本发明属于化学制药技术领域，具体涉及一种高纯度氨甲环酸注射剂及其制备方法以及在心脏外科手术体外循环围术期适应症的应用。
背景技术：
术后出血是体外循环心脏外科手术最常见的并发症之一，约有20％的病例术后出血显著，需要大量应用血制品，5％的病例需要二次开胸止血。大量出血是心脏外科手术后并发症发生的独立风险因素，可延长机械通气时间，导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、败血症和房性心律失常，增加胸骨感染的比率、输血相关并发症和手术死亡率。
心脏外科手术后出血不仅增加了患者的围术期并发症和死亡率，更进一步消耗了有限的医疗资源，文献报道，心脏手术病人占所有手术病人的15～20％，然而却消耗了超过80％的血液制品。
瓣膜性心脏病及冠状动脉粥样硬化性心脏病患者病情较重，手术时间较长，易发生大量出血和输血，临床围术期迫切需要采用有效药物减少出血和输血。氨甲环酸适用于心血管外科围术期的止血。氨甲环酸的临床使用，可以明显减少输血用量。随着使用剂量的加大，输血量成比例下降。
氨甲环酸的不良反应，包括头痛、头晕、恶心、呕吐等，但是对于肝肾脑心脏等重要脏器的影响尚不清晰，无大剂量临床试验随访其长期预后和死亡率，缺乏权威性的安全数据。随着氨甲环酸的常规应用，关于其安全性和给药剂量的问题越来越突出。虽然Meta分析显示，死亡率、术后心肌梗死、神经系统事件如中风的发生率并未升高，但该分析是基于一些小样本量研究，首要指标也不是安全性，研究中所用的氨甲环酸剂量范围很宽。研究发现，高剂量氨甲环酸(＞80mg/kg)可使术后惊厥的发生率增加。最近的一篇纳入1万余例患者的回顾性研究发现，使用氨甲环酸是术后发生惊厥的强烈的独立预测因子(OR 14.3，95％CI 5.5-36.7；p＜0.001)。除神经毒性外，仍需进一步的研究明确氨甲环酸用于心脏手术的安全性，特别是能否增加各类栓塞事件的发生率。
目前关于副作用的观察集中在神经毒性方面，氨甲环酸对感染、肾功能衰竭、围术期 心肌梗死和中风等并发症的发生率是否存在影响，特别是大剂量使用氨甲环酸的安全性需要进一步明确(陆海松，不同剂量氨甲环酸在体外循环心脏手术应用效果，中国分子心脏病学杂志，2015，15(02)，p1295-1297)。而且，根据文献报道，部分患者在使用氨甲环酸后观察到了血栓的形成，形成的时间有的为6～15天，个别患者甚至发生在给药后2个月。发生这类不良反应时间长，症状不明显，不易被患者和医务人员及时发现。一旦不良反应发生后，对部分患者器官造成不可逆性损害，通过对症治疗，并不能完全恢复(串俊兰等，氨甲环酸致不良反应个例报道文献分析，中国药师，2013年16(3)，p456～458)。
目前，氨甲环酸注射制剂，其临床使用方法为静脉注射或滴注：一次0.25～0.5g，一日0.75～2g。静脉注射液以25％葡萄糖液稀释，静脉滴注液以5％～10％葡萄糖液稀释。目前，市场中其产品质量一般仅控制顺式-对氨甲基环己烷甲酸不高于0.2％，4-氨甲基-1-环己烯甲酸不高于0.1％，对氨甲基苯甲酸含量不高于0.1％，总杂质不高于0.5％，全球上市的制剂基本上也只能达到这个质量水平，包括欧洲及日本的上市的氨甲环酸制剂，最高标准也就是杂质A反式-4，4-(二亚甲基)二(环烷酸)不高于0.1％，杂质B顺式-对氨甲基环己烷甲酸不高于0.2％，总杂质不高于0.5％。但氨甲环酸注射制剂应用于体外循环心脏外科手术围术期适应症时，常常采用负荷量30mg/kg加维持量20mg/kg/h的方式给予，需要连续不断的给药，有时临床中给药量更高，总剂量会达到10g，甚至20g以上。单个杂质即使按0.1％计算，每次临床应用时，进入体内的杂质也高达10mg～20mg，存在重大安全隐患，也是导致临床不良反应发生的重要原因。
在氨甲环酸已知的杂质中，4-氨甲基-1-环己烯甲酸大鼠(口服)LD50：＞15mg/kg，大鼠(静脉)LD50：1,800mg/kg，小鼠(口服)LD50：＞15mg/kg小鼠(静脉)LD50：1,600mg/kg。中国专利CN100579511C同样显示4-氨甲基-1-环己烯甲酸及顺式-对氨甲基环己烷甲酸具有较大安全性问题。因此，临床急需开发一种高纯度低杂质的氨甲环酸注射剂。
但根据中国专利CN100579511C即使控制注射用水的电导率，也不能较大幅度地降低氨甲环酸注射制剂中杂质并使其达到理想的水平，当大剂量临床应用时，其单个杂质和总杂质仍无法满足临床需求，存在严重用药安全隐患。具体而言，按照中国专利CN100579511C中提到的，将注射用水电导率更严格地控制在20℃时不超过0.6μS.cm-1，可使相关杂质控制在0.1％。但在后续生产中，发现了输液制剂中，虽然采用同一批次原料，对所用注射用水的电导率加以控制，但制得成品制剂所含量杂质量仍有不相同，有些批次成品的杂质更接近于原料杂质限度，而有些批次成品杂质含量较高，换句话说，即使使用纯度极高的氨甲环酸原料，也不能保证稳定的生产出相应的更高纯度氨甲环酸制剂，在其 制剂生产过程中，成品中的杂质仍会升高。按上述方法生产的制剂已是最严格的控制标准，穷尽任何手段，也不能再提高制剂纯度，且杂质变化极其不稳定，根本无法满足临床中大剂量应用本品的需求。截止目前，全世界仍没有被药监当局批准可供工业化生产和商业化应用的高纯度注射制剂上市。而实际临床中，由于不得已大剂量应用较低纯度的氨甲环酸注射剂时，往往发生一些不可控的不良反应，比如各类栓塞，术后惊厥等，从而严重限制了氨甲环酸在体外循环心脏外科手术围术期等大剂量的应用，导致病人不必要的输血增加，治疗负担加重，治疗风险增高。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术的缺陷，本申请的发明人经过努力研究，出人意料地发现，除去电导率外，水的总有机碳(total organic carbon，简称为：TOC)居然是影响氨甲环酸杂质变化的重要指标，尤其在氨甲环酸注射剂产业化生产时。
因此，本发明的一个目的在于，提供一种氨甲环酸注射剂，该注射剂的纯度更高。
本发明的另一个目的在于，提供一种上述氨甲环酸注射剂的制备方法。
本发明的又一个目的在于，提供一种上述氨甲环酸注射剂的用途。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一方面，本发明提供一种氨甲环酸注射剂，该注射剂中的杂质A：反式-4，4-(二亚甲基)二(环烷酸)的含量不高于0.05％，杂质B：顺式-对氨甲基环己烷甲酸的含量不高于0.05％，杂质C：4-氨甲基-1-环己烯甲酸的含量不高于0.05％，杂质D：对氨甲基苯甲酸的含量不高于0.05％，其他任何一个单杂含量均不高于0.05％，总杂质不高于0.25％。
优选地，所述注射剂以氨甲环酸作为活性组分，使用含总有机碳在0.4mg/L以下的注射用水来配制。
优选地，所述注射剂以氨甲环酸作为活性组分，使用含总有机碳在0.35mg/L以下的注射用水来配制。
优选地，上述注射剂中，所述注射用水的电导率在20℃时不超过0.6μS.cm-1。
优选地，所述注射剂包括活性成分氨甲环酸、除必要时加入的pH值调节剂外无其他辅料以及含总有机碳在0.4mg/L以下，优选在0.35mg/L以下的注射用水。
优选地，所述注射剂包括活性成分氨甲环酸、药学上可接受的辅料以及含总有机碳在0.4mg/L以下，优选在0.35mg/L以下的注射用水。
优选地，上述注射剂中可加入调节等渗的药学上可接受的辅料选自氯化钠、依地酸二 钠、甘露醇中的一种或多种。
优选地，所述注射剂包括氨甲环酸、氯化钠以及含总有机碳在0.4mg/L以下的注射用水。
优选地，所述注射剂包括氨甲环酸、氯化钠以及含总有机碳在0.35mg/L以下的注射用水。
优选地，所述注射剂包括：5-10重量份的氨甲环酸、7-9重量份氯化钠以及1000重量份的含总有机碳在0.4mg/L以下的注射用水。
优选地，所述注射剂包括：5-10重量份的氨甲环酸、7-9重量份氯化钠以及1000重量份的含总有机碳在0.35mg/L以下的注射用水。
在一个具体实施方案中，所述注射剂的配方如下：
10g的氨甲环酸；
7g氯化钠；以及
1000mL的含总有机碳在0.35mg/L或0.4mg/L以下的注射用水。
在另一优选的实施方案中，所述注射剂的配方如下：
5g氨甲环酸；
8.5g氯化钠；以及
1000mL的含总有机碳在0.35mg/L或0.4mg/L以下的注射用水。
优选地，所述注射剂包括氨甲环酸、依地酸二钠以及含总有机碳在0.4mg/L以下的注射用水。
优选地，所述注射剂包括氨甲环酸、依地酸二钠以及含总有机碳在0.35mg/L以下的注射用水。
优选地，所述注射剂包括：90-110重量份的氨甲环酸、0.01-0.05重量份依地酸二钠以及1000重量份的含总有机碳在0.4mg/L以下的注射用水。
优选地，所述注射剂包括：90-110重量份的氨甲环酸、0.01-0.05重量份依地酸二钠以及1000重量份的含总有机碳在0.35mg/L以下的注射用水。
在一个具体实施方案中，所述注射剂的配方如下：
100g氨甲环酸；
0.01g依地酸二钠；以及
1000mL的含总有机碳在0.35mg/L或0.4mg/L以下的注射用水。
优选地，所述注射剂包括氨甲环酸、甘露醇以及含总有机碳在0.4mg/L以下的注射用 水。
优选地，所述注射剂包括氨甲环酸、甘露醇以及含总有机碳在0.35mg/L以下的注射用水。
优选地，所述注射剂包括：200-300重量份的氨甲环酸、450-550重量份甘露醇以及1000重量份的含总有机碳在0.4mg/L以下的注射用水。
优选地，所述注射剂包括：200-300重量份的氨甲环酸、450-550重量份甘露醇以及1000重量份的含总有机碳在0.35mg/L以下的注射用水。
在一个具体实施方案中，所述注射剂的配方如下：
250g氨甲环酸；
500g甘露醇；以及
1000mL的含总有机碳在0.35mg/L或0.4mg/L以下的注射用水。
另一方面，本发明提供一种上述氨甲环酸注射剂的制备方法，该制备方法包括使用含总有机碳在0.4mg/L以下或0.35mg/L以下的注射用水来配制所述氨甲环酸注射剂。
优选地，所述注射用水的电导率在20℃时不超过0.6μS.cm-1。
又一方面，本发明提供一种减少以氨甲环酸作为活性成分的注射剂中杂质的方法，该方法包括：以氨甲环酸作为活性组分，含总有机碳在0.4mg/L以下或0.35mg/L以下的注射用水来配制所述注射剂。
优选地，在所述方法中，使用含总有机碳在0.4mg/L以下的注射用水制成小容量注射剂或冻干粉针，或使用含总有机碳在0.35mg/L以下的注射用水制成大容量注射剂。
优选地，所述注射用水的电导率在20℃时不超过0.6μS.cm-1。
再一方面，本发明提供上述氨甲环酸注射剂用于制备体外循环心脏外科手术围术期中止血的药物中的用途。
以下将对本发明进行详细描述。
本发明提供一种氨甲环酸注射剂，该注射剂使用含总有机碳在0.4mg/L以下或者0.35mg/L以下的注射用水来配制。
众多研究已表明，水中种类繁多的有机物绝大部分是对人体有害的，有些甚至是致突变和致癌物。目前，我国有机污染物的排放是造成河流、湖泊污染的主要原因，从而也导致我国医药用水的安全隐患。目前，有机物已发现有几百万种，但是要对它们进行区分和定量还存在一定的困难，总有机碳就是一个常用的有机物污染综合指标。总有机碳指的是水中存在的溶解性和悬浮性有机碳的含量。纯水中存在无机碳(IC)和有机碳(TOC)两 种形式的总碳(TC)，TOC包含非挥发性有机碳(NPOC)和挥发性有机碳(POC)。国内外对注射用水的控制不尽相同，大部分控制TOC时，要求不高于0.5mg/L。近年来，我国已慢慢开始重视了医药用水中TOC控制，但并未阐明其对成品制剂的影响，而在氨甲环酸注射制剂生产过程中，本申请的发明人出人意料地发现，将注射用水中总有机碳控制在0.4mg/L以下制成小容量注射剂或冻干粉针，或注射用水中总有机碳控制在0.35mg/L以下制成大容量注射剂，其成品的杂质含量降低50％左右，其效果远远超乎想象。同时，还发现，控制注射用水中TOC后，成品的不溶性微粒居然也大幅度下降。
在实际生产中，可以采用多种手段方法控制制剂生产过程中注射用水的TOC，现举例一种降低注射用水的TOC的方法，但是并不限于所述的水预处理方法。
举例如下：本发明可以通过如下水预处理方法，原水箱--沙滤--碳滤--一级反渗透--中间水箱--二级反渗透--纳滤(膜的孔径范围在纳米级(0.1nm～2nm))--注射用水箱。为得到注射用水TOC在0.4mg/L以下，必要时，可增加纳滤次数(2～3次)，使注射用水中TOC更低。
通过对由不同水质配制的氨甲环酸输液剂的对比研究发现，水中TOC越高，其制剂中杂质增加就越多，而且是随着时间的延长，增加的越明显。
正是发现了输液制剂中，由于对所用注射用水的TOC加以控制，结果使得制剂中杂质总量由原来的0.5％左右降至0.25％左右，各个杂质均可控制在0.05％以下，有效控制了产品质量，连续产业化几十批，批批稳定，本发明人又继续对氨甲环酸注射剂及冻干粉针剂(包括自制与市售样品)进行了相应的制备及质量研究。
本发明正是通过仔细的对比研究发现，氨甲环酸注射液的产品质量与其配液时所用的注射用水的TOC有着紧密地联系，只要将注射用水TOC控制在0.4mg/L以下，那么该方法所能控制的氨甲环酸小容量注射剂或冻干粉针剂的杂质总量就可以得到有效控制。
本发明充分考虑到大容量注射剂由于制备工艺过程中需要经过高温灭菌，所以更容易导致杂质增加，因此，在配制大容量注射剂时，将注射用TOC更严格地控制在0.35mg/L以下。
更具体地说，本发明提供的一种减少以氨甲环酸作为活性组分的注射剂中杂质的方法，该方法包括：以氨甲环酸作为活性组分，使用TOC在0.4mg/L以下的注射用水制成小容量注射剂或冻干粉针，或使用在TOC 0.35mg/L以下的注射用水制成大容量注射剂。
按照欧洲药典EP8.0中氨甲环酸的检测方法，对氨甲环酸注射剂中杂质进行检测，结果显示：氨甲环酸注射剂配液时，一定要控制所用注射用水的TOC，配制小容量注射剂或 冻干粉针时其注射用水TOC应在0.4mg/L以下，而大容量注射剂其注射用水TOC应在0.35mg/L以下，只有这样，才能有效降低注射剂中杂质含量，从而提高以氨甲环酸作为活性组分的注射剂的质量。因此，通过本发明研究成果，发明人对氨甲环酸注射剂型的质量标准关于杂质检查项进行修订，对杂质限度具体规定为：质量标准中设置的杂质包括杂质A：反式-4，4-(二亚甲基)二(环烷酸)含量不高于0.05％，杂质B：顺式-对氨甲基环己烷甲酸含量不高于0.05％，杂质C：4-氨甲基-1-环己烯甲酸含量不高于0.05％，杂质D：对氨甲基苯甲酸含量不高于0.05％，其他任何一个单杂含量均不高于0.05％，总杂质不高于0.25％。同时，氨甲环酸原料药中各类杂质控制的限度定应不得超过制剂中各种类杂质控制限度。
本发明提供了一种减少以氨甲环酸作为活性组分的注射剂中杂质的方法，其所控制的杂质限度可以有效、稳定地控制产品质量，但对于氨甲环酸注射剂的杂质检测方法而言，并不限于上述一种方法。
本发明提供了一种适用于工业化大生产的高纯度氨甲酸注射制剂，使氨甲环酸注射剂在临床应用中，单次安全有效使用剂量可以达到10g以上，甚至达到20g，尤其是在心脏外科手术体外循环围术期适应症的应用。正是因为对注射制剂中工艺用水的指标进行严格的质量控制，从而提升了制剂的质量标准，重要的是有效降低临床中因杂质导致的潜在不良反应的发生。
本发明所制备的高纯度氨甲环酸，将杂质A、B、C、D及其他任何一杂质限度由0.1％(w/w)提高到了0.05％(w/w)，从而有效的控制了伴随氨甲环酸给药剂量提高所带来的杂质引入量提高的风险因素，即控制杂质限度为不高于0.05％(w/w)，保证其杂质引入量远低于可能导致临床潜在不良反应发生的杂质限度。在临床实验研究中，我们令人惊奇地发现了氨甲环酸杂质含量和药物不良反应的关系，当总杂质含量降低到0.25％时，药物不良反应发生率则会大幅度地下降。从而进一步证明了本发明所制备的高纯度氨甲环酸当总剂量高达到10g时同样是安全的。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1 氨甲环酸氯化钠注射液(100ml∶1.0g)
实施例2 氨甲环酸氯化钠注射液(100ml∶0.5g)
实施例3 氨甲环酸注射液(5ml∶0.5g)
实施例4 注射用氨甲环酸(0.5g)
比较例1：氨甲环酸氯化钠注射液(100ml∶1.0g)
处方组成与实施例1相同，仅是注射剂配液时所用注射用水TOC为0.5mg/L。
比较例2：氨甲环酸氯化钠注射液(100ml∶0.5g)
处方组成与实施例2相同，仅是注射剂配液时所用注射用水TOC为0.5mg/L。
比较例3：氨甲环酸注射液(5ml∶0.5g)
处方组成与实施例3相同，仅是注射剂配液时所用注射用水TOC为0.5mg/L。
比较例4：注射用氨甲环酸(0.5g)
处方组成与实施例4相同，仅是注射剂配液时所用注射用水TOC为0.5mg/L。
试验例1：
将实施例1-4以及比较例1-4中制备的注射剂按照我国现行药典及药品稳定性考察指导原则相关要求进行稳定性测试，以考察其中杂质的含量。结果见表1和表2。
表1 使用含不同TOC的注射用水所配制氨甲环酸氯化钠输液剂的稳定性试验中杂质考察结果
表2 使用含不同TOC注射用水所配制氨甲环酸小容量和冻干制剂的杂质稳定性考察结果
试验例2
将按实施例1制备的高纯度氨甲环酸注射制剂应用于临床，研究共计入选受试者240例，手术时间约为6个小时，氨甲环酸大剂量(30mg/kg的负荷量+20mg/kg/h的维持量)、中剂量(20mg/kg的负荷量+15mg/kg/h的维持量)、小剂量(10mg/kg的负荷量+10mg/kg/h的维持量)和空白对照组分别为60例、59例、61例和60例。研究中共脱落/剔除4例病例，其中2例入组后发现术前血小板计数过低，不满足入选标准；1例入组后发现术前肝功能异常，不满足入选标准；1例患者自动出院，未完成研究。实际观察统计的236例中，瓣膜性心脏病患者共176例，在氨甲环酸大剂量、中剂量、小剂量和空白对照组中分别为45例、42例、46例和43例；冠状动脉粥样硬化心脏病患者共60例，在氨甲环酸的3个剂量组和空白对照组中各15例。所有受试者术前人口学资料和体格检查、既往病史、凝血功能和细胞因子检查没有组间差异。氨甲环酸大剂量、中剂量、小剂量和空白对照组的术后引流量分别为505.77±208.08ml、658.81±320.16ml、729.44±352.29ml和991.6±420.87ml，见表3。研究无严重不良事件发生。有22例一般不良事件，包括术后总胆红素、术后直接胆红素升高、术后血肌酐升高、术后尿素氮升高和术后谷氨酸氨基转移酶升高。在氨甲环酸大剂量、中剂量、小剂量和空白对照组中，一般不良事件的发生率分别为8.06％、8.47％、9.83％和10％，无统计学差异(p＞0.05)。所有一般不良事件经试验者评述，均判断为与氨甲环酸可能无关和肯定无关，见表4。
表3 各组间术后引流量的比较
大、中、小剂量组与对照组术后引流量比较，有统计学差异P＜0.05；
大剂量组与中、小剂量组术后引流量比较，有统计学差异P＜0.05
表4 各组间不良事件发生率
p＞0.05，无统计学差异
试验例3
将按本发明实施例1制备的氨甲环酸注射剂(样品1)(杂质A为0.044％，杂质B为0.008％，杂质C为0.005％，杂质D为0.042％，其他最大单一杂质为0.040％，总杂为0.142％)及按中国专利CN100579511C生产的氨甲环酸注射剂(样品2)(杂质A为0.068％、杂质B为0.049％、杂质C为0.038％、杂质D为0.079％、其他最大单一杂质为0.068％，总杂质为0.429％)进行临床对比试验。
择期行体外循环冠状动脉旁路移植术患者200例，年龄18～64岁，体重50～100kg，ASA分级I～IV级。无心脏手术史，术前未服用抗血小板药物，肝、肾功能未见异常。采用随机双盲法，将患者随机分为2组(n＝100)：样品1组和样品2组。两组均给予30mg/kg的负荷量(输注时间20min)，随后给予20mg/kg/h的维持量至手术结束。结果，样品1组与样品2组比较，术中出血量、术后总引流量和术后输血量无明显差异(P＞0.05)，见表5；两组不良事件发生率比较差异有统计学意义(P＜0.05)，研究无严重不良事件发生。一般不良事件包括胃肠道反应、肝肾功能异常、癫痫和血栓。样品1组不良事件发生率为8％，经研究者判断为与试验药品氨甲环酸的杂质可能无关，样品2组不良事件发生率为24％，经研究者判断为与试验药品氨甲环酸的杂质可能有关，见表6、7。
表5 两组患者出血和输血情况的比较
注：无统计学差异，P＞0.05
表6 两组患者不良事件发生例数
表7 两组患者不良事件发生率的比较
注：两组间不良事件发生率比较，有统计学差异P＜0.05 。