miR‑5001在制备治疗白血病的药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种microRNA在制备治疗白血病的药物中的应用。

背景技术：

白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他组织和器官，同时正常造血受抑制。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。据报道，我国各地区白血病的发病率在各种肿瘤中占第六位。临床上，手术或放疗针对局限白血病是有效的，但是对于转移者是难以治愈的，针对转移性白血病治疗仍然缺乏有效的药物。miRNA是调节基因表达的内源性非编码小分子RNA，在转录后水平对基因表达进行调控，参与细胞周期、凋亡、发育、分化和新陈代谢等生理过程。miRNA在细胞中表达失调

会导致癌症在内的多种疾病的发生，最新研究表明，一些miRNA在白血病中异常表达，但何种miRNA与白血病的发生、发展有关仍未达成共识。

因此有必要寻找与白血病发生、发展有关的miRNA，从而为临床上治疗转移性白血病提供一种有效手段。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种抑制白血病发展的含有miRNA的药物组合物，为临床上治疗转移性白血病提供可能。

本发明的发明人在对白血病的转移机制进行研究的过程中发现miR-5001在白血病系Daudi、Jurkat细胞中表达显著性降低，同时发现miR-5001能够抑制癌细胞增殖和迁移、促进细胞凋亡，miR-5001能够抑制裸鼠体内前列腺肿瘤细胞的转移。白血病细胞中miR-5001的表达量高低可作为癌细胞转移的一个分子标记物。

本发明的一个方面提供了miR-5001在制备治疗白血病的药物中的应用，所述miR-5001的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

可选的，所述应用包括制备抑制白血病细胞迁移、侵袭和增殖的药物。

可选的，所述应用包括将miR-5001与载体结合后与抗肿瘤药物和/或药物可接受的辅料复配制成药物组合物。

本发明的一个方面提供了miR-5001在制备抑制白血病细胞高转移性细胞系Daudi和/或Jurkat的迁移能力的药物中的应用。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物以miR-5001为活性成分，其中，所述miR-5001的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

可选的，所述药物组合物含有与载体结合的miR-5001和/或药物可接受的辅料。

在本发明所提供的药物组合物中，载体可以为本领域常用的适合于miRNA在宿主细胞中表达的载体种类，例如，所述载体可以为脂质体、壳聚糖或慢病毒表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为慢病毒表达载体，优选的，所述慢病毒表达载体可以为pWPXL、pMD2.G或psPAX2慢病毒表达载体。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述药物组合物还任选地包含一种或多种其他对白血病有效的肿瘤药物，可选的，所述药物组合物中含有铂类抗肿瘤药物，还可以包含以铂类抗肿瘤药为基础的联合化疗方案中常规使用的其他肿瘤药物，这些其他肿瘤药物是本领域技术人员所熟知的。

可选的，所述抗肿瘤药物为丝裂霉素、顺铂或卡铂。

当将miR-5001与铂类抗肿瘤药物联合使用时，铂类抗肿瘤药物的用量可以减少至常规化疗方案中用量的20-80％。

本发明中，所述药物组合物的给药途径为静脉内、动脉内灌注或局部注射等，也可以采用本领域技术人员所熟知的靶向给药技术进行肿瘤靶向给药。

本发明所提供的药物组合物能够通过miR-5001对白血病细胞转移能力的抑制作用来抑制白血病的发展过程，抑制效率高达50％，见图3。

附图说明

图1为miR-5001抑制细胞增殖及克隆形成实验结果。

其中，(A)为miR-5001转染Daudi，Q-PCR检测miR-5001的表达量；(B)为miR-5001转染Daudi后检测细胞增殖；(C)为细胞克隆形成能力检测。

图2为miR-5001能够抑制白血病细胞周期进程的柱状图。

图3为miR-5001抑制白血病细胞迁移和侵袭结果图。

其中，(A)为miR-5001转染Daudi细胞后Transwell实验检测细胞迁移和侵袭，视野内细胞迁移和侵袭的数量，(B)为miR-5001转染Jurkat细胞后Transwell实验检测细胞迁移和侵袭，视野内细胞迁移和侵袭的数量。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行详细说明。

在本发明中，术语“miR-5001”是指包含SEQ ID No.1所示序列或其同源序列的微小RNA。本领域中已知各种来源的miR-5001，例如，人、鼠、兔等，这些同源序列均包含在本发明的术语miR-5001中。本发明的术语中还包含上述天然存在的miR-5001序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，或经过生物学化学修饰后仍具有miR-5001生物活性的衍生RNA。

本发明中，人工合成的以及可以通过购买市售商品方式获得的具有miR-5001生物学活性的miR-5001模拟物也属于本发明的保护范围。

此外，本发明所述的miR-5001也可以为前体形式，miR-5001前体是指在被施用对象的细胞内或体内可以被加工成为miR-5001的前体。获得天然存在的miR-5001前体的方法为本领域技术人员所公知。

本领域技术人员公知，miR-5001的初始转录产物经过一系列的加工后，形成成熟的miR-5001。miR-5001前体只有在加工成成熟的miR-5001后才具有相应的生物学功能。

本发明所提供的组合物可以用于治疗白血病。所述组合物中含有有效量的本发明的miR-5001。

在本发明中，所述药物可接受的辅料包括各种赋形剂、稀释剂和佐剂。辅料其本身并不是必要的活性成分，且使用后没有过分的毒性。这类辅料包括但不限于：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇等。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物的形式适合于：直接裸microRNA注射法、脂质体包裹RNA直接注射法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法或复制缺陷腺病毒携带目的DNA法等。

本发明的miR-5001的有效剂量可以随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等进行相应的调整。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员综合各因素来确定。所述因素包括但不限于：miR-5001的药代动力学参数、被治疗的患者的健康状况、体重、给药途径等。

本发明中，所述药物组合物的给药途径为静脉内、动脉内灌注或局部注射等，也可以采用本领域技术人员所熟知的给药技术进行给药。

本发明的药物组合物可以与其它治疗手段联合，用于白血病的治疗。

实施例1

本实施例证明miR-5001对白血病细胞增殖及克隆形成的抑制作用

用转染试剂Lipofectamine 2000将miR-5001的模拟物miR-5001mimics(miR-5001模拟物)转染前列腺细胞系Daudi，并用Q-PCR检测其表达量如图1A，结果表明，miR-5001mimics转染DAUDI后细胞中miR-5001表达量显著性上升，证明mimics能够模拟miR-5001的表达。miR-5001mimics转染DAUDI细胞24、36、48、72和96h后，体外用CCK-8试剂盒检测细胞增殖，如图1B，miR-5001能够显著性抑制白血病细胞的增殖。

用软琼脂培养克隆形成实验检测细胞群体依赖性和增殖能力。取对数生长期的单层培养细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10％胎牛血清的1640培养液中备用。将细胞悬液倍数稀释接种于软琼脂培养板中，静置培养10-14天，计算克隆形成率，如图1C，结果表明miR-5001能够显著性抑制DAUDI的克隆形成能力。

实施例2

本实施例证明miR-5001抑制白血病细胞细胞周期进程的作用

将miR-5001mimics转染Daudi后，培养24小时后，收取细胞并进行PI染色，利用流式细胞术检测细胞周期的比例，其中，G1/G0为细胞静息期，S为DNA合成期，G2/M为有丝分裂期，G2/M比例越低，说明细胞增殖较慢。

结果见图2：miR-5001mimics转染Daudi能够显著降低G2/M期细胞比例，证明miR-5001能够显著抑制Daudi细胞周期进程，从而抑制细胞分裂。

实施例3

本实施例证明miR-5001对白血病细胞迁移和侵袭的抑制作用。

miR-5001mimics转染Daudi和Jurkat细胞，细胞培养箱中培养24小时，再将细胞转移至Transwell培养皿中，观察48小时。利用Transwell侵袭实验验证细胞的迁移和侵袭能力，如图3，结果表明miR-5001mimics转染Daudi和Jurkat后，导致两种白血病细胞迁移和侵袭能力明显下降。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。