他克林在制备治疗包虫病药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种化合物的医药用途，，具体涉及他克林在制备治疗包虫病药物中的应用，属于生物医药领域。

背景技术：

包虫病(Echinococcosis)，又称为棘球蚴病(Hydatid diseases)，是全球分布的重要人畜共患疾病之一。患者误食入被虫卵污染的食物、水源或者接触感染的病犬等动物致病。据不完全统计，我国包虫病患者高达60～70万，受威胁人群约为达6600万以上。包虫病的病程发展缓慢，主要产生占位性病变，若无有效治疗，患者会逐渐丧失劳动能力甚至死亡。包虫病不仅威胁人民群众身体健康，还给畜牧业带来了巨大的经济损失。由此造成了我国每年畜产品经济损失上亿，严重影响了畜牧业的发展，制约了西部地区的经济发展。

目前，手术治疗是包虫病治疗的首选方法，但是对于大多数患者来说，服用苯并咪唑类药物(阿苯达唑和甲苯达唑)是主要的治疗手段。但由于受药物吸收差等因素的影响，药物治疗的治愈率不高，仅为30％左右。现有药物难以满足目前包虫病治疗需求。因此亟待找到新的有效替代药物和药物靶点，加速包虫病药物研发，最终提高药物治疗效果，减轻患者疾病负担。

申请人长期研究发现，他克林(9-Acridinamine,1,2,3,4-tetrahydro-，化学结构式(I))具有抗包虫的效果，该效果目前国内外尚未见报道。他克林(9-Acridinamine,1,2,3,4-tetrahydro-)在临床上主要用于治疗阿尔茨海默症，可延缓病程6～12个月，提高患者的认知能力和自理能力。其作用机制为：1)抑制脑内乙酰胆碱酯酶，增加脑内乙酰胆碱的含量；2)促进脑内乙酰胆碱酯酶的释放；3)增加大脑皮质和海马的N-R密度；4)促进脑组织对葡萄糖的利用，改善学习、记忆能力的降低。

目前抗包虫药物的研究工作较为缓慢，他克林具有抗包虫的效果的发现为治疗包虫病提供了新的思路，有望丰富包虫病的治疗手段。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供他克林的新用途，即在制药中的新应用。

本发明是通过深入研究他克林对棘球蚴的作用效果，探索其作为抗包虫药物新药的应用前景。实验结果表明，他克林能够杀灭原头节以及抑制生发层细胞的生长，是一种高效的抗包虫新型药物。

本发明的技术方案是，本发明提供他克林在制备治疗包虫病药物中的应用。

进一步地，所述他克林具有抑制细粒棘球蚴生发层细胞活性的功能。

进一步地，所述他克林具有抑制细粒棘球蚴原头节活性的功能。

进一步地，所述他克林抑制细粒棘球蚴生发层细胞活性的有效药物作用浓度为20μg/ml以上。

进一步地，所述他克林抑制细粒棘球蚴原头节活性的有效药物作用浓度为20μg/ml以上。

进一步地，所述治疗包虫病药物含有药学上有效量的他克林以及药学上可接受的载体。

进一步地，所述药物被制成任何一种药学上可接受的剂型。

进一步地，所述任何一种药学上可接受的剂型包括混悬剂、乳剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射剂等。

本发明评价他克林对体外培养的细粒棘球蚴原头节、生发层细胞的作用效果，步骤如下：

1)原头节、生发层细胞的体外培养

在流行区采集棘球蚴囊，分离和清洗囊中的原头节。将上述原头节和培养基加入培养瓶中，放置于5％CO₂、相对湿度为95％的37℃温箱培养。

从继发感染的小鼠体内取出棘球蚴囊，分离生发层细胞。将上述生发层细胞和培养基加入培养瓶中，放置于5％CO₂、相对湿度为95％的37℃温箱培养。

2)他克林的作用效果评价

将不同浓度的他克林溶液(2-40μg/ml)分别加入到原头节、生发层细胞中，观察药物作用效果。

实验结果表明，他克林在20μg/ml和40μg/ml的浓度作用于细粒棘球蚴原头节，能发挥100％的杀灭效果；他克林的浓度为40μg/m时，对细粒棘球蚴生发层细胞的活性的抑制率高达100％以上。可见，他克林作用于体外培养的细粒棘球蚴生发层细胞，对细胞活性表现出显著的抑制效果；他克林对体外培养的细粒棘球蚴原头节内部结构亦有一定的损伤，能有效杀灭细粒棘球蚴原头节。他克林具有显著的抑制细粒棘球蚴生发层细胞和原头节活性的作用，具有较强的抗包虫效果，是一种高效的抗包虫新型药物，为治疗包虫病提供了一种新的途径和手段。

附图说明

图1是本发明实施例1的细粒棘球蚴原头节经他克林作用后光镜观察结果示意图，其中，A代表正常原头节；B代表药物作用后原头节。

图2是本发明实施例1的细粒棘球蚴原头节经他克林作用后电镜观察结果示意图，其中，A代表正常原头节；B代表药物作用后原头节。

图3是本发明实施例2的细粒棘球蚴生发层细胞经他克林作用后光镜观察结果示意图，其中，A代表正常生发层细胞；B代表药物作用后的生发层细胞。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1他克林对体外培养的细粒棘球蚴原头节的作用效果评价

1)细粒棘球蚴原头节的制备

棘球蚴原头节的采集：在流行区采集棘球蚴囊，吸取含有原头节的囊液，将此囊液倾至容量为50ml的圆底离心管中，自然沉淀10min后，去上清液，随后用生理盐水将含原头节的沉淀物洗涤5-8次。在倒置显微镜下计数，并观察原头节存活状况。

2)细粒棘球蚴原头节的体外培养

培养器皿可用25cm²培养瓶，将上述处理后的原头节和培养基加入培养瓶中，然后置于5％CO₂、相对湿度为95％的37℃温箱培养，每4-5天换液一次。

3)他克林的药效评价方法

将培养的原头节加入96孔培养板中，每孔加入200μl培养基，分别加入待测他克林不同浓度的溶液(用DMSO进行稀释)，使终浓度为4、8、10、20、40μg/ml。给药后72小时，用美兰染液对原头节进行染色，死亡的原头节会被染成深蓝色，计数进行原头节活性计算。

原头节活性＝活的原头节数目/原头节总数×100％。

4)电镜观察

将药物作用后的原头节用PBS清洗2-3次，加入2.5％的戊二醛4℃固定2小时以上。经过一系列的清洗、固定、包埋、切片和染色等步骤处理后，上机对样本进行观察。

5)他克林对细粒棘球蚴原头节的作用效果

经药物作用72小时后，他克林浓度为20μg/ml和40μg/ml时，原头节的死亡率为100％，低于上述浓度，他克林对原头节无明显的作用效果(详见表1)。在显微镜下观察发现，正常原头节多为内陷状态，内部结构和边缘都较为整齐清晰；药物作用后死亡的原头节一部分呈现外翻状态，原头节整体形态发生改变，出现边缘模糊，小钩等结构排列混乱等现象(见图1)。扫描电镜发现，对照组正常原头节表皮合胞体结构致密，内部各种细胞和囊泡排列整齐；同对照组正常原头节相比，药物作用后的原头节表面无规则形状，出现大量的空泡(见图2)。

表1不同浓度他克林作用下原头节死亡率

实施例2他克林对体外培养的细粒棘球蚴生发层细胞的作用效果评价

1)细粒棘球蚴生发层细胞的制备

继发棘球蚴小鼠模型的建立：在流行区采集棘球蚴囊，取出并用HBSS(Hanks Balanced Salt Solution-，Hanks平衡盐溶液，一般用于配制细胞培养过程中的培养基或者清洗细胞)清洗其中的原头节。接种时将原头节稀释至4000只/ml备用。用1ml注射器吸取原头节悬液0.5ml，用75％酒精擦涂小鼠皮肤，将原头节注入小鼠腹腔内。该模型建立8-10月后可用于后续实验。

生发层细胞的分离：剖检上述小鼠，取出其体内的棘球蚴囊，用生理盐水清洗囊3-5次后将其剪碎后加入0.25％胰酶，37℃消化10-30分钟，离心后沉淀即为生发层细胞团。

2)细粒棘球蚴生发层细胞的培养

将制备的细胞用培养基调节密度为5×10⁴个/ml，铺板后置于5％CO₂、相对湿度为95％的37℃温箱培养，每2-3天换液一次。

3)他克林的药效评价方法

将培养的生发层细胞调整密度为5×10⁴个/ml加入96孔培养板中，每孔加入200μl培养基，分别加入待测他克林不同浓度的溶液(用DMSO进行稀释)，使终浓度为4、8、10、20、40μg/ml。给药后72小时，用CCK-8试剂盒(购自于日本Dojondo公司)测定细胞活性。

计算该待测药物对生发层细胞活性的抑制率：细胞活性抑制率＝[(对照度吸光度值-调零孔吸光度值)-(药物组吸光度值-调零孔吸光度值)]/(对照度吸光度值-调零孔吸光度值)×100％。

4)他克林对细粒棘球蚴生发层细胞的作用效果

经药物作用72小时后，他克林浓度为40μg/ml时，对细粒棘球蚴可达100％的抑制效果，当药物浓度降低为20μg/ml以下时，则无效(详见表2)。在显微镜下观察发现，正常生发层细胞结构清晰，有一定的透明度，贴壁生长，呈现圆形或者三角形；而药物作用后的生发层细胞颜色加深，呈现团状聚集(见图3)。

表2不同浓度他克林对细粒棘球蚴生发层细胞的抑制作用