pH敏感的聚乙二醇衍生物‑小分子药物偶联物聚合物胶束在炎症靶向递药系统中的用途的制作方法

本发明属于医药领域，涉及一种通过腙键连接的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束作为炎症靶向传递系统的用途。。

背景技术：

类风湿关节炎（RA）是一种累及多个关节的对称模式的慢性炎症性疾病，它是以滑膜的炎症过程为特征，这一过程最终导致关节软骨破坏、关节周围骨破坏，并最终改变关节的功能和完整性，除了有关节症状，很多病人还出现全身和关节外炎症。在RA病人中，疾病相关的残疾通常发生得比较早，大约35%的患者在被诊断为RA后的10年内就过早地失去劳动能力。此外，研究发现RA病人的寿命也较之正常人短。目前RA的治疗主要分为药物治疗，手术治疗和生物治疗，而药物治疗因其治疗费用低，给药方便等优点，受到很多RA患者的青睐。

糖皮质激素能够迅速控制RA病情和缓解疼痛，使得其在RA的药物治疗中占有重要地位。但是游离的糖皮质激素类（GCs）药物最大的缺点包括：水溶性差，需要反复给药，不具备靶向性且长期应用后全身毒副作用很大，因此病人依从性较差。因此，为了增加药物的安全性和有效性，炎症靶向给药系统的研究很有必要。

已有的靶向治疗RA的纳米载药系统包括载药脂质体，纳米粒，聚合物胶束等。这些纳米载体，可通过被动靶向作用将GCs药物递送到炎症关节中，从而达到治疗RA的目的。但这些纳米载药系统也存在以下问题：（1）脂质体和普通的物理包封的胶束在体内血循环中不稳定，其主要原因有：首先是会被网状内皮系统吞噬；其次是会与血浆中的许多成分（白蛋白、脂蛋白、IgG等）相互作用；再者，被血液稀释后容易导致药物提前泄漏；（2）由于上述脂质体、纳米粒和普通的物理包封的胶束在体内释药行为的不可控性，也就难以保证其疗效的充分发挥。（3）普通的纳米载药系统的载药量较低，使其临床应用受到限制。

本发明通过pH敏感的腙键将聚乙二醇衍生物支链末端的肼基团与小分子药物的羰基连接合成了pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物，并通过自组装方法制备成pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束，有效避免了上述普通纳米级载药系统的缺陷，并且能够有效地靶向到低pH的炎症区域。具有以下优点：（1）首先以pH敏感的腙键将聚乙二醇衍生物载体与小分子药物偶联后，再通过自组装方式制备成聚合物胶束，能够避免药物在体循环中提前被降解的缺陷，而且在聚乙二醇衍生物外壳的保护下能够达到长循环目的。此外，一方面能够减少药物在非炎症部位的分布，另一方面能够保护药物在血液循环中不被降解。（2）通过共价键将聚乙二醇衍生物载体与小分子药物偶联后制备成聚合物胶束，以确保胶束在血循环中时药物分子仍能够滞留于核内，进一步达到可调节释药行为，比如通过响应环境的变化的共价键，这样会引起更加特异和持续的药物释放，达到在靶向部位的蓄积。（3）通过响应炎症病理部位pH低于正常组织的特点，以pH敏感的腙键将聚乙二醇衍生物载体与小分子药物偶联后，进一步通过自组装方式制备成聚合物胶束，相比较普通的物理包封的纳米级给药系统仅依赖于被动靶向释药行为，该体系能够随着环境pH的变化而达到主动释药目的。（4）相比较传统的直链聚乙二醇载体而言，我们合成的聚乙二醇衍生物能够提供更多的化学修饰位点，从而极大地提高载药量，此外，通过改变聚乙二醇衍生物支链部分肼基团的数目还可以自由调节载药量。

现有技术中，CN201310756002.9和CN2013755517.7分别利用腙键连接聚乙二醇单甲醚-聚乳酸和单端酚羟基羰基化的姜黄素以及双端酚羟基羰基化的姜黄素，制备成pH敏感的姜黄素载药胶束（单链）和pH敏感的姜黄素载药胶束（双链），然而这两种载药胶束中具有如下问题：①所述化学式中必须加入PLA才能增强疏水性来实现胶束，然而我国FDA并未批准将聚乳酸（PLA）用于静脉注射药用辅料，其使用可能造成不可评估的风险；②两种载药胶束的载药量分别不超过15%和5%，临床使用价值有待提高。

现有技术中，CN201310229332.2披露了通过腙键和二硫键连接的双功能聚乙二醇-阿霉素偶联物及其制备方法，该偶联物具有pH敏感和癌细胞内还原性的药物控制释放功能，并能自组装成纳米药物，具有通过EPR效应靶向肿瘤组织的能力。然而，该偶联物中的聚乙二醇是直链结构，只能在一端连接一个小分子药物，所以该偶联物的最大分子量是3021.52，此时载药量是17.4%。而据研究，当大分子药物的分子量低于40000时，肾脏对其清除率非常大，所以该类偶联物难以达到肿瘤靶向的目的。

目前，尚未见关于利用腙键连接的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束靶向炎症的报道。本发明中，利用腙键连接聚乙二醇衍生物和小分子药物，并通过自组装制备成聚合物胶束，相比较现有的用于肿瘤靶向的pH敏感的聚乙二醇-小分子药物偶联物及其制剂来讲，所合成的炎症靶向的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束最大的优势在于，通过在多个支链末端接上肼基团，能够显著增加与带有羰基的小分子药物连接的化学修饰位点，这就能够极大地提高对小分子药物的载药量（34%～40%）。

技术实现要素：

本发明人通过创造性的研究发现，式（I）结构的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束具有炎症靶向作用。

本发明的发明构思：（1）通过pH敏感的腙键将聚乙二醇衍生物载体支链末端的肼基团与小分子药物的羰基偶联后，进一步通过自组装方法制备成pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物聚合物胶束，能够避免药物在体循环中提前被降解的缺陷，而且在聚乙二醇衍生物外壳的保护下能够达到长循环目的。（2）当到达炎症部位时，聚合物胶束通过ELVIS被动靶向到炎症滑膜组织，pH敏感的腙键可特异性地在pH降低的炎症滑膜中断裂，从而释放出小分子药物，增加药物的蓄积。采用本发明中的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束不仅极大地提高小分子药物D在低pH的炎症部位的浓度，还延长了其在低pH的炎症部位的时间或提高了其抗炎效果。

本发明的目的在于提供pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束在制备治疗炎症靶向药物中的用途。

所制备的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束是利用炎症部位的通透性增加的脉管系统的渗漏作用和随后的炎症细胞介导的滞留作用（Extravasation through Leaky Vasculature and subsequent Inflammatory cell-mediated Sequestration，ELVIS）而增加纳米级给药系统的靶向性。具体的机制：在RA慢性炎症环境，炎症介质可以持久地过量地表达，导致了“漏的”脉管系统，这和实体肿瘤相似。此外RA病人血循环中存在大量的白细胞，这些白细胞会增加对偶联物的摄取，然后这些细胞进一步在炎症细胞浸润，因此促进了偶联物在炎症组织中的蓄积。

本发明的另一个目的在于提供一种具有较高炎症靶向性能的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束。通过pH敏感的腙键来连接聚乙二醇衍生物的肼基团和小分子药物的羰基，并通过自组装方法制备成pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物聚合物胶束，该聚合物胶束能够在低pH的炎症环境中释放出小分子药物，从而使药物能够主动地靶向到炎症部位，降低药物在全身其他部位的浓度和副作用，可减低给药剂量和增加疗效。

本发明提供了一个式（I）的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物，其中通过pH敏感的腙键将A部分的聚乙二醇衍生物支链末端的肼基团与B部分小分子药物的羰基连接，而且 A部分的聚乙二醇衍生物作为B部分小分子药物D的炎症靶向修饰基团：

式（I）

其中：

n=1至200的任意整数；

m=1至100的任意整数；

R₁为氢、羟基、氨基、烷氧基、巯基、乙酸酯基、乙酰氨基、叶酸等靶向配体；

烷氧基含碳数为1-10；

通过pH敏感的腙键将A部分的聚乙二醇衍生物支链末端的肼基团与B部分小分子药物的羰基连接；其中，B部分小分子药物的羰基为药物自身具有或通过修饰添加；

氨基为游离氨基；

X为巯基乙酸甲酯、巯基丙酸甲酯中的一种；

药物D优选是分子量小于1000道尔顿的用于治疗炎症疾病的化学合成药物或治疗炎症疾病的天然药物单体。

本发明中，所述小分子药物D为疏水性药物，包含但是不限于：抗炎症药物和抗肿瘤药物等。

抗炎药物（如泼尼松龙、地塞米松、氢化可的松、醋酸可的松，甲基强的松龙，倍他米松，倍氯米松，来氟米特，以及类似物和衍生物）。

抗肿瘤药物（如阿霉素，柔红霉素，放线菌素D，表阿霉素，表柔比星，吡柔比星以及类似物和衍生物）。

所连接的X包含但是不限于：巯基乙酸甲酯、巯基丙酸甲酯的一种或多种。

本发明的另一个目的是提供了式（I）中A部分的聚乙二醇衍生物作为B部分的小分子药物D的炎症靶向修饰基团的用途。

本发明的另一个目的是提供了一种制备式（I）化合物的方法，首先以以Boc-氨基乙醇（此处Boc-氨基也可以为羟基、氨基、烷氧基、巯基、乙酸酯基、乙酰氨基或者叶酸）为引物，以氢化钠为活化剂，在60°C相继进行环氧乙烷和烯丙基缩水甘油醚开环反应，然后再与巯基乙酸甲酯（或巯基丙酸甲酯）在偶氮二异丁腈的催化催化下，合成animo-(EO)n-(AGE)m-O-CH₃，接着该化合物与水合肼连接，合成末端带有肼基团的聚乙二醇衍生物。最后在醋酸酸性条件下，将A部分的聚乙二醇衍生物支链末端的肼修饰基团与B部分的小分子药物D的活性基团羰基采用pH敏感的腙键连接。

本发明提供了一种pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合胶束，由本发明所述的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物自组装形成聚合胶束。

本发明提供了一种如式（I）的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的自组成形成的聚合物胶束：

式I

n=1至200的任意整数；

m=1至100的任意整数；

R₁为氢、羟基、氨基、烷氧基、巯基、乙酸酯基、乙酰氨基、叶酸等靶向配体；

烷氧基含碳数为1-10；

氨基为游离氨基；

X为巯基乙酸甲酯、巯基丙酸甲酯中的一种；

通过pH敏感的腙键将A部分的聚乙二醇衍生物支链末端的肼基团与B部分小分子药物的羰基连接；B部分小分子药物的羰基为药物自身具有或通过修饰添加。

本发明进一步提供了制备本发明的炎症靶向pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束的方法：

（1）将小分子药物上的活性基团羰基与聚乙二醇衍生物支链末端的活性基团肼基团在催化剂的作用下通过pH敏感的腙键连接；

（2）通过自组装制备成pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束。

作为本发明的具体实施方案和非限制性的说明例，下面将以上述糖皮质激素泼尼松龙和抗肿瘤药物柔红霉素为例，对本发明的实施技术路线进行说明，但是整体的实施方案不限于泼尼松龙和柔红霉素。

糖皮质激素具有抗炎、抗休克、抗病毒、免疫抑制等作用，常用的有泼尼松龙、地塞米松、倍他米松，临床上广泛用于炎症疾病。但其毒副作用不容忽视：首先对消化系统损伤较大，常引起激素性胰腺炎、激素性溃疡及小肠穿孔；其次，引起糖、脂、蛋白质、水和电解质代谢紊乱；第三，其免疫抑制作用降低细胞免疫和体液免疫功能，使机体更易受外来病原菌侵害。RA炎症关节局部的一个比较独有的特征是其pH值比正常部位偏低，这是由于在RA关节内以及关节周围的炎症反应促使其局部环境呈弱酸性，也称酸中毒。基于炎症关节低pH的特点，我们采用pH敏感的腙键将聚乙二醇衍生物与小分子药物偶联形成pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物，并通过自组装形成聚合物胶束。该聚合物胶束能够在低pH的炎症环境中释放出小分子药物，从而使药物能够主动地靶向到炎症部位，降低药物在全身其他部位的浓度和副作用，可减低给药剂量和增加疗效。所以，为了增强泼尼松龙局部抗炎作用，减小其毒副作用，本实验中采用pH敏感的腙键将聚乙二醇衍生物与泼尼松龙偶联后，并通过自组装方式制备成pH敏感的聚乙二醇衍生物-泼尼松龙偶联物的聚合物胶束，对于促进泼尼松龙的炎症靶向非常必要。

本技术路线中，以pH敏感的腙键将聚乙二醇衍生物与泼尼松龙药物连接，即得pH敏感的聚乙二醇衍生物-泼尼松龙偶联物I。

I

pH敏感的聚乙二醇衍生物-泼尼松龙偶联物及聚合物胶束制备方法简述如下：

首先将氨基乙醇用BOC酸酐保护得到BOC-氨基乙醇，接着BOC-氨基乙醇分别通过与EO和AGE两步开环共聚反应，得到BOC-N-(EO)n-(AGE)m。然后BOC-N-(EO)n-(AGE)m通过在三氟乙酸/二氯甲烷（v/v: 5/2）溶液中脱掉BOC保护基团，得产物animo-(EO)n-(AGE)m。取上述产物适量溶于THF中，进一步与巯基乙酸甲酯在偶氮二异丁腈（AIBN）的催化下，在氮气保护下回流反应5 h，旋蒸后得到产物animo-(EO)n-(AGE)m-OCH₃，该产物再接着与水合肼在THF溶液中回流反应7 h，旋蒸得产物animo-(EO)n-(AGE)m -OCH₂-NH-NH₂（聚乙二醇衍生物）。然后将该产物与泼尼松龙溶解于干燥的DMSO中，加入醋酸和无水硫酸钠，在室温下避光搅拌反应48 h后，过滤，滤液经蛋白纯化仪分离纯化，最后冻干，即得产物pH敏感的聚乙二醇衍生物-泼尼松龙偶联物。取上述化合物适量，溶于双蒸水中，通过自组装制备成pH敏感的聚乙二醇衍生物-泼尼松龙偶联物的聚合物胶束。

柔红霉素为第一代蒽环类抗肿瘤抗生素，是一种周期非特异性化疗药。主要用于各种类型的急性白血病（包括粒细胞性、淋巴细胞性和单核细胞性以及粒-单核细胞性）、红白血病、慢性粒细胞性白血病、恶性淋巴瘤，也可用于神经母细胞病、尤因肉瘤和肾母细胞瘤等。临床使用较广泛但由于柔红霉素具有严重的毒副作用，使其临床上的应用受到限制。其主要的不良反应包括：1. 心肌毒性：如出现心律异常、气急和下肢浮肿，则应警惕充血性心力衰竭的可能；2.血液系统毒性：白细胞减少和血小板减少；3. 高尿酸血症和肾脏损；4. 骨髓抑制严重；5.可引起肝脏中心静脉及肝小叶静脉闭塞导致黄疸、肝大、肝性脑病及腹水。实体肿瘤内部的缺氧状态使肿瘤细胞无氧糖酵解产生乳酸，而肿瘤内部血管系统的缺乏使产生的乳酸不能充分排出, 导致肿瘤局部环境pH偏低。基于肿瘤部位低pH的特点，为了增强柔红霉素局部抗肿瘤作用，减小其毒副作用，本实验中采用pH敏感的腙键将聚乙二醇衍生物与柔红霉素偶联后，并通过自组装方法制备成pH敏感的聚乙二醇衍生物-柔红霉素偶联物的聚合物胶束，该聚合物胶束能够在低pH的肿瘤环境中释放出柔红霉素，从而使柔红霉素能够主动地靶向到肿瘤部位，降低其在全身其他部位的浓度和副作用，可减低给药剂量和增加疗效。所以，对于促进柔红霉素的肿瘤靶向非常必要。

本技术路线中以聚乙二醇衍生物作为肿瘤靶向修饰基团，药物为柔红霉素，通过pH敏感的腙键将上述载体和药物偶联后，得产物pH敏感的聚乙二醇衍生物-柔红霉素偶联物II，其结构式如下：

II

pH敏感的聚乙二醇衍生物-柔红霉素偶联物及聚合物胶束制备方法简述如下：

首先将氨基乙醇用BOC酸酐保护得到BOC-氨基乙醇，接着BOC-氨基乙醇分别通过与EO和AGE两步开环共聚反应，得到BOC-N-(EO)n-(AGE)m。然后BOC-N-(EO)n-(AGE)m通过在三氟乙酸/二氯甲烷（v/v: 5/2）溶液中脱掉BOC保护基团，得产物animo-(EO)n-(AGE)m。取上述产物适量溶于THF中，进一步与巯基乙酸甲酯在偶氮二异丁腈（AIBN）的催化下，在氮气保护下回流反应5 h，旋蒸后得到产物animo-(EO)n-(AGE)m-OCH₃，该产物再接着与水合肼在THF溶液中回流反应7 h，旋蒸得产物animo-(EO)n-(AGE)m -OCH₂-NH-NH₂（聚乙二醇衍生物）。然后将该产物与柔红霉素溶解于干燥的DMSO中，加入醋酸和无水硫酸钠，在室温下避光搅拌反应48 h后，过滤，滤液经蛋白纯化仪分离纯化，最后冻干，即得产物pH敏感的聚乙二醇衍生物-柔红霉素偶联物。取上述化合物适量，溶于双蒸水中，通过自组装制备成pH敏感的聚乙二醇衍生物-柔红霉素偶联物的聚合物胶束。

采用pH敏感的腙键将泼尼松龙或柔红霉素与聚乙二醇衍生物偶联，并通过自组装方式制备成上述偶联物的聚合物胶束。

本发明还提供了上述聚合物胶束的临床上可以接受的制剂，例如溶液剂、气雾剂或混悬剂、注射剂，优选注射剂。

本发明的另一个目的为pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束及其制剂在制备治疗炎症疾病或肿瘤的药物中的应用。

本发明另一个目的是pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束及其制剂在制备预防和控制类风湿关节炎及其他炎症疾病和肿瘤的药物中的应用。

pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束是一种适宜的炎症靶向给药系统：① pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束在聚乙二醇衍生物外壳的保护下，增加在血液循环中的稳定性，达到长循环作用；②pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束可以通过ELVIS被动靶向到炎症滑膜中；③ pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束在体内低pH的炎症部位可降解，释放出小分子药物以发挥药物作用；④ pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束在体内的药物释放具有pH依赖性，因此释药行为可控制；⑤其载药量提高，连接方法简单，易于大规模生产，生产成本低，具有良好的应用前景。

本发明的有益效果

本发明的目的还在于pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束具有显著提高了B部分小分子药物D在低pH的炎症部位或低pH的肿瘤部位的浓度或延长了其在低pH的炎症部位或低pH的肿瘤部位的时间或提高其抗炎或抗肿瘤效果的用途。

为了证明本发明的pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束的炎症靶向性，故对上述聚合物胶束进行了体内药物分布实验。实验证明上述pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束较原药在相同给药方式和给药剂量下在低pH的炎症部位有较高的分布浓度。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1 pH敏感的聚乙二醇衍生物-泼尼松龙偶联物的合成路线。

图2 pH敏感的聚乙二醇衍生物-柔红霉素偶联物的合成路线。

图3 pH敏感的聚乙二醇衍生物-泼尼松龙偶联物的聚合物胶束分别在pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH6.8和pH7.4条件下的体外释放图。

图4 pH敏感的聚乙二醇衍生物-泼尼松龙偶联物的聚合物胶束及泼尼松龙原药尾静脉给药1 小时，在血浆、各组织及脏器浓度分布图。

图5 pH敏感的聚乙二醇衍生物-泼尼松龙偶联物的聚合物胶束及泼尼松龙原药尾静脉给药后在炎症关节的经时分布图

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。

实施例1

首先将β-氨基乙醇(7.37 g, 0.12 mol)，用BOC酸酐(32.72 g, 0.15 mol)保护得到BOC-氨基乙醇。接着取BOC-氨基乙醇(0.88 g, 5 mmol)，分别通过与EO(100 mL, 1.98 mol)和AGE(30.1 g, 0.26 mol)两步开环共聚反应，得到BOC-N-(EO)n-(AGE)m。然后BOC-N-(EO)n-(AGE)m通过在三氟乙酸/二氯甲烷（v/v: 5/2）溶液中脱掉BOC保护基团，得产物animo-(EO)n-(AGE)m。取上述产物animo-(EO)n-(AGE)m (6.72 g, 7.53 mmol C=C)溶于THF中，进一步与巯基乙酸甲酯在偶氮二异丁腈（AIBN）的催化下，在氮气保护下回流反应5 h，旋蒸后得到产物animo-(EO)n-(AGE)m-OCH₃。接着上述所有产物再接着与水合肼(37.7 g, 36.6 mL, 753 mmol)在THF溶液中回流反应7 h，旋蒸得产物animo-(EO)n-(AGE)m -OCH₂-NH-NH₂（聚乙二醇衍生物）。最后将聚乙二醇衍生物(189 mg, 176 μmol hydrazide)与泼尼松龙(21 mg, 58.3 μmol)溶解于干燥的DMSO中，加入醋酸和无水硫酸钠，在室温下避光搅拌反应48h后，过滤，滤液经蛋白纯化仪分离纯化，最后冻干，即得产物pH敏感的聚乙二醇衍生物-泼尼松龙偶联物。

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 0.90 (t, 3H), 1.54 (m, 2H), 1.779 (m, 2H), 2.635 (t, 2H), 3.235 (s, 2H), 3.37 (t, 2H), 3.644 (s, 3H)，3.676（m, 1H），5.426 (s, 1H)，5.923 (s, 1H)，6.176 (dd, 1H)，7.323 (dd, 1H), 9.113（m, 1H）。

实施例2

首先将β-氨基乙醇(7.37 g, 0.12 mol)，用BOC酸酐(32.72 g, 0.15 mol)保护得到BOC-氨基乙醇。接着取BOC-氨基乙醇(0.88 g, 5 mmol)，分别通过与EO(100 mL, 1.98 mol)和AGE(30.1 g, 0.26 mol)两步开环共聚反应，得到BOC-N-(EO)n-(AGE)m。然后BOC-N-(EO)n-(AGE)m通过在三氟乙酸/二氯甲烷（v/v: 5/2）溶液中脱掉BOC保护基团，得产物animo-(EO)n-(AGE)m。取上述产物animo-(EO)n-(AGE)m (6.72 g, 7.53 mmol C=C)溶于THF中，进一步与巯基乙酸甲酯在偶氮二异丁腈（AIBN）的催化下，在氮气保护下回流反应5 h，旋蒸后得到产物animo-(EO)n-(AGE)m-OCH₃。接着上述所有产物再接着与水合肼(37.7 g, 36.6 mL, 753 mmol)在THF溶液中回流反应7 h，旋蒸得产物animo-(EO)n-(AGE)m -OCH₂-NH-NH₂（聚乙二醇衍生物）。最后将聚乙二醇衍生物(189 mg, 176 μmol hydrazide)与柔红霉素(31 mg, 58.3 μmol)溶解于干燥的DMSO中，加入醋酸和无水硫酸钠，在室温下避光搅拌反应48h后，过滤，滤液经蛋白纯化仪分离纯化，最后冻干，即得产物pH敏感的聚乙二醇衍生物-柔红霉素偶联物。

实施例3

分别精密称取上述两种pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物30 mg，溶于7.5 ml双蒸水中，然后再25℃沿着同一个方向搅拌0.5小时，即得4 mg/ml pH敏感的聚乙二醇衍生物-小分子药物偶联物的聚合物胶束。

实施例4

首先, 取1 mL 4 mg/ml的 pH敏感的聚乙二醇衍生物-泼尼松龙偶联物的聚合物胶束5份置于透析袋（MW1000）中。然后上述5份装有药物的透析袋分别被浸没于装有等量 pH5.5, pH6.0, pH6.5, pH6.8 和pH7.4的醋酸盐缓冲液的圆底烧瓶中，然后在37 °C速度为每分钟100 rpm的摇床中孵育。分别在特定的时间点取300 μL 释放介质进样HPLC测定，同时补充等量的缓冲液于圆底烧瓶中，所有的样品均测定60小时内的释放率 (n = 3)。

试验例1

小鼠的RA CIA模型的建立

DBA/1小鼠，体重20 ± 2 g，雄性，于第0天，取等体积的牛二型胶原蛋白和完全弗氏佐剂制备成乳剂（上述乳剂滴入冰水中成滴状不散开视为乳化终点），每只小鼠各皮下注射100 μl。然后于第21天进行第二次boost，取等体积的牛二型胶原蛋白和不完全弗氏佐剂制备成乳剂（上述乳剂滴入冰水中成滴状不散开视为乳化终点），每只小鼠各皮下注射50 μl，第50天挑选出发病的小鼠进行体内分布实验。

小鼠体内分布实验

将上述发病的DBA/1小鼠随机分为两大组，每组30只。第一大组为游离泼尼松龙对照组，以6只为一小组分为5个小组，按15.0 mg/kg(泼尼松龙/体重)尾静脉注射给药；第二大组为pH敏感的聚乙二醇衍生物-泼尼松龙偶联物的聚合物胶束实验组，以6只为一小组分为5个小组，按15mg/kg(按照剂量相当于泼尼松龙15mg/kg来计)尾静脉注射给药。上述两组均于给药后0.5, 1, 2, 4和 6 h分别取一组，眼眶取血后处死，全血于4500 rpm/min离心5 min，取血浆置-40℃冷冻待用。立即分离心、肝、脾、肺、肾组织各加入两倍量的生理盐水匀浆，然后置于-40℃冷冻待用。然后剪下关节组织，剪碎后，各加入两倍量的生理盐水匀浆，离心，取上清，置于-40℃冷冻待用。将血浆各脏器匀浆及关节组织匀浆解冻后，分别按样品预处理方法和样品测定方法进行处理和测定。体内分布实验结果见图4。

取小鼠血浆0.3 ml，组织匀浆0.3 ml，置于5 ml EP管中，再加10 μl 6N HCl，涡旋5 min，然后加入等量的6N NH₄OH，涡旋5 min。加入300 μl 乙腈溶液，涡旋萃取5 min，12000 r/min，离心10 min，精密吸取上清液50 μl进样，记录色谱图和药物的峰面积。HPLC检测条件：色谱柱：Dikma Diamonsil column，ODS-C₁₈，5 μm，150*4.6 mm，梯度洗脱，流动相0.05 mol/L柠檬酸三钠缓冲液（磷酸调pH4.1）从70%到30%，检测波长：254 nm，柱温：35 ℃，流速：1 ml/min，检测时间：7.2 min，进样量：50 μl。

图3的结果表明pH敏感的聚乙二醇衍生物-泼尼松龙偶联物的聚合物胶束在偏酸性的pH 5.5和pH6.0的环境中，泼尼松龙的释放率远快于在偏中性的pH6.5，pH6.8和pH7.4环境中的释放率。在pH 5.5和pH6.0时，60小时内药物释放率达到100%，甚至在10小时内药物释放率接近80%。在pH6.5时，60小时内药物释放率低于70%，然而在偏中性的pH6.8和pH7.4时，60小时内药物的释放率低于40%，以上结果均表明pH敏感的聚乙二醇衍生物-泼尼松龙偶联物的聚合物胶束的体外释放具有pH依赖性。

图4的结果表明pH敏感的聚乙二醇衍生物-泼尼松龙偶联物的聚合物胶束尾静脉给药后，在关节的药物浓度远高于泼尼松龙原药组，1小时的药物浓度时其3.36倍。

图5的结果表明，pH敏感的聚乙二醇衍生物-泼尼松龙偶联物的聚合物胶束尾静脉给药后不同时间点（0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h），在关节的药物浓度均远高于泼尼松龙原药组，分别是泼尼松龙原药的2.58倍，3.36倍，4.89倍，7.41倍，40.8倍。

综上所述，通过采用聚乙二醇衍生物与泼尼松龙化学连接后形成pH敏感的聚乙二醇衍生物-泼尼松龙偶联物，通过自组装制备成聚合物胶束，能够将药物特异地传递到低pH的炎症关节，提高药物在低pH的炎症关节部位的浓度和抗炎效果，可降低给药剂量，减少毒副作用。