一种多肽改性蜂窝状纤维素支架及其制备方法与流程

本发明涉及一种多孔支架材料的制备方法，特别涉及一种多肽改性蜂窝状纤维素支架及其制备方法。

背景技术：

组织工程是指应用生命科学和工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物正常及病理两种状态下组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护和促进人体各种组织或器官损伤后功能和形态生物替代物的学科[贵浩然,李澎,张卫国.制备软骨组织工程支架的材料和方法.中国组织工程研究,2013,17:509]。组织工程支架材料是组织工程三大要素之一，理想的组织工程支架材料应具有良好的生物相容性、生物可降解性、降解产物无毒性、良好的机械强度以及高孔隙率的三维空间结构[MM Stevens.Biomaterials for bone tissue engineering.Materials today,2008,11:18；鄂征,刘流.医学组织工程技术与临床应用.北京:北京出版社,2003]。天然高分子材料以其良好的生物相容性被广泛应用于组织工程领域。天然高分子材料主要有胶原蛋白、壳聚糖、海藻酸盐、甲壳素、纤维素、琼脂糖、多肽、透明质酸和丝素蛋白等[U Gburecka,JE Barraletb,K Spatz,et al.Ionic modification of calcium phosphate cement viscosity.Part iv:Hypodermic injection and strength improvement of apatite cement.Biomaterials,2004,25:2187]。由它们制得的多孔支架材料普遍存在力学性能不足、可塑性差等缺点。木材具有长期进化演变而成的优化的多孔结构，且主要成分为纤维，若能通过技术处理去除其非纤维素成分并保持其天然结构，将可获得综合性能优异的多孔纤维素支架材料。

组织工程支架材料需要高孔隙率、高比表面积和适宜的孔径，这取决于支架制备方法。目前，纤维素支架材料的制备方法是将微晶纤维素或棉纤维素等溶于强碱溶液或离子溶液，再制备成支架材料，但所得支架机械强度低、孔隙连通性较差、孔隙率与孔分布可控性差，不利于细胞长入、血管化、养分传输和代谢产物排放。而绝大多数木材具有天然的蜂窝状多孔结构，且经几个至数十个微米的微孔连通，力学性能优异。通过一定技术手段将木材转变为纯纤维素多孔材料，将可保持其优异的力学性能和特殊的蜂窝状孔结构，在生物医学领域中具有很好的应用前景。然而，纤维素为生物惰性材料，生物降解性不够理想。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种多肽改性蜂窝状纤维素支架及其制备方法，首先通过酸/碱处理和漂白过程将木材转变为纤维素，然后采用真空浸涂工艺将多肽修饰于纤维素支架的孔壁表面，即得到多肽改性蜂窝状纤维素支架，该支架具有优异的生物相容性、突出的机械性能和特殊的蜂窝状孔结构，所采用的制备方法原料种类多、孔结构类型丰富、工艺过程简单、操作方便，所得支架在细胞3D培养、组织工程、组织修复等方面具有应用潜力。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种多肽改性蜂窝状纤维素支架的制备方法，包括以下步骤：

1)碱处理：将木材试样在浓度为1mol/L～6mol/L的碱溶液浸泡6小时～24小时后，将试样转移至质量浓度为2.5mol/L～12.5mol/L的碱溶液中，于60℃～100℃加热搅拌6小时～16小时；

2)酸处理：将经步骤1)碱处理后的试样洗涤后放入浓度为1mol/L～5mol/L的盐酸中，于65℃～100℃加热搅拌4小时～12小时；

3)漂白：将经步骤2)酸处理后的试样进行漂白；

4)多肽涂覆：将经步骤3)漂白的试样置于多肽溶液中，采用真空浸涂工艺将多肽浸涂于孔壁上，干燥后得到多肽改性蜂窝状纤维素支架；其中，所述的多肽溶液是将多肽溶于溶剂中制备的，每100mL溶剂中加入多肽的质量为0.1g～5g。

本发明进一步的改进在于，所述木材试样是通过将木材加工成厚度1mm～10mm、直径0.5cm～2cm的圆片，或者各维度长度均不超过2cm的规则块体或异形块体。

本发明进一步的改进在于，所述的木材为爬山虎藤、泡桐、沙比利或橡木。

本发明进一步的改进在于，所述碱溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。

本发明进一步的改进在于，漂白具体过程为：将经步骤3)酸处理后的试样置于浓度为1mol/L～2mol/L的次氯酸钠溶液中，室温搅拌4小时～12小时后取出，用水和乙醇反复漂洗至pH呈中性后进行干燥。

本发明进一步的改进在于，所述的多肽溶液是将多肽溶于溶剂中制备的，其中，溶剂为水、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、甲酸或三氟乙酸。

本发明进一步的改进在于，所述的多肽为L-谷氨酸-γ-苄酯、L-赖氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸的均聚物或几种的共聚物。

本发明进一步的改进在于，所述的真空浸涂工艺具体过程为：先在负压为0.02MPa下保持10分钟～30分钟、再于负压为0.04MPa保持1小时～3小时，最后在负压为0.06MPa保持1小时～4小时。

一种多肽改性蜂窝状纤维素支架，该支架呈蜂窝状结构，孔隙率为80％～95％，蜂窝状孔壁为网状结构，蜂窝状孔的孔径为90μm～200μm。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明中通过两次碱处理，第一次室温的碱处理是一个预反应的过程，使纤维中酚类等偏酸性物质充分与碱接触，第二次加热碱处理是除去纤维中的酚类等物质，碱处理后采用酸处理，酸处理有两个目的，一是除去金属离子与碱生成的沉淀，二是中和碱。本发明的支架材料保留了模板的特殊的蜂窝状孔结构，孔隙率为80％～95％，蜂窝状孔的孔径范围为90μm～200μm，蜂窝状孔通过几个至几十个微米的微孔连通，连通性好。

2.本发明的支架材料没有破坏模板固有的组织结构，因而具有突出的机械强度，其压缩模量高达50MPa，远高于现有纤维素及其复合材料支架的压缩模量。

3.本发明的支架材料的孔壁上涂覆有多肽涂层，该多肽涂层赋予其优异的生物相容性，且其效果好于现有的生物聚酯等材料。

4.本发明的制备方法具有原料来源广、孔结构多样性好、工艺过程简单，所得支架材料适用多种生物医学用途，如细胞三维培养、组织工程、缺损组织修复和重建等。

附图说明

图1是实施例1得到的蜂窝孔状纤维素的SEM照片，其中，图1(a)为横截面，图1(b)为纵截面。

图2是实施例1得到的聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)改性蜂窝孔状纤维素支架的SEM照片，其中，图2(a)为横截面，图2(b)为纵截面。

图3是实施例1得到的聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)改性蜂窝孔状纤维素支架的圧缩应力-应变曲线。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步描述，但本发明并不限于此。

实施例1

聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)改性蜂窝状纤维素支架的制备

1)加工成型：将爬山虎藤加工成厚度为4mm、直径为6mm的圆片，得到试样；

2)碱处理：将步骤1)获得的试样在浓度为4mol/L的氢氧化钠溶液浸泡12小时后，将试样转移至2.5mol/L氢氧化钠水溶液中，于100℃加热搅拌10小时；

3)酸处理：将经步骤2)碱处理后的试样用蒸馏水充分洗涤后放入浓度为2mol/L的盐酸中，于100℃加热搅拌4小时；

4)漂白：将经步骤3)酸处理后的试样置于浓度为2mol/L的次氯酸钠溶液中，室温搅拌6小时后取出，用水和乙醇反复漂洗至pH呈中性后进行干燥；

5)多肽涂覆：将经步骤4)漂白的试样置于多肽溶液中，采用真空浸涂工艺将多肽浸涂于孔壁上，具体为负压0.02MPa下保持10分钟、负压0.04MPa保持1小时、负压0.06MPa保持1小时，最后干燥试样，即得到聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)改性蜂窝状纤维素支架。其中，多肽溶液是通过将0.2g L-谷氨酸-γ-苄酯的均聚物溶于100mL氯仿中制得。

经过酸/碱处理和漂白后纤维素的SEM照片见图1，最后得到的聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)改性蜂窝状纤维素的SEM照片和压缩应力应-变曲线分别见图2和图3。

由图1可以看出，处理后的纤维素呈蜂窝状，蜂窝状孔孔壁呈现网状，连通性高。

由图2可以看出，经聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)涂覆改性后，仍然呈现典型的蜂窝状结构，蜂窝状孔壁仍为网状结构，孔隙率为80％～95％，蜂窝状孔的孔径范围为90μm～200μm，蜂窝状孔通过几个至几十个微米的微孔连通，连通性好，孔径大小基本不变。

由图3可以看出，聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)改性蜂窝状纤维素的压缩模量高达50.1MPa±2.4MPa。

实施例2

1)加工成型：将爬山虎藤加工成厚度1mm、直径0.5cm的圆片，得到木材试样。

2)碱处理：将步骤1)中的木材试样在浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液浸泡24小时后，将试样转移至质量浓度为12.5mol/L的氢氧化钠水溶液中，于60℃加热搅拌16小时。

3)酸处理：将经步骤2)碱处理后的试样洗涤后放入浓度为1mol/L的盐酸中，于65℃加热搅拌12小时。

4)漂白：将经步骤3)酸处理后的试样置于浓度为1mol/L的次氯酸钠溶液中，室温搅拌4小时后取出，用水和乙醇反复漂洗至pH呈中性后进行干燥。

5)多肽涂覆：将经步骤4)漂白的试样置于多肽溶液中，采用真空浸涂工艺将多肽浸涂于孔壁上，干燥后得到多肽改性蜂窝状纤维素支架；其中，所述的多肽溶液是通过将0.1g L-赖氨酸的均聚物溶于100mL二氯甲烷中制备的。其中，所述的真空浸涂工艺具体过程为：先在负压为0.02MPa下保持30分钟、再于负压为0.04MPa保持1.5小时，最后在负压为0.06MPa保持4小时。

实施例3

1)加工成型：将泡桐加工成厚度10mm、直径2cm的圆片，得到木材试样。

2)碱处理：将步骤1)中的木材试样在浓度为3mol/L的氢氧化钠溶液浸泡18小时后，将试样转移至质量浓度为5mol/L的氢氧化钠水溶液中，于100℃加热搅拌6小时。

3)酸处理：将经步骤2)碱处理后的试样洗涤后放入浓度为4mol/L的盐酸中，于70℃加热搅拌10小时。

4)漂白：将经步骤3)酸处理后的试样置于浓度为1.5mol/L的次氯酸钠溶液中，室温搅拌10小时后取出，用水和乙醇反复漂洗至pH呈中性后进行干燥。

5)多肽涂覆：将经步骤4)漂白的试样置于多肽溶液中，采用真空浸涂工艺将多肽浸涂于孔壁上，干燥后得到多肽改性蜂窝状纤维素支架；其中，所述的多肽溶液是通过将3g L-苯丙氨酸与L-丙氨酸的共聚物溶于100mL二甲基甲酰胺中制备的。其中，所述的真空浸涂工艺具体过程为：先在负压为0.02MPa下保持20分钟、再于负压为0.04MPa保持2.5小时，最后在负压为0.06MPa保持3小时。

实施例4

1)加工成型：将沙比利加工成最大维度长度不超过2cm的规则块体，得到木材试样。

2)碱处理：将步骤1)中的木材试样在浓度为5mol/L的氢氧化钾溶液浸泡10小时后，将试样转移至质量浓度为8mol/L的氢氧化钠水溶液中，于80℃加热搅拌12小时。

3)酸处理：将经步骤2)碱处理后的试样洗涤后放入浓度为3mol/L的盐酸中，于80℃加热搅拌8小时。

4)漂白：将经步骤3)酸处理后的试样置于浓度为2mol/L的次氯酸钠溶液中，室温搅拌12小时后取出，用水和乙醇反复漂洗至pH呈中性后进行干燥。

5)多肽涂覆：将经步骤4)漂白的试样置于多肽溶液中，采用真空浸涂工艺将多肽浸涂于孔壁上，干燥后得到多肽改性蜂窝状纤维素支架；其中，所述的多肽溶液是通过将1g L-赖氨酸、L-苯丙氨酸与L-丙氨酸的共聚物溶于100mL水中制备的。其中，所述的真空浸涂工艺具体过程为：先在负压为0.02MPa下保持30分钟、再于负压为0.04MPa保持2小时，最后在负压为0.06MPa保持2小时。

实施例5

1)加工成型：将橡木加工成最大维度长度不超过2cm的异形块体，得到木材试样。

2)碱处理：将步骤1)中的木材试样在浓度为6mol/L的氢氧化钾溶液浸泡6小时后，将试样转移至质量浓度为10mol/L的氢氧化钠水溶液中，于90℃加热搅拌11小时。

3)酸处理：将经步骤2)碱处理后的试样洗涤后放入浓度为5mol/L的盐酸中，于90℃加热搅拌7小时。

4)漂白：将经步骤3)酸处理后的试样置于浓度为1mol/L的次氯酸钠溶液中，室温搅拌7小时后取出，用水和乙醇反复漂洗至pH呈中性后进行干燥。

5)多肽涂覆：将经步骤4)漂白的试样置于多肽溶液中，采用真空浸涂工艺将多肽浸涂于孔壁上，干燥后得到多肽改性蜂窝状纤维素支架；其中，所述的多肽溶液是通过将3gL-赖氨酸的均聚物溶于100mL三氟乙酸中制备的。其中，所述的真空浸涂工艺具体过程为：先在负压为0.02MPa下保持15分钟、再于负压为0.04MPa保持3小时，最后在负压为0.06MPa保持1小时。

本发明中在制备多肽溶液时，溶剂还可以采用甲酸；L-谷氨酸-γ-苄酯、L-赖氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸的均聚物或几种的共聚物的制备方法均是本领域技术人员公知的。

近年来颇受重视的人工合成的多肽材料，具有优异的生物相容性，已广泛用于制备药物载体。将这种多肽材料与纤维素复合，将可兼具多肽优异的生物相容性和木材衍生纤维素的特殊多孔结构和高强度。为此，本发明提出一种技术，在去除木材中非纤维素成分的同时保持木材多孔结构，再在其孔壁表面涂覆一层多肽材料，获得一种理想的组织工程多孔支架材料。该支架以II型纤维素为蜂窝状孔骨架，孔壁涂覆有多肽涂层，具有优异的力学性能和生物相容性，孔隙率为80％～95％，蜂窝状孔的孔径范围为90μm～200μm，蜂窝状孔通过几个至几十个微米的微孔连通，压缩模量高达50MPa。