副粘病毒(例如流感病毒)、逆转录病毒(例如HIV)和纤丝病 毒(例如埃博拉病毒)。II类融合蛋白不仅发现于黄病毒(黄热病毒、西尼罗河病毒等)， 还发现于α病毒，其包括塞姆利基森林病毒和辛德比斯病毒以及丙型肝炎病毒。这两类的 结构特征区别很大，但其均完成了同样的任务，即融合两个脂双层。人们更为熟悉的I类融合蛋白，例如流感病毒的血球凝集素(HA)和HIV的gpl20/ gp41，在内部切割位点的N末端或其附近具有“融合肽”。该疏水和富含甘氨酸的片段包埋 于I类融合蛋白的预切割处理(cleaved-primed)三聚体中，当低pH值(HA情况下)、受体 结合(gpl20/gp41情况下)或其他细胞进入相关信号引发大规模构象重排时显露出来。随 后的可能事件包括融合蛋白与靶细胞膜的相互作用和三聚体的再折叠。后一步骤使融合肽 与病毒膜锚着点聚集在一起，从而结合细胞和病毒膜，启动双分子层的融合过程。目前为止在黄热病毒和α病毒中发现的II类蛋白已进化出结构不同但机理相关 的融合构造。在I类蛋白中，溶蛋白性裂解(黄病毒中从PrM到Μ，α病毒中从ρΕ2到Ε2) 产生成熟病毒体，融合蛋白处于亚稳构象，为融合而准备好的(primed)。融合肽，蛋白延长 的亚结构域尖端的内环，包埋在蛋白界面，在暴露于低pH值引发的构象变化中显露出来。II类病毒融合蛋白的融合机制尚未清楚地理解，也没有理论能特异性地抑制这些 蛋白的融合。目前为止仅确定了一种黄病毒和一种α病毒包膜蛋白的前融合结构。因此 需要能特异性抑制黄病毒、α病毒和肝炎病毒的病毒感染的进入抑制剂。此外，由于融合 是病毒感染中的关键步骤，关于包括登革病毒包膜蛋白在内的II类包膜蛋白机制的更好 理解，以及鉴定这些蛋白内可被药物靶向的(druggable)区域将进一步开发能特异性抑制 黄病毒、α病毒和肝炎病毒的病毒感染的疗法。发明概述本发明提供了可与II类病毒E蛋白中的区域结合的肽进入抑制剂。抑制剂与所述区域的相互作用，或抑制剂对所述区域活性的调节可抑制病毒融合，由此抑制病毒感染。 一方面，本发明提供了化合物和筛选针对这些可结合区域的化合物的方法，以发现由含II 类蛋白的病毒引起疾病的治疗候选物。可筛选治疗候选物的疾病包括登革热、登革出血热、 蜱传脑炎、西尼罗河病毒疾病、黄热病和丙型肝炎。在一个实施方案中，鉴定由含II类E蛋白的病毒引起的疾病的治疗候选物的方法 包括使包含可结合区域的II类E蛋白与化合物接触，其中所述化合物的结合表明其为治疗 候选物。化合物可选自包括肽类的化合物。结合可在体外或体内测定。在某些实施方案中， 所述蛋白是登革病毒E蛋白。这些可结合区域同样可用于结构测定、药物筛选、药物设计和 本文中描述和要求的其他方法中。
此外，本发明提供了抑制登革病毒的病毒传染和/或登革病毒的病毒体包膜与靶 细胞膜之间结合(将病毒基因组递送至细胞质内的过程)的方法。本发明提供了采用肽类 或肽衍生物抑制登革病毒与细胞结合的方法。本发明提供了治疗由登革病毒诱导的疾病的 方法。在本发明的另一个实施方案中，肽进入抑制剂包括SEQ ID NO :1所示的氨基酸序 列。在本发明的又一个实施方案中，确定病毒抑制剂的方法包括使肽与病毒可结合区 域接触，以及确定该化合物与病毒可结合区域结合度的步骤，其中化合物的结合度衡量了 该化合物对病毒的活性。在本发明的又一个实施方案中，治疗登革病毒感染的方法包括施用治疗有效量肽 的步骤，其中所述肽具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。附图简述
图1显示了登革病毒的基因组结构；图2是DN81肽针对DENV-2的剂量响应抑制曲线示意图；图3是DN81肽错义序列针对DENV-2的剂量响应抑制曲线示意图；以及图4是DN81肽在不同浓度下细胞毒性测试示意图。发明详述本发明的一个实施方案涉及抑制登革感染的方法，包括抑制病毒体包膜与细胞膜 的融合，将病毒基因组递送到细胞质中的过程。根据本发明，可使用任何抑制登革病毒包膜与细胞膜融合的肽或蛋白(包括那些 感染人类以及非人类宿主的登革病毒)。在本发明不同的实施方案中，这些登革肽进入抑制 剂可包括但不限于与几种登革病毒蛋白膜相互作用可结合区域相关的肽类。登革病毒的 基因组结构如图1所示。术语“可结合区域”，当用于肽、核酸、复合物等时，是指登革病毒E蛋白或其他II 类E蛋白的区域，其是结合减少或抑制病毒感染性的试剂的靶标或可能的靶标。对于肽来 说，可结合区域通常指这样的区域其中肽的某几个氨基酸能够与登革病毒E蛋白的至少 部分相互作用。对于肽或其复合物来说，可结合区域包括结合口袋和位点，肽或复合物结构 域间的界面、肽或复合物的表面沟或轮廓或表面，其能够参与和另一个分子的相互作用，例 如细胞膜。在一个实施方案中，登革肽进入抑制剂是DN81，其具有SEQ IDNo. 1的序列RWMVffRHWFHRLRLPYNPGKNKQNQQffP。在本发明的另一个实施方案中，与登革肽进入抑制剂有关的肽类包括同源性肽。 本文中，术语“同源性登革肽进入抑制剂”应当理解为具有与登革病毒抑制蛋白和肽类相应 部分相同序列的肽，其中一个或更多个氨基酸被功能等价的氨基酸替换。该术语同样指这 些肽的衍生物，包括但不限于苄基化衍生物、糖基化衍生物，以及包括天然氨基酸对映体的 肽。在本发明的其他实施方案中，登革肽进入抑制剂、相关肽或衍生物与载体分子例 如蛋白连接。根据本发明的该实施方案，可使用的蛋白质包括但不限于人血清白蛋白。根 据本发明，包括附加氨基酸的登革肽进入抑制剂也是有用的。本发明的登革进入抑制肽可用于抑制登革病毒病毒体与细胞的融合，因此可用于 治疗哺乳动物的登革病毒感染。这些哺乳动物是患者，包括但不限于人类、狗、猫、鸟、马等。 本发明的肽可以任何无菌的生物相容性药用载体施用给患者，包括但不限于盐水、缓冲盐 水、葡萄糖和水。向患者施用肽的方法是本领域技术人员熟知的，其包括但不限于皮内、肌 内、腹膜内、静脉内、皮下、口服和鼻内。此外，需要通过任何适宜的途径、包括静脉内注射将 本发明的药物组合物引入中枢神经系统。其他实施方案预期了登革进入抑制肽或其衍生物 的施用，其与包括人血清白蛋白(HSA)的分子载体连接。许多技术可用于筛选、鉴定、选择和设计能缔合登革病毒E蛋白或其他II类E蛋 白、结构同源性分子和其他分子的化学实体。根据本文中所述方法测定的登革病毒E蛋白 或其他II类E蛋白的结构的知识使得可以设计和/或鉴定具有与登革病毒E蛋白或其他 II类E蛋白(或更具体而言，其可被药物靶向的(druggable)区域)的构象互补的形状的 分子和/或其他调节物。应当理解，此类技术和方法可另外地使用登革病毒E蛋白或其他 II类E蛋白及其结构等价物的确切结构坐标和其他信息。一方面，药物设计的方法通常包括计算性评价所选化合物与分子或复合物(例如 任何II类病毒E蛋白)缔合的潜能。例如，该方法可包括下列步骤使用计算工具在选择 的化合物和所述分子或复合物的可结合区域间拟合，以及分析拟合结果以量化所述化学实 体与可结合区域间的结合。另一方面，使用结合蒙特卡罗(Monte Carlo)结合算法的氨基酸一级序列和 Wimley-White界面疏水性标度确定作为靶向病毒E蛋白的DENV感染登革肽进入抑制剂的 候选物。本文中，术语“蒙特卡罗”通常是指任何合理的随机或准随机生成允许变量的值的 程序。蒙特卡罗方法的实例包括如下选择值(a)随机从允许值选取；(b)通过准随机序列 例如LDS(低偏差序列)选取；(c)随机但利用实验或理论的在先信息有偏向地选取；以及 (d)通过马尔可夫(Markov)序列从非平凡分布选取。更具体而言，“蒙特卡罗”方法是这样的一种技术它通过使用统计抽样技术获得问题的概率近似解决。一种蒙特卡罗方法是马尔可夫方法，即一系列的随机事件，其中每 一事件的发生概率取决于紧接的前一结果(参见Kalos，Μ. H.和Whitlock，P. Α. ‘‘ Monte CarloMethods =Volume I =Basics, “ John Wiley & Sons， New York,1986 ； VX R Frenkel, D.,禾口 Smit, B. " Understanding Molecular Simulation FromAlgorithms to Applications, :Academic Press, San Diego,1996)。
Wimley-White界面疏水性标度是通过基于热力学原则的亲水性图方法研究膜蛋 白拓朴学和其他特征的工具。材料和方法登革肽讲入抑制剂的制备肽可通过天然或重组病毒蛋白产生，或可使用标准重组DNA技术产生(例如通过含有在适当的转录启动子控制下的编码所需肽的重组核酸分子的微生物表达肽，以及从所 述微生物收集所需肽)。优选的，本发明的肽可使用本领域任何已知的方法合成，包括但不 限于 Merrifield 固相合成(Clark-Lewis 等，1986，Science 231 :134_139)。病毒和细胞DENV-I 菌株 HI-I、DENV-2 菌株 NG_2、DENV_3 菌株 H-78 和 DENV-4 菌株 H-42 获自 加尔维斯顿的得克萨斯大学(University ofTexas at Galveston)世界卫生组织虫媒病毒 参考实验室(World HealthOrganization Arbovirus Reference Laboratory)的 R. Tesh0 病毒在非洲绿猴肾上皮细胞系LLCMK-2中繁殖，该细胞系由科罗拉多州立大学K. Olsen惠 赠。LLCM K-2细胞在37°C，5% (v/v)CO2的条件下在Dulbecco' s改进的eagle培养基 (DMEM)中培养，所述培养基含有10% (ν/ν)胎牛血清(FBS)、2mM Glutamax、100U/ml青霉 素G、100 μ g/ml链霉素和0. 25 μ g/ml两性霉素B。集落形成单位(FFU)降低测定将LLCMK-2靶细胞以IxlO5细胞/孔的密度于感染前24小时接种于6孔板中。将 约200FFU的病毒与或不与化学物质在无血清DMEM中在室温下温育1小时。使用病毒/化 学物质或病毒/对照混合物在37°C感染靶细胞融合单层1小时，每15分钟振荡。随后向 培养基中通气，覆盖含 0. 85% (w/v) Sea-plaque 琼脂糖(Cambrex Bio Science, Rockland, ME)的新鲜DMEM/10% (v/v)FBS0将含琼脂覆层的细胞在4°C下孵育20分钟以固定琼脂。 感染的细胞随后在37°C下用5% CO2温育3天(DENV-1、3和4)或5天(DENV-2)。感染的 培养物在4°C下用10%福尔马林固定过夜，用70% (v/v)的乙醇透化20分钟，在免疫染色 前用PBS冲洗。使用来自小鼠抗DENV杂交瘤E60 (从华盛顿大学的M. Diamond处获得)的 上清，随后用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Pierce，Rockford, IL)检测 病毒集落，用AEC发色底物(Dako，Carpinteria，CA)显像。结果表示为至少两次独立试验 的平均值，每次试验重复3次。细胞毒性测试根据厂商的技术说明，使用TACS MTT细胞增殖测试(R&D系统，Inc.， Minneapolis, MN)监测线粒体还原酶活性测试化学物质的细胞毒性。在96孔板中 向LLCMK-2细胞的融合单层中加入化学物质的无血清DMEM稀释液，于37 °C保持1小 时。类似于集落形成抑制测试，随后在37°C用5% (v/v)C02孵育24小时。使用Tecan GeniosProplate reader (Tecan US, Durham, NC)测定 560nm 的吸光度。使用DN81进行机理分析DN81针对DENV-2的进入后集落形成测试为确定观察到的抑制效应是否与病毒生命周期中进入后步骤干扰有关，在37°C下 使约200FFU的无DN81的DENV-2结合并进入靶细胞1小时。如集落形成测试中所述。随 后用PBS冲洗，除去未结合的病毒，向进入后的细胞中加入DN81，在37°C保持1小时。再次用PBS洗涤培养物，琼脂糖覆盖，孵育，按集落形成测试中所述进行免疫检测。DN81针对DENV-2的结合前集落形成测Ii式为确定观察到的抑制效应是否源于靶细胞表面修饰引起的干扰，将DN 81与靶细 胞在4°C下孵育1小时。用PBS冲洗细胞，在4°C下用约200FFU DENV-2感染细胞。琼脂糖 覆盖，孵育，随后按集落形成测试中所述进行免疫检测。DN81针对DENV-2的结合后集落形成测Ii式
为确定观察到的抑制效应是否源于病毒体与靶细胞在结合前和结合后相互作用 的干扰，在4°C下用约200FFU DENV-2与靶LLCMK-2细胞结合1小时，以允许结合，但防止内 化。在4°C下用PBS洗去未结合的病毒，随后加入CF238，在4°C孵育1小时。再次于4°C下 用PBS洗涤培养物，温热至37°C。琼脂糖覆盖，孵育，随后按集落形成测试中所述进行免疫 检测。gRT-PCR病毒结合测试LLCMK-2靶细胞的感染在6孔板中进行，一式两份，使用IO5FFU的DENV-2，其预 先在4°C用CF 238或混合的异型抗DENV人血清孵育45分钟。在4°C下感染45分钟后， 用PBS洗涤感染的单层，用细胞刮棒收集，加入到含350 μ 1 AR-200硅油(Sigma-Aldrich， St. Louis, MO)和 150 μ 1 硅酮液(Thomas, Swedesboro, NJ)的混合物的 1. 5ml 微量离心管 中。在小型离心机中以14，OOOrpm离心1分钟，从细胞结合的病毒沉淀中分离未结合的病 毒。随后将离心管没入液氮中30秒，冷冻内含物。使用小型断线钳(wire clipper)剪下 管的底部置于15ml圆锥形管中，回收含结合病毒的细胞沉淀物。使用Qiagen病毒RNA提 取试剂盒(Qiagen，Chatsworth, CA)从细胞沉淀物中提取病毒RNA。按照厂商说明和扩增方案，提取的RNA用Quantitect Sybr GreenRT-PCR试剂盒 (Qiagen inc. , Chatsworth, CA)进行定量实时逆转录PCR(qRT-PCR)，使用登革特异性引物 (Den2F :catatgggtggaatctagtacg,Den2R :catatgggtggaatctagtacg)。每个反应总体禾只为 20μ L(10y L 2XSYBR green master mix，10 μ M 引物各 0. 5 μ L，0. 2 μ L逆转录酶和 5 μ L病 毒 RNA)，使用 Lightcycler 热循环仪(Roche Diagnostics, Carlsbad, CA)，按照下列扩增方 案进行50°C 20分钟逆转录RNA ；950C 15分钟激活HotStart Taq DNA聚合酶；45个PCR 循环94°C 15秒，50°C 15秒，72°C 30秒，最后一步也是荧光数据捕获步骤。通过将温度 缓慢增加至95°C (0. rc /s)进行熔解曲线分析，代表扩增产物荧光显著高于背景的循环数 的阈循环使用Lightcycler 5. 3. 2软件(Roche)计算。分析使用Origin 6. 0作图软件(Northampton, MA)生成图。统计学分析使用Graphpad Prism 4. 0软件包进行(San Diego, CA)。P值低于0. 05被认为是显著性的。结果不同化学物质针对DENV-2的抑制测试使用集落形成测试量化每种化学物质针对DENV-2的抑制活性，如先前所描述 (Hrobowski，等2005)。如图2所示，在化学物质在1 % DMSO/水溶液中溶解度规定的浓度 范围内产生剂量响应曲线。对照的1 % DMS0/PBS溶液在该测试系统中显示无DENV抑制活 性(数据未显示)。DN81肽显示抑制活性作为浓度的函数增加。如图3所示，10个AN肽的 错义序列没有显示针对抑制DENV-2的一致活性。
细胞毒件为确定观察到的DENV抑制效应是否源于影响病毒复制的细胞毒性，在显示病毒抑制的浓度范围内测定了化学物质对靶细胞的线粒体还原酶活性的影响。在重复集落形成 测试条件的融合细胞单层中，与仅含对照的培养基相比，未观察到任何化合物的毒性特征 (P > 0. 05,Dunnett' s posthoc检验的AN0VA)，如图4所示。因此，DN81肽的抑制活性并 非源于毒性。DN81针对DENV-2的结合前集落形成测Ii式在该测试中，将DN81加入到靶细胞中1小时后用DENV-2感染以确定DN81是否抑 制通过直接作用于靶细胞的进入。在DENV-2感染前用DN81处理靶细胞未导致任何抑制 迹象，表明DN81并非通过作用于或修饰靶细胞表面起作用，必须与病毒一起存在以抑制进 入。DN81针对DENV-2的aRT-PCR病毒结合测试为直接测定DN81是否干扰病毒与靶细胞的结合，进行结合测试，使用qRT-PCR监 测病毒对靶细胞的附着。在这些实验中，病毒与DN81在4°C共孵育45分钟，在4°C下感染 靶细胞45分钟。从培养板上刮下细胞，离心以通过具有允许细胞而非游离病毒穿过的密度 的油混合物至管底部。随后从细胞沉淀物中提取RNA，用DENV-2特异性引物扩增。qRT-PCR 信号测定显示，DENV-2和DN81的预孵育未抑制病毒结合，而DENV-2与混合的人异型抗 DENV-2血清的预孵育导致病毒对靶细胞附着的大量减少。这表明DN81不能在测试的实验 条件下防止病毒结合/附着靶细胞。基于上述公开的内容，显而易见，能与登革病毒E蛋白的区域结合的肽进入抑制 剂作为本文所述抗病毒化合物开发的潜在候选物的用途将实现上文所述的目的。因此，应 当理解，任何明显变化落于本发明范围内，以及特定组成元件的选择可在不偏离此处公开 和描述的本发明主旨情况下确定。
权利要求
肽进入抑制剂，其包括SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
2.权利要求1的肽进入抑制剂，其中所述肽进入抑制剂抑制II类包膜蛋白。
3.权利要求2的肽进入抑制剂，其中所述II类包膜蛋白是登革病毒E蛋白。
4.权利要求1的肽进入抑制剂，其中所述肽进入抑制剂抑制登革病毒病毒体与细胞的融合。
5.包含权利要求1的肽进入抑制剂的药物组合物。
6.权利要求5的药物组合物，其还包括生物相容性的载体。
7.权利要求6的药物组合物，其中所述生物相容性的载体选自盐水、缓冲盐水、葡萄糖 和水。
8.确定病毒抑制剂的方法，该方法包括下列步骤使肽与病毒可结合区域接触，以及 确定该化合物与病毒可结合区域结合度，其中化合物的结合度衡量了该化合物对病毒的抑 制活性。
9.权利要求8的方法，其中所述肽是II类包膜蛋白的肽进入抑制剂。
10.权利要求9的肽，其中所述II类包膜蛋白是登革病毒E蛋白。
11.权利要求8的方法，其中所述肽具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
12.治疗登革病毒感染的方法，其包括下列步骤施用治疗有效量的肽，其中所述肽具 有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。
13.权利要求12的方法，其中所述肽抑制登革病毒病毒体与细胞的融合。
14.权利要求12的方法，其中所述肽通过选自皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、口服 和鼻内的方式施用。
15.权利要求12的方法，其中所述肽与分子载体连接。
16.权利要求15的方法，其中所述分子载体是人血清白蛋白(HSA)。
17.权利要求14的方法，其中所述肽施用于哺乳动物。
全文摘要
本发明涉及肽进入抑制剂和确定这些能与具有II类E蛋白、例如登革病毒E蛋白的病毒的区域结合的抑制剂作为体内抗病毒化合物候选物的方法。
文档编号C07K14/005GK101801996SQ200880106480
公开日2010年8月11日 申请日期2008年7月11日 优先权日2007年7月13日
发明者E·延维蒂苏克, J·科斯丁, R·加里, R·萨穆德拉拉, S·F·迈克尔, S·伊塞尔恩 申请人:佛罗里达州墨西哥湾海岸大学