小檗碱在制备增强炎症小体活化药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医学和药物领域，具体涉及小檗碱在制备增强炎症小体活化药物中的应用。

背景技术：

小檗碱(Berberine)又称黄连素，是一种常见的异喹啉生物碱，分子式C₂₀H₁₈NO₄。它存在于小檗科等四个科十个属的许多植物中，可从黄连、黄柏、三颗针等植物中提取。小檗碱为黄色针状晶体，熔点145℃，难溶于水，能溶于苯、乙醚和氯仿。常用药物形式为盐酸小檗碱(结构式如下所示)，在水中的溶解度都比较小。小檗碱对痢疾杆菌、结核杆菌、肺炎球菌、伤寒杆菌等多种细菌都有抑制作用，其中对痢疾杆菌作用最强。临床主要用于治疗细菌性痢疾和肠胃炎。小檗碱在治疗肠胃炎方面的用途，可见公开专利文件(申请号CN201210474880.7)。

盐酸小檗碱(分子量371.81g/mol)

激活炎症小体是机体最重要的固有免疫防御机制之一，包括：激活caspase-1/caspase-11，促进白细胞介素-1β(IL-1β)等炎症介质成熟、释放，诱导细胞焦亡。正常情况下，上述机制有利于增强感染部位的局部炎症反应，募集更多的中性粒细胞等吞噬杀伤细胞，促进病原微生物的清除，最终加速炎症的缓解和疾病的痊愈。具体而言，细胞焦亡在机体抗感染免疫中有如下作用：首先，研究表明caspase-1/caspase-11的表达及其介导的细胞焦亡，有利于抑制感染(包括葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠急性肠炎)，加快组织修复，而焦亡缺陷(caspase-1/caspase-11双敲除)的小鼠，易受感染而死亡。其次，细胞焦亡有利于胞内致病菌的释放，并被其他吞噬细胞所吞噬、杀伤而清除，防止致病菌在胞内的繁殖和持续存在。结核分枝杆菌、HIV等导致人类重大疾病的病原微生物，都进化了一套完整的免疫逃逸机制；促进细胞焦亡可能是清除此类病原微生物的一个潜在策略。第三，细胞焦亡是活化巨噬细胞的重要退出机制之一：如果巨噬细胞持续激活而不发生焦亡，其免疫代谢通路已经发生改变，导致脂类沉积，成为泡沫细胞或脂肪巨噬细胞，这些细胞持续不断地分泌炎症因子(内源性热原)和趋化因子，募集其他免疫细胞至病灶组织，将增加动脉粥样硬化和肥胖症等慢性炎症性疾病的风险。因此，增强感染部位的炎症小体的活化和感染细胞(或被激活细胞)的焦亡，促进成熟IL-1β分泌，可能有利于加强局部炎症反应，加速清除病原微生物、促进损伤组织的修复和疾病的痊愈。

鉴于炎症小体通路在固有免疫防御中的重要作用，通过增强炎症小体的活化，将有助于增强宿主的固有免疫细胞功能，提高抗感染能力，为细菌性感染等相关疾病的治疗提供新的途径。

目前，尚未有关于小檗碱在增强炎症小体活化的功能的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供小檗碱在制备增强炎症小体活化药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

小檗碱在制备增强炎症小体活化药物中的应用。

所述增强炎症小体活化的表现包括如下方面：激活caspase-1，促进炎症细胞因子分泌、成熟、释放，诱导细胞焦亡。

所述的炎症细胞因子为白细胞介素-1β(IL-1β)。

所述的增强炎症小体活化药物具有增强固有免疫细胞功能。

所述的增强炎症小体活化药物在制备治疗系统性细菌感染药物中的应用。

所述的增强炎症小体活化药物在制备治疗慢性炎症性疾病药物中的应用。

所述的增强炎症小体活化药物包含可接受的辅料。

所述的辅料优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。

所述的增强炎症小体活化药物还包含其他起配伍协同作用的有效成分。

所述的增强炎症小体活化药物可为片剂、颗粒剂、胶囊、滴丸、缓释剂、口服液、注射剂。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明是基于本发明的发明人首先发现小檗碱具有促进IL-1β分泌和增强固有免疫细胞功能的作用所提出的发明创造。本发明的发明人发现：小檗碱可显著促进ATP诱导LPS激活的巨噬细胞释放促炎症因子IL-1β和危险信号分子HMGB1，增强其杀伤胞内细菌的能力，有效降低腹腔细菌感染引起的死亡。小檗碱的上述新的活性与用途，尚未见公开文献报道。小檗碱通过增强炎症小体活化，提高IL-1β分泌，从而增强固有免疫细胞的功能，对临床治疗系统性细菌感染和慢性炎症性疾病等具有重要意义，可用于相关药物开发。

附图说明

图1是小檗碱(BBR)对LPS+ATP诱导的小鼠巨噬细胞J774A.1炎症小体激活情况的免疫印迹分析图。

图2是小檗碱(BBR)对LPS+ATP诱导的小鼠巯基乙酸盐(TG)诱导的腹腔巨噬细胞炎症小体激活情况的免疫印迹分析图。

图3是小檗碱(BBR)对LPS+ATP诱导的小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)炎症小体激活情况的免疫印迹分析图。

图4是小檗碱(BBR)促进小鼠巨噬细胞J774A.1细胞对吞噬细菌的杀伤作用的统计结果图；*表示P<0.05。

图5为小檗碱(BBR)降低腹腔细菌感染小鼠的死亡率的统计结果图；***表示P<0.001。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

盐酸小檗碱(纯度>98％)(产品编号B3251)、脂多糖(LPS)(产品名称Lipopolysaccharides from Escherichia coli 0111:B4，目录号:L4391)、ATP(目录号：A6419)、二甲基亚砜(DMSO)(目录号：D8418)、Tween-80(目录号：P8074)均购自Sigma-Aldrich公司；体外细胞实验小檗碱溶于DMSO，体内实验小檗碱(5mg/mL)溶于含2％(v/v)Tween-80的PBS溶液(pH＝7.4)。细胞培养基DMEM、胎牛血清(FBS)等细胞培养用物质均为Thermo/Gibco公司产品。所用IL-1β抗体(目录号：#12242)、HMGB1抗体(目录号：#3935)、β-微管蛋白(tubulin)抗体(目录号：#2128)均为Cell Signaling Technologies公司产品。抗caspase-1p10抗体(目录号：sc-514)为Santa Cruz Biotechnology公司产品

实施例1

(1)细胞培养和处理

小鼠巨噬细胞J774A.1购自中国科学院上海细胞库，培养于含10％(v/v)胎牛血清和含100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM(完全培养基)中。待细胞长至对数生长期，接种于6孔板中，细胞密度为2.5×10⁵/孔(2mL培养基)，培养24小时。然后换液，加入含500ng/mL LPS的完全培养基(2mL)，预处理4小时，激活J774A.1细胞，再经含不同浓度的小檗碱(1.5、3、6μmol/L)和0.1％(v/v)FBS的DMEM培养基(1.2mL)处理1小时，最后补加含ATP的DMEM培养基(ATP终浓度为3mmol/L)0.8mL处理1小时。

(2)上清中caspase-1和HMGB1的检测方法

细胞经上述处理后，吸取培养上清，经200×g离心5分钟，上清转移至另一离心管中，先后分别加入脱氧胆酸钠(使其终浓度为0.15％(w/v))和三氯乙酸(TCA)(使其终浓度为7.2％(v/v))混合均匀后，在4℃沉淀蛋白过夜。然后经14000×g离心30分钟，弃上清。沉淀加入700μL冷丙酮(-20℃)，充分悬浮、清洗沉淀中的TCA。离心后，弃上清；使沉淀中残余的丙酮在常温下挥发，最后用蛋白电泳样品液溶解。煮沸5分钟，经上述处理后的蛋白，用免疫印迹方法检测。

(3)实验结果

炎症小体激活程度以pro-caspase-1(45kDa)和HMGB1释放反映。结果如图1所示，细胞培养上清中pro-caspase-1和HMGB1的表达水平随BBR的剂量增加而升高，小檗碱(BBR)剂量依赖性地促进LPS+ATP诱导的小鼠巨噬细胞J774A.1细胞炎症小体活化。

实施例2

(1)细胞培养和处理

C57BL/6小鼠，雌性，6-8周龄，购自南方医科大学实验动物中心。适应性养殖一周后，经1mL含3％(w/v)巯基乙酸盐(Thioglycollate，TG)的PBS溶液腹腔注射刺激4天后，颈椎脱臼处死，用PBS溶液洗出其腹腔游离细胞。培养于含10％FBS和含100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM完全培养基的6孔板中，细胞密度为2.5×10⁶/孔(2mL培养基)，培养24小时。然后换液，加入含500ng/mL LPS的完全培养基(2mL)预处理4小时，激活腹腔巨噬细胞，再经含不同浓度的小檗碱(0.75、1.5、3.0μmol/L)的培养基(1.2mL)处理1小时，最后补加ATP(使其终浓度为2mmol/L)处理30分钟。

(2)上清中caspase-1和IL-1β的检测方法

细胞经上述处理后，吸取培养上清1.2mL，经200×g离心5分钟，上清转移至另一离心管中，先加入21μL的10％(w/v)脱氧胆酸钠溶液(终浓度为0.15％(w/v))，摇匀后，再加入94μL的100％三氯乙酸(终浓度为7.2％(v/v))混合均匀后，在4℃沉淀蛋白过夜。然后经14000×g离心30分钟，弃上清。沉淀加入700μL冷丙酮(-20℃)，洗去沉淀中的三氯乙酸；14000×g离心5分钟。弃上清，用上述冷丙酮(-20℃)重复洗两次。最后一次洗涤离心后，弃上清；使沉淀中残余的丙酮在常温下挥发，最后用蛋白电泳样品液溶解。煮沸5分钟，经上述处理后的蛋白，用免疫印迹方法检测。

(3)实验结果

炎症小体激活程度以caspase-1(p10片段)活化水平和IL-1β释放反映。结果如图2所示，细胞培养上清中活化caspase-1(p10)和IL-1β的表达水平随BBR的剂量增加而升高，小檗碱(BBR)剂量依赖性地促进LPS+ATP诱导的小鼠腹腔巨噬细胞炎症小体活化。

实施例3

(1)细胞培养和处理

小鼠成纤维细胞L929细胞购自中国科学院昆明动物研究所细胞库。细胞培养方法参照Monack实验室的操作程序(Stanford)，将1×10⁸个细胞培养于底面积为500cm²的三层培养瓶中，培养基为DMEM完全培养基(200mL)。

小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)的培养方法：C57BL/6小鼠，6-8周，雌性，购自南方医科大学实验动物中心。经颈椎脱臼处死后，取其大腿骨，用注射器将骨髓细胞用DMEM培养基冲出。得到的细胞用BM-Mac培养基(80％(v/v)DMEM完全培养基+20％(v/v)L929细胞培养上清)，培养于细菌培养皿(密度为5×10⁶个细胞/皿，培养基体积为8-10mL)。培养3天，添加10mL新的培养基；培养第5天，替换为上述新鲜培养基。培养第7天，收集细胞，培养于含10％(v/v)FBS和含100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM(完全培养基)的6孔板中，细胞密度为2.3×10⁶个/孔(2mL培养基)，培养24小时。然后换液，加入含500ng/mL LPS的完全培养基(2mL)预处理4小时，激活BMDM细胞，再经含不同浓度的小檗碱(0.75、1.5、3.0μmol/L)的培养基(1.2mL)处理1小时，最后补加ATP，使ATP在培养基的终浓度为2mmol/L，处理30分钟。

(2)上清中caspase-1和IL-1β的检测方法

细胞经上述处理后，吸取培养上清1.2mL，经200×g离心5分钟，上清转移至另一离心管中，先加入21μL的10％脱氧胆酸钠溶液(终浓度为0.15％(w/v))，摇匀后，再加入94μL的100％三氯乙酸(终浓度为7.2％(v/v))混合均匀后，在4℃沉淀蛋白过夜。然后经14000×g离心30分钟，弃上清。沉淀加入700μL冷丙酮，洗去沉淀中的三氯乙酸；14000×g离心5min，弃上清，用上述冷丙酮重复洗两次。最后一次洗涤离心后，弃上清；使沉淀中残余的丙酮在常温下挥发，最后用蛋白电泳样品液溶解。煮沸5分钟，经上述处理后的蛋白，用免疫印迹方法检测。

(3)实验结果

炎症小体激活程度以caspase-1(p10片段)活化水平和IL-1β释放反映。结果如图3所示，细胞培养上清中活化caspase-1(p10)和IL-1β的表达水平随BBR的剂量增加而升高，小檗碱(BBR)剂量依赖性地促进LPS+ATP诱导的小鼠腹腔巨噬细胞炎症小体活化。

实施例4

(1)细菌培养

大肠杆菌(DH5α)在Luria Broth(LB)培养基中摇菌过夜(37℃)，次日按10％菌液在新鲜培养基中继续摇菌扩增3小时(37℃)。扩增后的菌液在1824×g离心力下离心10分钟，PBS洗涤后，重悬于PBS溶液备用。细菌密度用微量紫外分光光度计(Nanodrop 2000；Thermo Scientific)测定；对应的菌落形成单位(colony forming units,CFU)由传统LB琼脂糖平板涂布培养确定。

(2)细菌杀伤

小鼠单核巨噬细胞J774A.1细胞培养于含10％FBS的DMEM完全培养基中。待细胞长至对数生长期，种于24孔板中，细胞密度为3.5×10⁴/孔(500μL培养基)，培养24小时。换液并用DMEM进行洗涤两次后，在无抗生素的培养液中加入2.8×10⁵CFU的活大肠杆菌，使细胞吞噬细菌2小时；将不同浓度的小檗碱(BBR，1.5、3、6、12μmol/L))配制于含抗生素的培养液中继续培养6小时后，换液并用前述不含抗生素的DMEM进行洗涤两次；最后，以200μL浓度为0.5％(v/v)Triton X-100，常温下裂解细胞5分钟，由此得到的细胞裂解液以PBS稀释10倍后，取100μL进行LB琼脂板涂布，置于37℃培养箱，培养24小时后对长出的菌落进行计数。各组间菌落数的差异分析采用方差分析和Tukey检验，P<0.05视为差异有统计意义。

(3)结果

结果如图4所示，小檗碱(BBR)可促进J774A.1细胞对吞噬细菌的杀伤作用。*表示P<0.05。

实施例5

(1)细菌培养

大肠杆菌DH5α在Luria Broth(LB)培养基中摇菌过夜(37℃)，次日按10％菌液在新鲜培养基中继续摇菌扩增3小时(37℃)。扩增后的菌液在1824×g离心力下离心10分钟，PBS洗涤后，重悬于PBS溶液备用。细菌密度用微量紫外分光光度计(Nanodrop 2000；Thermo Scientific)测定；对应的菌落形成单位(CFU)由传统LB琼脂糖平板涂布培养确定。

(2)动物实验

C57BL/6小鼠(购自南方医科大学实验动物中心)，在本实验室适应性养殖一周后，按100mg/kg体重的剂量将含小檗碱的PBS溶液预灌胃3天(每天一次)后，腹腔接种大肠杆菌(2×10⁹CFU/只)，在接下来的96小时内，每6小时观察记录小鼠存活情况，并绘制小鼠Kaplan-Meier生存曲线分析存活率。小鼠存活率的差异分析采用Long-rank检验，P<0.05视为差异有统计意义。

(3)实验结果

结果如图5所示，大肠杆菌感染可导致小鼠因感染而死亡；而小檗碱(BBR)可有效降低腹腔细菌感染小鼠的死亡率。***表示P<0.001。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。