本发明关于一种山竹组合物以及其用于制备增进阿尔茨海默症患者学习能力与记忆的药物的用途。
背景技术：
：老年失智症是所有神经退化性疾病中为数最多的一种，其实为各种相似的神经退化性疾病的总称，其中发生率最高的疾病就是阿尔茨海默症(alzheimer’sdisease)。目前全球约有2,400万名阿尔茨海默症患者，且随着老化人口增加，每年约增加460万病例，世界卫生组织(who)预估到2040年将增至8,000万人。阿尔茨海默症是一种发病进程缓慢、随着时间不断恶化的持续性神经功能障碍。最常见的早期症状，是丧失短期记忆力。而之后随着疾病的发展，症状可能会包含：谵妄、易怒、具攻击性、无法正常言语、容易迷路、情绪不稳定、丧失生存动力、丧失长期记忆、难以自理和行为异常等。虽然疾病的进程因人而异，很难预测患者的预后，但一般而言，确定诊断后的平均余命是三到九年。阿尔茨海默症的成因至今仍未完全的明了，目前已知的阿尔茨海默症患者的脑部中的神经元细胞会出现斑块(plaques)和神经纤维纠结(neurofibrillarytangles，简称nfts)的现象，以及脑部中的meynert氏基底核(nucleusbasalisofmeynert)部退化，且神经传导物质乙酰胆碱(acetylcholine)减少。所谓神经纤维纠结(nfts)，是指在脑部病理解剖发现纠结的神经，其细胞型态严重变形，并且堆栈成团。目前已知神经纤维纠结的病征应与tau蛋白过磷酸化有关，其造成tau蛋白的聚集，对细胞产生毒性，因而间接或直接造成神经细胞的损伤。技术实现要素：鉴于上述缺失，本发明的目的在于提供一种组合物，以及其用于制备抑制阿尔茨海默症进程的药物的用途，特别是提供一种山竹与西洋参的组合物，并利用其制备用于在活体中抑制阿尔茨海默症进程的药物的用途，因而有效增进活体的学习及记忆力。为达成上述目的，本发明提供一种山竹组合物，其包含山竹以及西洋参，其中山竹与西洋参的净重比可为4：1至1：16，且该山竹为每公斤体重使用40至320mg，该西洋参为每公斤体重使用80至640mg。优选地，山竹可取自新鲜山竹、山竹干、山竹粉末、冷冻山竹、或其任意组合。优选地，西洋参可取自新鲜西洋参、西洋参干、西洋参粉末、冷冻西洋参、或其任意组合。优选地，山竹可为水萃取物、油萃取物、极性溶剂萃取物、非极性溶剂萃取物或其组合。优选地，西洋参可为水萃取物、油萃取物、极性溶剂萃取物、非极性溶剂萃取物或其组合。优选地，山竹组合物可为粉末状、锭状或液体状。为达成上述目的，本发明另提供一种山竹组合物用于制备增进阿尔茨海默症学习与记忆能力的药物的用途，其中组合物包含山竹及西洋参。优选地，山竹与西洋参的净重比可为4：1至1：16，且该山竹每公斤体重使用可为4.5至35mg，该西洋参每公斤体重使用可为9至70mg。承上述，山竹组合物可增加神经细胞的突起长度以及增加神经细胞存活率。优选地，药物的给药方式可包含口服、肌内注射、皮下注射或脑 部给药。根据本发明提出的组合物用于制备增进阿尔茨海默症患者的学习与记忆的药物的用途，其组合物利用山竹与西洋参的结合，可具有下列优点：(1)根据本发明的山竹组合物，利用山竹与西洋参的合并使用，相较于仅使用山竹或仅使用西洋参，均可降低阿尔茨海默症状态的神经细胞的死亡率且增加神经突起的长度。(2)根据本发明的山竹组合物，相较于仅使用山竹或仅使用西洋参，可大幅增加受试者的短期记忆以及提升受试者的长期记忆。(3)根据本发明的山竹组合物，利用山竹与西洋参的合并使用，相较于仅使用山竹或仅使用西洋参，均可显著提升受试者的学习能力。附图说明图1a及图1b显示体外培养小鼠海马回初级神经细胞，分别以山竹及/或西洋参处理的结果。图1a显示相对neun蛋白表现量，可用以判断细胞存活率。图1b则显示经处理后小鼠海马回初级神经细胞的神经突起长度结果。*表示与控制组比较；#表示与控制组或经wt/gfx的处理组别比较；&表示各与两倍单一成分比较(#及&，p<0.05；**,##及&&，p<0.01；###及&&&，p<0.001)。图2a及图2b显示动物实验的流程与y迷宫实验结果。图2a显示动物实验的时序图。图2b则显示小鼠偶发性改变率结果。*表示与控制组(食盐水/食盐水)比较；#表示与stz组(stz/食盐水)比较(*及#，p<0.05；###，p<0.001)。图3a至图3d显示莫瑞氏水迷宫的分析结果。图3a为注射后第6天的小鼠游泳速度分析。图3b显示为期4天训练期的学习曲线：正常小鼠(●，f(3,39)＝5.754；p＝0.003)；经注射链佐霉素至脑内的小鼠(○，f(3,39)＝1.478；p＝0.237)；单独给予西洋参的小 鼠(△，f(3,43)＝4.716；p＝0.007)或单独给予山竹的小鼠(▼，f(3,31)＝6.619；p＝0.002)、或是合并使用山竹与西洋参组合物的小鼠(■，f(3,31)＝7.090；p＝0.001)。图3c则显示注射后第6天的分析结果。图3d显示注射第7天后小鼠穿越平台象限的次数结果。*表示与控制组(食盐水/食盐水)比较；#表示与stz组(stz/食盐水)相比(*及#，p<0.05；##，p<0.01；###，p<0.001)。具体实施方式本发明将通过下列优选实施例及参照附图，作进一步的详细说明。需注意的是，以下各实施例所揭示的实验数据，为便于解释本案技术特征，并非用以限制其可实施的态样。定义术语“大约”或“大概”，当结合可测量的数值变量使用时，指变量的指示值以及在指示值的实验误差内(例如，平均值的95％信赖区间(confidenceinterval))或在指示值的10％内的变量的所有值，从中取最大值。“给药”指物质对受试者的引入，如山竹与西洋参组合物通过至少包含经口、非经口(例如：皮下、肌内、经皮、皮内、腹膜内、眼内及静脉内注射)的给药方式予以受试者。“受试者”指需要或被认为潜在需要本发明的组合物的任何哺乳动物，其包含灵长类、啮齿类、宠物、实验室试验动物、眷养野生动物。举例来说，此可包含，但不限于：猴子、人类、猪只、牛、绵羊、山羊、马科动物、小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠、兔子、猫(felines)、犬(canines)。优选地，受试者为小鼠或人类。“赋形剂”指山竹组合物中非山竹与西洋参组成的有效成分的任何成分。材料与方法实验动物小鼠：c57bl/6j品系，8周大的怀孕母鼠与公鼠(国家实验动物中心，台湾)。小鼠房的环境温度为20–25℃，相对湿度为60％，日夜周期为12小时。所有实验均于早上7点到下午7点进行。所有实验过程均完全依照国立台湾师范大学实验动物照护及使用委员小组的规定进行。小鼠海马回初级神经元培养及药物处理修正前人研究(seibenhenerandwooten,2012)而建立小鼠海马回初级神经元培养的方法：将c57bl/6j品系的怀孕母鼠予以断颈后取出16-18天大的胚胎，将其海马回组织取出后于37℃下使用0.05％的胰蛋白酶(trypsin)消化分解15分钟。在涂有poly-l-lysine(100μg/ml)的24孔或6孔盘培养皿的每个孔种入3×104个细胞；培养液的成分：neurobasal(gibcotm；thermofisherscientific，usa)，另添加补充2％的添加剂(gibcotm；thermofisherscientific，usa)、0.5mm的麸酰胺(glutamine)(gibcotm；thermofisherscientific，usa)、25μm的麸胺酸盐(sigma-aldrich，usa)、20单元/ml的青霉素/链霉素(gibcotm；thermofisherscientific，usa)、1mm的hepes(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid))(sigma-aldrich)、以及1％的热去活马血清(donorhorseserum,heatinactivated,(gibcotm；thermofisherscientific，usa))。初级小鼠海马回神经元均培养于37℃、co2浓度5％的培养箱内。在培养第1、4及7天时，更新一半的培养液(不含马血清)。另为了减少星型胶细胞数量而使神经元的纯度有所增加，于培养第4天及第7天时加入2μm的胞嘧啶阿拉伯醣(cytosinearabinoside；sigma-aldrich)。于培养第9天时，细胞同时接受不同剂量的山竹、西洋参，以及10nm的wortmannin(wt)/gf-109203x(gfx)(下文简称为wt/gfx)或dmso，另培养1小时。免疫荧光染色分析小鼠海马回初级神经元经培养后，经过10nm的wt/gfx或其溶剂dmso处理1小时后，将细胞用4％的三聚甲醛(paraformaldehyde)(sigma-aldrich)固定30分钟，之后用pbst洗涤三次，每次10分钟以去除残余的三聚甲醛。接着使用10％的胎牛血清(fbs)破坏其非专一性反应2小时后，加入neun蛋白质(1：1000；millipore，usa)与map2蛋白质(1：1000；millipore，usa)的一抗于4℃反应16小时，接着将二抗于37℃反应2小时。最后透过4',6-二胺基-2-苯基吲哚(4′,6-diamino-2-phenylindole，dapi；sigma-aldrich，usa)将神经元细胞核染色后，使用高通量显微影像分析系统与分析软件(moleculardevices，usa)来分析神经元与神经突起长度等数值。山竹组合物制备发明人分别将山竹全果以及西洋参，冷冻干燥处理之后，脱去水分并研磨至粉末状。山竹(garciniamangostana)可取自于，例如但不限于，新鲜山竹、山竹干、山竹粉末、冷冻山竹、或其组合。优选地，本发明的山竹取自新鲜山竹。西洋参(panaxquinquefoliusl.)可取自于，例如但不限于：新鲜西洋参、西洋参干、西洋参粉末、冷冻西洋参、或其组合。优选地，本发明的西洋参来自新鲜西洋参。接着将粉末状的山竹以及西洋参以4：1至1：16的净重比例混合，优选地，以1：2的净重比混合。另一方面，本发明的山竹组合物可进一步包含山竹萃取物以及西洋参萃取物。山竹萃取物及西洋参萃取物可通过所属
技术领域：
具熟知的萃取方法而得。萃取方法可为，举例但不限于，水蒸馏法、非极性溶剂萃取、极性溶剂萃取或二氧化碳萃取。非极性溶剂萃取利用非极性溶剂例如石油醚、甲苯等；极性溶剂萃取利用乙醇、丙醇等。本发明的山竹萃取物与西洋参萃取物利用水萃取法取得，以避免对人体有害的溶剂残留，然本发明并不限于此。此外，山竹萃取物与西洋参萃 取物的净重比可为4：1至1：16，优选地可为1：2。活体实验及药物处理经由立体定位方式注射3μl(3mg/kg)的链佐霉素(streptozotocin，stz，其为一种破坏胰岛β细胞，并会造成胰岛素抗性的药物)进入小鼠侧脑室，以建立偶发型阿尔茨海默症(sporadicalzheimer’sdisease)的非基因转殖动物模式系统(non-transgenicmousemodel，icv-stz)。具有阿尔茨海默症的小鼠共分五组，每组16只，分别以山竹及/或西洋参处理具阿尔茨海默症的小鼠并观察其结果。持续给予四周后进行一系列行为评估，最后牺牲小鼠进行病理分析。其五组分别如下表1：表1组别侧脑室注射(icv)管喂(每天一次)1(控制组)食盐水食盐水2stz食盐水3stz山竹(40mg/kg)4stz西洋参(80mg/kg)5stz山竹(40mg/kg)加西洋参(80mg/kg)行为评估：y迷宫活动力测试利用白色压克力制成的三臂(长35公分、宽5公分与高20公分)y迷宫行为工具模块，利用小鼠生性喜欢探索新环境的特性，测量小鼠的短期空间记忆。将小鼠放在y迷宫三臂的中间，而后给予小鼠自由探索时间计时8分钟，小鼠的四肢要完全踏进入三臂其中一臂才能计算一次。计算方式：小鼠偶发性改变率＝无重复进入三臂的次数*100/(总共进入各臂的次数-2)。行为评估：水迷宫记忆测试莫瑞式(mwn)水迷宫测试指在广大的水池某处放置一平台，来针对小鼠的空间学习与记忆的能力的测试方法。小鼠厌恶处于水中的状态，同时游泳对于老鼠来说十分消耗体力，因此小鼠会本能地寻找水中可以休息的场所(平台)。寻找平台的行为涉及到大脑复杂的记忆过程，其包括(1)收集与空间定位有关的视觉讯息(如四方形、 圆形与三角形等形状信息)，以及(2)对这些讯息进行处理、整理、记忆、稳固以及回忆记忆的功能。将小鼠置于充满乳白色无毒广告颜料(为使水不透光而遮掩平台，让小鼠无法事先知悉平台的位置)的水池，让其探索位于水面下的平台(固定在某一象限内)。本训练区分几种阶段：1.探索阶段：其将小鼠置于水中历时1分钟，若小鼠无法在时间之内找到平台，则抓取小鼠使其站立于平台上20秒，再将小鼠置于干燥处休息以待下次实验。2.验收阶段：将小鼠由四个特定的位置分次放入水迷宫，以试验其是否能顺利找到平台。每天训练四次，持续四天，(每只老鼠均有16次训练)。四天训练完后进行测量小鼠获得的学习能力：与训练间隔24小时后，将平台移走，此次让小鼠在游泳池内自由游泳1分钟测量小鼠是否还记得平台所在的位置(长期空间记忆测试)。游泳路径透过ccd摄影后再经由影像追踪系统(ethovision-xt)进行分析。统计所有数据使用spss15.0版本进行单因子变异数分析与事后比较检定(lsd)。实施例为了评估山竹(garciniamangostana)与西洋参(panaxquinquefoliusl.)的组合效果是否对缓解阿尔茨海默氏症具有功效，我们以活体细胞与动物作体外及体内检测。体外(invitro)实验经wt/gfx处理的拟阿尔茨海默症细胞为了了解山竹与西洋参在阿尔茨海默症神经细胞中的功效，首先利用神经母细胞瘤细胞株sh-sy5y测得山竹(gm)与西洋参(pq)的细胞半致死剂量(ic50)分别为10.0mg/ml及20.0mg/ml。体外培养小鼠海马回初级神经细胞，并在培养第9天时以wt/gfx处理，使得tau蛋白过度磷酸化，进而可使细胞模拟处在阿尔茨海默症的状 态。接着给予培养的细胞1/2000至1/250的细胞半致死剂量(ic50剂量)亦即5至40μg/ml)的山竹(gm)、或/以及1/2000-1/250的细胞半致死剂量(ic50剂量)亦即10至80μg/ml的西洋参(pq)。发明人将各ic50剂量的山竹与西洋参排列组合施用于体外培养的小鼠海马回初级神经细胞做测试，发现不论何种比例，只要将山竹与西洋参并用，便具有比起单独使用要佳的效果。山竹与西洋参的比例可为，但不限于，4：1(40μg/ml：10μg/ml)、1：1(40μg/ml：40μg/ml)、2：1(40μg/ml：20μg/ml)、1：1(10μg/ml：10μg/ml)以及1：2等。在众多比例的组合中，发明人进一步将山竹与西洋参以1比2的比值，对小鼠海马回初级神经细胞测试，其剂量如表2所示：表2、体外实验的山竹(gm)与西洋参(pq)施用浓度ic50剂量山竹(gm)西洋参(pq)山竹(gm)+西洋参(pq)1/20005μg/ml10μg/ml5μg/ml+10μg/ml1/100010μg/ml20μg/ml10μg/ml+20μg/ml1/50020μg/ml40μg/ml20μg/ml+40μg/ml1/25040μg/ml80μg/ml40μg/ml+80μg/ml结果请参阅图1a及图1b，从图1a的相对neun蛋白表现细胞的数量结果可看出，不论是添加1/2000、1/1000、1/500或是1/250的山竹或西洋参的ic50剂量，神经细胞的存活率均增加。此外，将山竹与西洋参合并(gm+pq)使用之后，可得到更佳的增进细胞存活率的效果(#及&，p<0.05；**,##及&&，p<0.01；###及&&&，p<0.001)。另外，图1b，其显示经处理后小鼠海马回初级神经细胞的神经元长度结果。从其结果看出，单独施以山竹或西洋参、以及山竹与西洋参合并使用之后，均可提升神经突起长度，且合并使用的效果较单独施用的效果为佳。由此可知，本发明提出山竹与西洋参两者对于修复阿尔茨海默症细胞的加乘效果。体内(invivo)实验根据上述体外实验，发明人已初步得出将山竹与西洋参合并使用于阿尔茨海默症细胞培养基中可改善其神经元修复状况，因而发明人欲进一步将其施用于小鼠活体中，以测试是否本发明提出的组合物可改善阿尔茨海默症的学习能力及记忆。请参阅图2a及图2b，其为动物实验的流程与y迷宫实验结果。图2a为动物实验的时序图，发明人将购自动物中心的c57b/6品系(b6)小鼠于实验环境适应6天后，在第7天将链佐霉素(stz)注射至小鼠单侧(左)侧脑室中以建立偶发型阿尔茨海默氏症动物模式(注射食盐水以作为控制组)。接着每天以管喂方式给予每公斤小鼠净重40mg(无水)的山竹(gm，40mg/kg)、每公斤小鼠净重80mg的西洋参(pq，80mg/kg)、山竹(gm，40mg/kg)结合西洋参(pq，80mg/kg)共4周。如此直到第26天进行y字迷宫分析，第28-34天进行莫瑞氏水迷宫(mwm)分析，第35天将小鼠牺牲以观察病理现象。继续参阅图2b，从图2b的小鼠偶发性改变率结果可看出，当链佐霉素注射至小鼠脑内所建立的偶发型阿尔茨海默氏症，会造成小鼠的短期记忆损伤，然而当给予山竹及/或西洋参可恢复小鼠的短期记忆，且特别是当山竹与西洋参合并施用后，可显著恢复小鼠的短期记忆。接着进行莫瑞式水迷宫实验。将经处理的小鼠置于充满乳白色无毒广告颜料(为以使水不透光而遮掩平台，让小鼠无法事先知悉平台的位置)的水池中，让其探索位于水面下的平台(固定在某一象限内)。图3a至图3d显示莫瑞氏水迷宫(mwm)的分析结果。图3a为小鼠游泳速度分析，这表示不同组别小鼠在水迷宫的游泳速度相当，无先天体力的差别。图3b为4天训练期(trainingtrial)的学习曲线，从其可看出，正常小鼠注射食盐水到脑中，不会影响其学习能力，呈 现有效的学习曲线(●)；当注射链佐霉素(stz)至小鼠脑中，使其学习能力下降，无法呈现有效的学习曲线(○)；当单独使用西洋参(△)或山竹(▼)给予小鼠、以及合并使用西洋参与山竹(山竹，均可恢复有效的学习曲线。接着，经过训练期后，在第6天对小鼠进行长期记忆的验收，可看到与正常小鼠(注射食盐水)相比较，注射链佐霉素至小鼠脑内会显著地伤害长期记忆，而山竹与西洋参同时施用则可增加其停留在平台所在的象限内的时间(图3d)。这意味着，透过合并使用山竹与西洋参，可恢复小鼠因阿尔茨海默症损伤的长期记忆力。发明人另以特定范围的山竹以及西洋参，以各种重量的比例组合，同样以管喂方式施予小鼠，实验的山竹量为小鼠的每公斤体重使用40至320mg，西洋参量为小鼠的每公斤体重使用80至640mg。详细组合如下列表3所示，将山竹及/或西洋参管喂方式给予小鼠共4周，重复如上述的记忆及学习能力测试。结果均发现，将山竹与西洋参合并使用于呈现阿尔茨海默症病症的小鼠，均可部分恢复小鼠损伤的记忆能力。详细实验流程请参阅上述，于此不再赘述。表3、本发明实施例所施用的山竹与西洋参的重量本发明提出的山竹组合物，如若于人体施用时，须根据基础代谢率的差异，换算成适合人体施用的重量。故而本发明的山竹组合物中，将原施以小鼠的重量均除以9，为适于人体的使用量。人的每公斤体重使用山竹4.4至35.5mg；西洋参则是人的每公斤体重使用8.9至71mg。承上所述，本发明提供的山竹组合物，其透过山竹与西洋参的组合，经过体外及活体测试，均可有效降低阿尔茨海默症状态的神经细胞的死亡率且增加神经突起的长度、亦可大幅增加受试者的短期记忆以及提升受试者的长期记忆以及显著提升受试者的学习能力。综上所述，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属
技术领域：
中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当以申请专利范围所界定为准。当前第1页12