提高组织工程人工角膜屈光度的角膜植片级联方法与流程

本发明属于人体植入医疗器械技术领域，具体涉及一种提高组织工程人工角膜屈光度的角膜植片级联方法。

背景技术：

角膜盲是仅次于白内障的第二大致盲眼病，患者中绝大多数人可以通过角膜移植重见光明。当前，角膜盲的治疗方法主要包括人捐献角膜手术移植、人工角膜移植术等。但是由于多方面因素，我国各地眼库的角膜来源奇缺，不少患者只能被动地等待捐献。人工角膜的研究在国外已有以异质性材料如聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA）、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA）、玻璃、硅胶等为原料研发制作的人工角膜，但存在生物相容性差，力学特性差，临床试验效果不佳，无法形成连续化上皮，不能与患者自体组织完全整合等缺点。病人排异反应明显，会伴有严重的并发症，如植入物排出、感染、眼内炎、形成后增殖膜和青光眼。脱细胞猪眼角膜也已经临床应用，因为是异种异体移植，仍然存在移植排斥的风险。如果能构建出完全等同于人角膜的组织工程角膜将彻底解决角膜移植排斥、供体不足等问题，有着广阔的应用前景。

人的角膜薄而透明，是由无数排列紧密、纵横交错成网状的胶原纤维构成，胶原纤维规则的网格状排列起到了衍射光栅的作用，通过破坏干涉来减少光散射。人的中央角膜的平均曲率半径是7.8mm(6.7～9.4mm)，角膜总屈光度约为43.25D。因为受材料、工艺的限制，组织工程角膜还无法完全仿生人角膜的精密复杂结构，这样会导致组织工程角膜的屈光度难以满足要求。

技术实现要素：

本发明涉及提高组织工程人工角膜屈光度的角膜植片级联方法，解决单个组织工程人工角膜屈光度不够的技术问题。

一种提高组织工程人工角膜屈光度的角膜植片级联方法，是以高分子生物材料以3D打印制作组织工程人工角膜植片，所述角膜植片包括前端角膜植片和后端角膜植片；所述前端角膜植片具有与患者角膜相似的尺寸和曲率，置于角膜植床；所述后端角膜植片具有与患者晶状体相似的尺寸与曲率，置于患者的虹膜和晶状体之间；结合前端角膜植片的屈光度，调整后端角膜植片中前壁和后壁的曲率，将整体屈光度提高到正常值，实现角膜植片级联。

进一步的，所述前端角膜植片的制备方法：

1）制备角膜三维支架：使用3D生物打印机，使用多元共聚物为原料置于打印机的料筒中，根据预先设定的模型，打印出角膜形状的三维立体支架；

2）利用ECM对三维支架进行功能修饰：取脱细胞角膜细胞外基质干粉溶于蒸馏水中，制备成纳米颗粒混悬液，使用直接涂覆的方式将混悬液中的细胞外基质颗粒均匀覆盖到角膜三维支架表面；

3）残余角膜微组织化方法的构建：取患者角膜进行微组织化处理，制备成均匀的细微颗粒，离心收集沉淀，在沉淀中加入生物蛋白胶，在无菌条件下，将其注入到被修饰支架材料中，制得前端角膜植片。

为了满足人工角膜光学性能、力学强度和降解性能的需求，所述多元共聚物是由多种单体聚合而成，所述单体选自ε-己内酯、丙交酯、三亚甲基碳酸酯或胶原蛋白中的几种组合，使用时的质量比为，ε-己内酯：丙交酯：三亚甲基碳酸酯：胶原蛋白=5-90:5-90:3-50:5-30。

为了满足人工角膜的力学强度，所述多元共聚物的分子量为3000-50000。

为了提高三维支架的生物相容性，保证细胞能够在支架上存活，所述三维支架的孔隙率为90%，孔隙直径为200-500µm。

进一步的，所述三维支架的外壁曲率半径为7.7mm，内壁的曲率半径为6.7mm，壁厚为200-400μm，前端角膜植片的直径为12mm。

进一步的，所述后端角膜植片在结构上包括光学部、主体部、锚点固定部及锚定孔，所述光学部位于眼镜中间，具有角膜曲率，包括前壁和后壁，所述前壁为凸透镜，后壁是凸透镜或凹透镜；所述主体部包围在光学部周围；至少两个锚点固定部，为半圆形状，厚度小于主体部，对称分布在主体部的周围；所述锚定孔，位于锚点固定部的中间位置，为穿透锚点固定部的圆孔，直径为0.6-1.2mm。

为了配合3D打印成型法的优势，根据眼镜的光学部、主体部和锚点固定部的性能需求以及整个眼镜的性能需求，分别对三个部分的原料配方进行调整，所述光学部的原料包括如下质量份的组分，透氧性材料3-8份、亲水性材料5-10份、引发剂0.01-0.04份、交联剂0.1-0.2份；所述主体部的原料包括如下质量份的组分，透氧性材料12-18份、亲水性材料4-6份、引发剂0.01-0.04份、交联剂0.1-0.2份；所述锚点固定部的原料包括如下质量份的组分，透氧性材料2-3份、亲水性材料20-30份、引发剂0.01-0.02份、交联剂0.1-0.15份。

进一步的，所述后端角膜植片的制备方法：

1）对患者进行眼部检查，采集眼部数据，计算可植入隐形眼镜的矫正度数；

2）建立可植入隐形眼镜的三维模型，并根据光学部所需屈光度对三维模型进行调节，对模型文件进行分层处理；

3）将光学部、主体部或锚点固定部的材料分别混合均匀，分别放入预热至85-90℃的料筒一、料筒二或料筒三中；在3D打印软件控制下逐层打印，得到本发明的可植入隐形眼镜，微调眼镜度数，保存于生理盐水中。

为了与前端角膜植片的屈光度相结合，将整体屈光度提高到正常值，所述光学部的前壁和后壁都采用凸透镜，前壁曲率半径12mm，后壁曲率半径10mm，厚度200-500μm。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明提供了一种提高组织工程人工角膜屈光度的级联方法，包括制备前端角膜植片和制备后端角膜植片，两部分均使用与人体组织相容性好的生物材料，且使用3D打印成型。所述前端角膜植片以角膜支架的形式，并在支架中植入患者自体角膜细胞，置于患者的角膜植床。所述后端角膜植片以隐形眼镜的形式，置于患者的虹膜和晶状体之间。根据眼科影像检查与计算机数据分析，结合前端角膜植片的屈光度，调整后端角膜植片中前壁和后壁的曲率，将整体屈光度提高到正常值。本发明采用前端角膜植片和后端角膜植片级联的方法解决单个组织工程人工角膜屈光度不够的技术问题。

附图说明

图1为本实施例的角膜植片的植入位置示意图；

图2为本实施例的两级角膜植片级联提高屈光度的示意图；

图3为本实施例的后端角膜植片的结构示意图；

图中标注：前端角膜植10、后端角膜植片20、光学部21、主体部22、锚点固定部23、锚定孔24、虹膜30、晶状体40、视网膜50。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。本发明所提到的比例、“份”，如果没有特别的标记，均以重量为准。

一种提高组织工程人工角膜屈光度的角膜植片级联方法，是以高分子生物材料以3D打印制作组织工程人工角膜植片，所述角膜植片包括前端角膜植10和后端角膜植片20；所述前端角膜植片具有与患者角膜相似的尺寸和曲率，置于角膜植床；所述后端角膜植片具有与患者晶状体相似的尺寸与曲率，置于患者的虹膜30和晶状体40之间；根据眼科影像检查与计算机数据分析，结合前端角膜植片的屈光度，调整后端角膜植片中前壁和后壁的曲率，将整体屈光度提高到正常值，实现角膜植片级联。

1、所述前端角膜植片的制备方法为：

1）以多元共聚物为原料制备角膜三维支架：使用3D生物打印机，将多元共聚物置于打印机的料筒中，一次打印需要原料8-12g，根据预先设定的模型，将多元共聚物材料挤出在载有灭菌玻璃底板的打印平台上，打印出角膜形状的三维立体支架。

参照人眼角膜结构的平均参数，本实施例的前端角膜植片三维支架的设计参数如下：三维支架的外壁曲率半径为7.7mm，内壁的曲率半径为6.7mm，壁厚为200-400μm，前端角膜植片的直径为12mm。

打印头直径为200μm，挤出速度为0.022-0.033mm/s，打印温度为120℃-180℃，优选为150℃，打印速度为6mm/s，打印层厚为0.01-0.1mm。上述3D打印的工艺参数会影响三维支架的精度，且它们之间相互影响，例如（1）打印头直径，直接影响打印输出纤维的粗细，还与材料的粒径大小有关。（2）打印温度，影响到材料的黏度、供料压力、成型固化速度等，从而间接影响成型精度。（3）打印速度，与材料挤出速度、材料黏度、材料固化成型速度匹配，太快不易成型或出现断丝，太慢出现材料堆积。（4）打印层厚，本身是打印精度指标，层厚过大，要求挤出速度高，在材料黏度过高时难以实现。层厚设置与材料黏度、打印温度、打印速度、挤出速度相关。

打印得到的角膜三维支架的孔隙率为90%，孔隙直径为200-500µm。所述孔隙率及孔隙直径对支架的生物相容性有很大影响，孔隙率决定营养物质和氧气的传递，孔隙直径影响细胞生长所需空间，二者直接决定细胞能否在支架上存活。

所述多元共聚物的制备方法为：取多种单体原料混合，加入催化剂，抽真空，充氮气，在密闭的容器中，在无水无氧条件下进行反应，温度为130-160℃，反应时间为10-24h；反应完成后将产物溶于二氯甲烷或乙酸乙酯中，加入甲醇或石油醚使多元共聚物沉淀，过滤，将沉淀于30-50℃条件下真空干燥，得到多元共聚物。

由反应温度和反应时间控制多元共聚物的分子量为3000-50000。多元共聚物的分子量影响三维支架的力学性能，包括支架的拉伸强度、弹性模量以及断裂伸长率，本实施例中分子量在3000-50000的范围内力学性能的综合指标是最优异的，满足角膜在临床上对力学强度的所有需求；而且分子量大的多聚物降解速率比分子量小的慢。

所述单体选自ε-己内酯、丙交酯、三亚甲基碳酸酯或胶原蛋白中的几种组合，使用时的质量比为，ε-己内酯：丙交酯：三亚甲基碳酸酯：胶原蛋白=5-90:5-90:3-50:5-30。当只使用其中两种或三种时，仍然满足以上质量比关系，例如使用ε-己内酯与丙交酯二元单体时，二者质量比为5-90:5-90；又如使用ε-己内酯、丙交酯、胶原蛋白三元单体时，三者质量比为5-90:5-90:5-30。其中所述丙交酯可以为左旋丙交酯和/或右旋丙交酯。

所述催化剂为辛酸亚锡、有机胍、金属锌、三丁基氯化锡、乙酰丙酮铁、乳酸锌、纳米氧化锌、牛磺酸、乙醇铁、正丙醇铁或正丁醇铁。催化剂的质量为原料质量的0.1%-1%，优选为0.5%。

2）利用ECM对三维支架进行功能修饰：取脱细胞角膜细胞外基质干粉溶于蒸馏水中，制备成颗粒混悬液，将上述三维支架浸泡入混悬液中，使用直接涂覆的方式将混悬液中的细胞外基质颗粒均匀覆盖到角膜三维支架表面，于4℃下保存备用。

所述脱细胞角膜细胞外基质干粉的制备方法为：将新鲜动物眼角膜放于生理盐水中洗净沥干后切成小块，使用双氧水浸泡，双氧水的质量浓度为3%，浸泡时间为10-24h；再使用蒸馏水和三蒸水清洗干净，细菌培养呈阴性后，将小块角膜使用超微湿法粉碎，在4℃条件下分三次离心，离心时间分别为10-20min，离心速度分别为1000rmp-8000rmp，且三次离心的速率是递增的；收集沉淀，冷冻干燥制备成脱细胞角膜细胞外基质纳米级干粉，平均直径为130-180nm，在4℃下保存。

3）残余角膜微组织化方法的构建：取患者角膜，去除退化变性组织，保留“相对正常”组织备用。将残余角膜组织在无菌条件下转移到超净工作台内的培养皿中，切成小块，转移到消毒好的玻璃瓶内，加入1-5µL质量浓度为0.1%-1%的胶原酶，用于将角膜组织分离成为单个细胞，充分剪碎，制备成均匀的残余角膜组织混悬液，通过300µm直径的滤网过滤，离心，弃掉上清液收集沉淀，在沉淀中加入1-5mL生物蛋白胶，用于粘连ECM，防止其渗出；在无菌条件下，将其注入到被修饰支架材料中。

本实施例的前端角膜植片采用多元聚合物人工合成材料，使用3D生物打印机打印角膜三维支架，能够满足人工角膜光学性能、力学强度和降解性能的需求。利用脱细胞眼角膜细胞外基质对角膜三维支架进行功能修饰，使得修饰后的眼角膜支架具有良好的细胞外基质微环境，在具有良好力学性能的前提下，获得更为优秀的生物相容性，并且可以进一步发挥细胞外基质对细胞行为的调控，促进细胞迁移、增殖和分化的作用，从而使得修饰后的支架具有更好的促进眼角膜再生的作用。同时，患者残余角膜微组织化处理能够获得自体的种子细胞，促进了组织工程角膜的“最优微环境化” ，具有快速向临床转化的应用前景。

2、所述后端角膜植片的制备方法为：

如图3所示，所述后端角膜植片，在结构上包括光学部21、主体部22、锚点固定部23及锚定孔24。所述光学部位于眼镜中间，具有角膜曲率，用于矫正眼睛屈光度。所述光学部包括前壁和后壁，前壁为凸透镜，后壁可以是凸透镜或凹透镜。所述主体部包围在光学部周围，植入后贴附在晶状体表面，用于支撑光学部。至少两个锚点固定部，为半圆形状，厚度小于主体部，对称分布在主体部的周围，植入后紧密贴附在晶状体表面，防止眼镜滑移。所述锚定孔位于锚点固定部的中间位置，为穿透锚点固定部的圆孔，直径为0.6-1.2mm，用于注入亲水物质，使眼镜与晶状体分离，如果需要更换后端角膜植片，利用锚定孔逆向功能取消粘附，方便取出眼镜。

本实施例中所述后端角膜植片的锚点固定部是主体部的延伸，尺寸较小，且厚度小于主体部，约是主体部厚度的二分之一，更容易与晶状体紧密贴附，可有效防止可植入隐形眼镜在眼睛内滑移。所述锚定孔是穿透锚点固定部的微孔，可通过锚定孔向眼镜内侧注入水凝胶等亲水物质，眼镜可迅速与晶状体分离，方便将眼镜取出，因此，本实施例的可植入隐形眼镜具有逆向脱离功能。

所述主体部可以是长方形或圆形，主体部的厚度是100-800μm。锚点固定部的半径为500-2000μm，厚度是20-500μm。

本实施例中眼镜的制备材料采用高透氧性、高亲水性的共聚物材料，可长期植入，生物相容性好，长期置于体内不会引起免疫排斥反应。眼镜的制备方法采用3D打印成型法。

3D打印成型法中，眼镜的光学部、主体部和锚点固定部所采用的原料不同，可根据三个部分的性能需求以及整个眼镜的性能需求，分别对原料配方进行调整。本实施例中所述光学部的原料包括如下质量份的组分，透氧性材料3-8份、亲水性材料5-10份、引发剂0.01-0.04份、交联剂0.1-0.2份；所述主体部的原料包括如下质量份的组分，透氧性材料12-18份、亲水性材料4-6份、引发剂0.01-0.04份、交联剂0.1-0.2份；所述锚点固定部的原料包括如下质量份的组分，透氧性材料2-3份、亲水性材料20-30份、引发剂0.01-0.02份、交联剂0.1-0.15份。特点是在锚点固定部中增加了亲水性组分，提高了这一部分的亲水性，提高与晶状体的贴合性；在此基础上，在主体部中增加了透氧性组分，提高了这一部分的透氧性，利于眼部与外界的气体交换。具体步骤为：

1）对患者进行眼部检查，采集眼部数据，计算后端角膜植片的矫正度数；

2）建立后端角膜植片的三维模型，并根据光学部所需屈光度对三维模型进行调节，对模型文件进行分层处理；

3）将光学部、主体部或锚点固定部的材料分别混合均匀，分别放入预热至85-90℃的料筒一、料筒二或料筒三中；在3D打印软件控制下逐层打印，得到本发明的后端角膜植片，从打印基板取下后端角膜植片，抛光处理，微调眼镜度数，保存于生理盐水中。

3D打印方法可以在同一个眼镜的不同部位使用不同的材料进行打印，强化了不同部位的功能作用。且3D打印方法可以根据角膜曲率，计算眼镜屈光度，编辑到3D模型中，打印即可一次成型，省去了对眼镜的磨片处理，精度更高，避免人为误差，操作更简便。

以上所述透氧性材料为甲基丙烯酰氧甲基三甲基硅烷、γ-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷的一种或两种；所述亲水性材料为甲基丙烯酸羟乙酯（PHEMA）、N-乙烯基吡咯烷酮（PNVP）、丙烯酸等、聚乙二醇的至少一种。所述引发剂可以为偶氮二异丁腈、过氧化二苯甲酰或偶氮二异庚腈；所述交联剂可以为N,N-亚甲基双丙烯酸酰胺、二乙烯基苯或二异氰酸酯。

实施例1

以如下步骤制备前端角膜植片：

（1）三元共聚材料的合成：按质量百分比取40%的ε-己内酯单体、40%的丙交酯单体和20%的胶原蛋白单体为原料投入反应设备中，加入所投入原料质量0.5%的辛酸亚锡锌作为催化剂，抽真空，充氮气，在密闭的聚合设备中，于160℃条件下反应24h，即可获得分子量为32838的多元共聚物。

（2）打印眼角膜三维支架：以上述三元共聚材料为原料，利用3D生物打印机，构建人角膜形状的三维立体结构体，结构体的孔隙直径为350µm，孔隙率为90%，外壁曲率半径为7.7mm，内壁的曲率半径为6.7mm，壁厚为300μm，直径12mm，得到可负载细胞的角膜三维支架。打印头直径为200μm，挤出速度为0.033mm/s，打印温度为150℃，打印速度为6mm/s，打印层厚为0.01mm。

（3）利用脱细胞角膜细胞外基质对3D打印支架进行功能修饰：取新鲜的猪眼眼角膜，生理盐水洗净沥干后切成小块，浸泡3%的双氧水20小时，蒸馏水和三蒸水清洗干净后，将角膜小块超微湿法粉碎，4℃条件下分三次离心，离心时间依次为15min、15min、20min，离心速度依次为4000rmp、5000 rmp、6000rmp；收集沉淀，冷冻干燥制备成干粉4℃下保存，干粉直径为140-160nm。将一定量的脱细胞角膜细胞外基质干粉溶于蒸馏水中，制备成纳米颗粒混悬液，将打印好的角膜支架浸泡入混悬液中，并用涂覆的方式使混悬液中的细胞外基质颗粒均匀分布于角膜支架表面，4℃下保存备用。

（4）残余角膜微组织化方法的构建：取角膜损伤患者角膜全切除后的残余角膜若干，去除退化变性组织，保留“相对正常”组织备用。将残余角膜在无菌条件下转移到超净工作台内，在培养皿里切成小块，然后转移到消毒好的玻璃瓶内，加入3µL质量浓度为1%的胶原酶，充分剪碎，制备成均匀的残余角膜组织混悬液，通过300µm直径的滤网过滤，离心，弃掉上清液收集沉淀，在沉淀中加入5mL生物蛋白胶，在无菌条件下，将其注入到被修饰支架材料中。

本实施例制备的前端角膜植片，拉伸强度为2.38MPa，弹性模量为1.6MPa，完全满足组织工程眼角膜对力学强度的需求。

本实施例制备的前端角膜植片的屈光度：

正常人眼角膜前表面的折射率约为1.376，而与角膜后表面接触的房水的折射率是1.336。前面折射力=1000(1.376-1)/ 7.7= 48.83D，后面折射力=1000(1.336-1.376)/ 6.7=-5.97D，因此，整个角膜的等价折射力约是43D。

使用比重1.008g/cm³的生理盐水模拟房水，经RL081630焦度计实测本实施例的前端角膜植片屈光度为32.35D，与正常人眼角膜相差大约11D。

实施例2

以如下步骤制备后端角膜植片，步骤为：

1、对患者进行眼部检查，采集眼部数据，计算后端角膜植片的矫正度数。

需要选择的角膜曲率计算简化公式如下：

（水平曲率+垂直曲率）/2*110%＝需要选择的角膜曲率

例如：水平曲率为7.8，垂直曲率为7.5，所需镜片基弧为： (7.8+7.5)/2*110%=8.4

2、3D打印后端角膜植片。

1）建立后端角膜植片的三维模型，光学部的前壁和后壁都采用凸透镜，根据患者需求对眼镜屈光度对三维模型进行调节，然后对模型文件进行分层处理。后端角膜植片可设计成图3所示的结构，三个锚点固定部3等间距的分布在圆形的主体部2周边，锚点固定部3的半径为1000μm，可紧密贴附在晶状体表面；

2）原材料预聚体制备，光学部包括甲基丙烯酸羟乙酯5g，N-乙烯基吡咯烷酮5g，甲基烯酰氧基甲基三乙氧基硅烷7g，引发剂偶氮二异丁腈0.03g和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酸酰胺0.15g混合均匀，迅速加入到预热至90℃的3D打印喷头的料筒一中；

主体部包括甲基丙烯酸羟乙酯2g，N-乙烯基吡咯烷酮3g，甲基烯酰氧基甲基三乙氧基硅烷16g，引发剂偶氮二异丁腈0.03g和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酸酰胺0.15g混合均匀，迅速加入到预热至90℃的3D打印喷头的料筒二中；

锚点固定部包括甲基丙烯酸羟乙酯14g，N-乙烯基吡咯烷酮13g，甲基烯酰氧基甲基三乙氧基硅烷2g，引发剂偶氮二异丁腈0.03g和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酸酰胺0.15g混合均匀，迅速加入到预热至90℃的3D打印喷头的料筒三中；

3）在3D打印软件控制下逐层打印，得到后端角膜植片。

4) 对上述制备得到的后端角膜植片进行抛光处理，微调眼镜度数。

3、后端角膜植片置于生理盐水浸泡、保存，生理盐水pH值为7.4。

计算本实施例的后端角膜植片屈光度：本实施例中光学部的前壁和后壁都采用凸透镜，前壁曲率半径12mm，后壁曲率半径10mm，厚度200-500μm。使用比重1.008g/cm³的生理盐水模拟房水，经RL081630焦度计实测本实施例的后端角膜植片屈光度为11.05D，结合前端角膜植片屈光度为32.35D，因此，整个角膜的等价折射力约是43D。

以上实施例仅是本发明若干种优选实施方式中的几种，应当指出，本发明不限于上述实施例；对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。