吴茱萸碱在制备保护人脐静脉血管内皮细胞药物中的应用的制作方法

本发明属于细胞生物学和药理学技术领域，具体涉及人脐静脉血管内皮细胞损伤模型的建立，特别涉及吴茱萸碱在制备保护人脐静脉血管内皮细胞的药物中的应用。

背景技术：

高血压为临床常见病和多发病，其主要并发症有中风、心肌梗死及肾功能衰竭，严重危害人们的身心健康，其是心脑血管病死亡的主要因素之一。由于高血压的发病多为遗传、环境、生物等多因素共同决定的，其发病涉及体内物质代谢的紊乱和多系统多器官的病变及功能失调。大量西药的降压药物只能通过单靶点的对抗作用降压，存在药物副作用大、耐药性高、常需联合用药等问题，给患者带来沉重的经济负担，这些都影响着患者的依从性及降压疗效。而与之相比，中药治疗高血压不仅副作用小，价格低廉，且是通过多靶点、多层次等途径降低血压，不在于单纯降低血压，更在于调整机体阴阳的平衡从而明显改善症状，提高生存质量，在降低心脑血管系统并发症及靶器官损伤，改善物质代谢，促进心、脑、肾、血管病理改变的恢复等多方面具有作用。中药疗效持久，在治疗高血压病方面具有独特的优势。因此研制开发疗效确切的治疗高血压的纯中药制剂具有良好的市场前景和积极的社会效益，符合医药发展趋势。

高血压发病机制复杂，除了肾素-血管紧张素-醛固酮系统、肾脏因素和遗传因素等，多项研究表明高同型半胱氨酸(Hcy)水平也是高血压病发病机制中重要的环节。Hcy是导致心血管疾病重要的危险因子。血液中同型半胱氨酸的浓度比半胱氨酸的浓度要更高，但是半胱氨酸并不对细胞造成损伤，同时也有研究表明同型半胱氨酸通过内质网应激反应，引起未折叠蛋白反应使蛋白不能正常折叠最终导致细胞损伤。许多研究表明，Hcy能够诱导促凝血因子，诱导细胞坏死和凋亡。同型半胱氨酸对内皮细胞损伤涉及多条机制，包括促进氧化剂的活性，抑制谷胱甘肽过氧化物酶活性，通过激活NF-kB增加炎症反应，促进血管平滑肌细胞的生长，导致胶原合成增加。Hcy促进活性氧(ROS)的产生导致内皮细胞的损伤。Hcy通过减少一氧化氮(NO)的释放损伤内皮细胞的功能，降低NO的生物活性和内皮依赖的血管松弛。内皮型一氧化氮合酶(eNOS)通过连接到小凹蛋白(Cav-1)特定位点以调节其活性。在静息条件下，Cav-1对eNOS有负调控作用；在激动剂的作用下，通过调控蛋白的介导，eNOS可以和Cav-1解离，但不会离开，这增加了合成NO的能力。当Cav-1过表达，eNOS和Cav-1结合过多导致NO合成减少。以上这些均会导致高血压的发生。因此，选用Hcy对实验细胞进行损伤。

高血压病和内皮细胞功能障碍之间有密不可分的关系。高血压是内皮损伤的始动因素之一，在高血压病理状态下，主要表现为内皮依赖性舒张功能减弱或内皮依赖性收缩功能增强以及血管壁炎症反应的增强。高血压患者血流动力增加，影响血管内皮细胞的PI3K和AKT的分泌，可引起血管内皮损害，形态和结构的改变和功能的失调，同时使氧自由基增多，进而引起收缩血管物质增加，使扩张血管物质减少而导致血管变形。因此，选用人脐静脉血管内皮细胞为实验细胞，通过检测ROS和PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达，确证吴茱萸碱对细胞的保护作用及其机制。

目前明确有降压作用的中药和有效成份较多，如钩藤、葛根、天麻、牛膝、吴茱萸等。吴茱萸具有降血压的作用来源已久，其降血压机制是通过多种活性成分和多种机制产生的。其中主要包括吴茱萸碱，次吴茱萸碱以及去氢吴茱萸碱等，但是关于降血压的作用现在只有去氢吴茱萸碱有过报道，关于吴茱萸碱的降血压作用并未见报道。因此，选用吴茱萸碱作为药物对研究吴茱萸在临床应用中具有指导意义。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供吴茱萸碱在制备保护人脐静脉血管内皮细胞的药物中的应用。本发明确证了吴茱萸中吴茱萸碱具有药物活性，对同型半胱氨酸损伤的人脐静脉血管内皮细胞具有保护作用。

优选地，所述的人脐静脉血管内皮细胞为HUVEC。

优选地，吴茱萸碱在同型半胱氨酸损伤的人脐静脉血管内皮细胞有效作用浓度为7.5-30μmol/L。

本发明的第二个目的在于提供吴茱萸碱在制备降血压的药物中的应用。

有益效果：本发明提供了吴茱萸碱在制备保护人脐静脉血管内皮细胞的药物中的应用，证实了吴茱萸碱对同型半胱氨酸损伤的人脐静脉血管内皮细胞有效作用浓度7.5-60μmol/L，效果好，用量少，副作用小。

本发明发现了吴茱萸碱保护人脐静脉血管内皮细胞的作用机制其保护人脐静脉血管内皮细胞作用通路是通过PI3K/Akt信号通路。

附图说明

图1为Hcy对HUVEC损伤的时间和剂量关系图；

图2为吴茱萸碱浓度和细胞相对活力关系图；

图3为吴茱萸碱浓度和活性氧关系图；

图4为吴茱萸碱浓度和PI3K关系图；

图5为吴茱萸碱浓度和p-Akt/Akt关系图。

具体实施方式

实施例1细胞损伤模型的建立

分组：实验分为空白组、对照组、不同浓度Hcy组；每组设置6个复孔。

细胞模型建立：

(1)收集对数期HUVEC细胞，待细胞长满85％后，吸出原来培养基，实验组加入不同浓度Hcy溶液200μL，对照组和空白组加入培养基200μL，每孔终体积200μL。

(2)放置在5％CO2，37℃细胞培养箱中孵育6、12、18、24、30h，倒置显微镜下观察；每孔加入20μLMTT溶液，在37℃恒温培养箱中继续培养4h。

(3)将上清液吸净，每孔加入150μLDMSO，摇床避光震荡10min使蓝色结晶物充分溶解。

(4)用酶标仪在490nm波长处测量各孔的吸光度。

设对照组的细胞相对活力为1，其他组的细胞相对活力为实验组与对照组的比值，图1中纵坐标为细胞相对活力，横坐标为6、12、18、24、30h下空白组、4、2、1、0.5mmol/L浓度Hcy损伤的细胞相对活力。根据图1确定Hcy最终损伤浓度为0.5mmol/L，时间为6h。

表1：Hcy对HUVEC损伤的时间和剂量关系

实施例2吴茱萸碱对细胞活性的影响

药物作用浓度建立：

(1)收集对数期HUVEC细胞，待细胞长满85％后，吸出原来培养基，实验组加入1mmol/L Hcy溶液100μL和不同药物浓度溶液各100μL，造模组加入0.5mmol/L Hcy 200μL，对照组和空白组加入培养基200μL，阳性对照组加入1mmol/L Hcy溶液100μL和200μmol/L去氢吴茱萸碱100μL，每孔终体积200μL。

(2)放置在5％CO₂，37℃细胞培养箱中孵育6h，倒置显微镜下观察；每孔加入20μL MTT溶液，在37℃恒温培养箱中继续培养4h。

(3)将上清液吸净，每孔加入150μL DMSO，摇床避光震荡10min使蓝色结晶物充分溶解。

(4)用酶标仪在490nm波长处测量各孔的吸光度。

设对照组的细胞相对活力为1，其他组的细胞相对活力为实验组与对照组的比值，图2中为对照组、阳性对照组、模型组以及不同浓度吴茱萸碱下细胞相对活力。根据图2确定吴茱萸碱最终有效浓度为7.5-30μmol/L，相对已知降压药物去氢吴茱萸碱具有更高的活性且浓度低，副作用小。

表2：吴茱萸碱浓度和细胞活力关系

注：与对照组相比**P＜0.01，*P＜0.05

实施例3吴茱萸碱对ROS的影响

(1)将细胞铺于6孔板，待细胞长到50％左右后，吸出原来培养基，实验组加入1mmol/L Hcy溶液1mL和不同药物浓度溶液各1mL，造模组加入0.5mmol/L Hcy 2mL，对照组加入培养基2mL，每孔终体积2mL。

(2)放置在5％CO₂，37℃细胞培养箱中孵育6h，倒置显微镜下观察，吸出原来培养基，预冷的PBS洗3遍，加入含1μmol/L DCFH-DA预冷的PBS，37℃孵育细胞60min。

(3)吸出原来PBS，用预冷的PBS洗3遍，加入500μL多聚甲醛，放置37℃恒温箱中固定15min。

(4)倒去多聚甲醛，用预冷的PBS洗3遍，最后加入2mL预冷的PBS。在荧光显微镜下观察细胞。

图3分别为对照组、30μmol/L、15μmol/L、7.5μmol/L浓度吴茱萸碱、模型组下ROS的荧光。根据图3表明Hcy能够增加ROS，吴茱萸碱可以降低ROS，其中ROS与吴茱萸碱浓度呈负相关性。

实施例4吴茱萸碱对PI3K/Akt蛋白的影响

(1)将细胞培养于60mm细胞培养皿，待细胞长到80％左右后，吸出原来培养基，实验组加入1mmol/L Hcy溶液1mL和不同药物浓度溶液各2mL，造模组加入0.5mmol/L Hcy 4mL，对照组加入培养基4mL，每皿终体积4mL。

(2)放置在5％CO₂，37℃细胞培养箱中孵育6h，倒置显微镜下观察，吸出原来培养基，预冷的PBS洗3遍，用试剂盒提取细胞总蛋白。

(3)Western Blot检测蛋白表达。

根据图4和图5确定Hcy能够降低PI3K和p-Akt/Akt的表达，药物能够增加PI3K和p-Akt/Akt，并且PI3K和p-Akt/Akt表达量与吴茱萸碱浓度呈剂量依赖性。