苦豆碱在制备预防和治疗肺动脉高压药物中的用途的制作方法

本发明涉及苦豆碱的应用，尤其涉及苦豆碱在制备预防和作为治疗肺动脉高压药物中的用途。

背景技术：

肺动脉高压是一组以肺动脉压力、肺血管阻力进行性增高，进而产生右心室后负荷增大，肺循环血流减少为特征的临床综合征，持续增加的肺血管阻为可导致右心室衰竭，最终导致死亡。研究发现，肺动脉高压的发病机制包括肺血管内皮功能紊乱、肺部炎症反应、肺动脉血管收缩、肺血管壁重构和平滑肌细胞增殖与凋亡失衡等。就目前治疗肺动脉高压的药物来说，其长期有效性较差。因此，寻找具有抑制甚至逆转肺动脉高压发展且价格低廉的药物，具有深远的研究意义。

近年来，越来越多的证据表明氧化应激在肺动脉高压的发展中起到重要作用。有研究表明，白芷、氧化苦参碱等药物可以通过影响氧化应激从而抑制肺动脉高压。此外，磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶(NOX)作为一种活性氧物质的生成酶，成为肺动脉高压研究中的热点。研究证实可以药物可以通过降低NOX的表达而抑制肺动脉高压、高血压等心血管疾病的发展。其中NOX-4所介导的活性氧物质生成增多可促进肺血管平滑肌细胞的增生和肥大，诱导肺血管重构和肺动脉高压的发生与发展，而NOX-2源性活性氧物质生成增多是导致肺血管内皮损伤的重要原因。所以，对抗氧化应激和NOX-2、NOX-4的表达可能是治疗肺动脉高压的靶点。

苦豆子在宁夏有大量的野生和人工种植资源，是宁夏回族自治区“十二五科技发展规划”中重点支持大面积规范化种植和优先深度开发并产业化的特色植物之一，传统具有清热解毒、祛风燥湿、抗菌消炎、止痛杀虫等作用。苦豆碱是从苦豆子中提取的一种主要生物碱，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎和神经保护等作用。在本课题组之前的研究中，苦豆碱通过抗氧化应激治疗神经性疼痛。但是否对肺动脉高压的发生与发展具有抑制作用，其作用机制是否与抗氧化应激有关，目前尚未阐明。

技术实现要素：

本发明的目的是通过对苦豆碱的药理作用研究，提供苦豆碱作为治疗肺动脉高压药物的用途。

本发明通过以下技术方案来实现发明目的：

本发明提供的苦豆碱作为治疗肺动脉高压药物的用途，所述苦豆碱的结构式如式(1)所示：

具体地，所述肺动脉高压为右心室肥厚、肺小动脉重构等多方面的改变，表现为肺动脉压力的升高。苦豆碱的用量在不引起毒副作用的范围内，可根据用药途径、患者年龄、体重、体表面积、所治疗疾病的严重程度等有所变化，每日一次或多次使用，本发明经过实验数据确定了所述苦豆碱的单次应用量为大鼠25-100mg/kg，人3.97mg/kg–15.87mg/kg；标准体重人70kg单次使用量277.8mg-1111.1mg。

优选地，所述苦豆碱单次应用剂量为大鼠50-100mg/kg。

优选地，所述苦豆碱单次应用剂量为大鼠100mg/kg。

具体地，所述苦豆碱单次应用剂量仅限于不引起血糖降低的剂量。

具体地，所述药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型或注射剂型。

本发明提供的苦豆碱作为治疗肺动脉高压药物的用途具有以下有益效果：

(1)苦豆碱显著降低野百合碱所致肺动脉高压大鼠的肺动脉压力，减少右心室的肥大，抑制肺中小动脉的肥厚；

(2)苦豆碱减弱氧化应激脂质过氧化作用，促进氧自由基清除剂含量的恢复，显著抑制了肺动脉高压大鼠肺组织中NOX-2、NOX-4蛋白的表达。

本发明首次证实，苦豆碱具有治疗野百合碱致大鼠肺动脉高压的作用，可用于制备肺动脉高压的治疗药物。

附图说明

图1为苦豆碱对野百合碱致肺动脉高压大鼠mPAP、RVSP及RVHI的影响；

(mPAP：肺动脉平均压；RVSP：右心室收缩压；RVHI：右心室肥厚指数)

图2为苦豆碱影响野百合碱致肺动脉高压大鼠肺小动脉重构的H.E染色图(图2A为对照组，图2B为模型组，图2C为苦豆碱低剂量组，图2D为苦豆碱中剂量组，图2E为苦豆碱高剂量组，图2F为西地那非组)；

图3为苦豆碱对野百合碱致肺动脉高压大鼠肺小动脉WT％、WA％指标的影响；

(WT％：肺小动脉管壁厚度占血管外径的百分比；WA％：肺小动脉管壁面积占血管总面积的百分比)

图4为苦豆碱影响野百合碱致肺动脉高压大鼠肺小动脉α-SMA染色图(图4A为对照组，图4B为模型组，图4C为苦豆碱低剂量组，图4D为苦豆碱中剂量组，图4E为苦豆碱高剂量组，图4F为西地那非组)；

图5为苦豆碱对野百合碱致肺动脉高压大鼠肺小动脉α-SMA表达的影响；

(α-SMA：α平滑肌肌动蛋白)

图6为苦豆碱对野百合碱致肺动脉高压大鼠肺组织中MDA含量、SOD、GSH-PX、CAT、T-AOC活性的影响；

(SOD：超氧化物歧化酶；CAT：过氧化氢酶；T-AOC：总抗氧能力；GSH-PX：谷胱甘肽过氧化物酶；MDA：丙二醛)

图7为苦豆碱对野百合碱致肺动脉高压大鼠肺组织中NOX-2表达水平的影响；

(NOX-2：磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶-2)

图8为苦豆碱对野百合碱致肺动脉高压大鼠肺组织中NOX-4表达水平的影响。

(NOX-4：磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶-4)

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

苦豆碱作为治疗肺动脉高压药物的用途，苦豆碱的结构式如式(1)所示：

其中，苦豆碱单次应用剂量为大鼠25mg/kg，药物的剂型为口服剂型。

实施例2

苦豆碱作为治疗肺动脉高压药物的用途，苦豆碱的结构式如式(1)所示：

其中，苦豆碱单次应用剂量为大鼠50mg/kg，药物的剂型为口服剂型。

实施例3

苦豆碱作为治疗肺动脉高压药物的用途，苦豆碱的结构式如式(1)所示：

其中，苦豆碱单次应用剂量为大鼠100mg/kg，药物的剂型为口服剂型。

实施例1-3的效果可以通过下面的实验及其结果得到证实：

一、实验材料

1.1动物处理

180-220g雄性SD大鼠，购自宁夏医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：NCXK(宁)2015-0005。喂养条件包括标准饲料、自来水、室温保持在(21±2)℃、湿度50-60％、每日光照与黑暗时间各12小时。实验前，将动物置于实验环境适应7天。

1.2实验药品和仪器

苦豆碱(购自宁夏都顺公司)，以生理盐水配制。野百合碱(购自Sigma公司)；SOD、CAT、GSH-PX、T-AOC、MDA试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)；兔抗NOX-2、NOX-4单克隆抗体(购自Abcam公司)，兔抗α-SMA单克隆抗体(购自Proteintech公司)；酶标仪(1510，Thermo Fisher公司)，电泳仪、电转仪(Powerpac basic，美国Bio-Rad公司)，凝胶成像分析仪(JS-860B，上海培清公司)，MPA心功能分析仪(上海奥尔科特公司)。

1.3实验动物分组和给药

雄性SD大鼠，体重180-220g，随机分为6组：对照组、肺动脉高压模型组、模型+西地那非阳性药物(30mg/kg)组、模型+苦豆碱不同剂量(25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)组。肺动脉高压模型组、模型+西地那非阳性药物组、模型+苦豆碱不同剂量组在实验第1天颈背部皮下注射野百合碱溶液(60mg/kg)造模，对照组颈背部皮下注射等量生理盐水。苦豆碱各剂量组和阳性药组造模后21天连续给药21天(给药量0.1ml/10g，灌胃，每天一次)，对照组和模型组大鼠给予等量溶剂，给药期间大鼠饮食和饮水不受限制。

1.4野百合碱致大鼠肺动脉高压模型的制备

大鼠在造模之前，配制60mg/kg野百合碱溶液：300mgMCT先溶于1.8ml 1M HCl,然后加入3-4ml双蒸水，以1M NaOH调PH至7.4，最后双蒸水补至15ml。然后以0.1ml/10g的给药量采用颈背部皮下注射造模：左手拇指与食指轻捏住大鼠颈部背侧松弛的皮肤，将注射针自大鼠头部向其尾部的方向，插入左手拇食指间夹住的颈背侧皮肤处。在注射后将大鼠放回鼠笼，自由饮食和饮水，21天后造模完成。对照组动物颈背部皮下注射等量生理盐水。

二、实验过程

(一)血流动力学检测

1.1实验方法：

1.1.1右心导管法测量右心室收缩压和肺动脉平均压：

将大鼠称重后，以20％乌拉坦1ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，待呼吸均匀稳定后，固定于手术台上，打开MPA心功能分析仪，小心分离右侧颈外静脉，在右颈外静脉远心端丝线结扎，用镊子柄承在血管下，以眼科剪于丝线结扎点近心4mm处向近心端呈45°角斜行剪开血管直径的1/3，迅速沿此切口方向将导管插入血管，利用另一根结扎线结扎导管(结扎松紧适度，既要保证切口处无渗血，又要保证导管可以顺利地插入)向前缓慢推进导管，如遇阻力不可硬推，要缓慢旋转调整导管，改变其尖端朝向，一旦合适即可根据压力波形曲线压力值和导管进入的长度来判断导管口所处的位置，依次进入颈总静脉-上腔静脉-右心房-右心室，当出现典型右心室波形时稳定片刻后测定并记录右心室收缩压(RVSP)，再将导管送入肺动脉，出现典型肺动脉波形时稳定片刻后记录肺动脉平均压(mPAP)，测定完毕后将导管从肺动脉中退出。

1.2实验结果：

由表1和图1可知，肺动脉高压模型组大鼠在造模后mPAP、RVSP等血流动力学指标相对对照组有明显的升高。在连续灌胃给予苦豆碱治疗之后mPAP、RVSP等指标均有下降，当剂量增加作用增强，至剂量100mg/kg时保护作用最强(与模型组对比P﹤0.01)，实验并设西地那非(30mg/kg)阳性药对照组。提示苦豆碱(100mg/kg，50mg/kg，25mg/kg)具有减轻野百合碱所致大鼠肺动脉高压的作用，对大鼠肺动脉高压的保护作用呈剂量相关性。

表1.苦豆碱对野百合碱致肺动脉高压的保护作用(n＝6)

(与对照组比较：^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01)

(二)右心室肥厚指数及肺指数检测

2.1实验方法：

在血流动力学指标检测完成之后，取出完整的心肺，剪除血管根部和心房等组织，分离心肺，分离右心室(RV)和左心室加室间隔(LV+S)，用滤纸吸去表面水分后，称取肺组织重、右心室重和左心室加室间隔重，计算肺指数和右心室肥厚指数(RVHI)。

2.2实验结果：

由表1和图1可知，肺动脉高压模型组大鼠在造模后RVHI、肺指数相对对照组有明显的升高。在连续灌胃给予苦豆碱治疗之后RVHI、肺指数均有下降，当剂量增加作用增强，至剂量100mg/kg时保护作用最强(与模型组对比P﹤0.05)，实验并设西地那非(30mg/kg)阳性药对照组。提示苦豆碱(25mg/kg，50mg/kg，100mg/kg)具有减轻野百合碱所致肺动脉高压大鼠右心室肥大的作用，对肺动脉高压大鼠右心室肥大的保护作用呈剂量相关性。

(三)超声心动图

3.1实验方法：

将大鼠称重后，以10％水合氯醛1ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，待呼吸均匀稳定后，胸前备毛，固定于手术台上，使用GE VIVID7超声心动仪、。依次分别检测肺动脉加速时间(PAAT)、肺动脉减速率(PAD)等指标。

3.2实验结果：

由表2可知，肺动脉高压模型组大鼠在造模后PAAT、PAD等血流动力学指标相对对照组有明显的升高。在连续灌胃给予苦豆碱治疗之后PAAT、PAD等指标均有下降，当剂量增加作用增强，至剂量100mg/kg时保护作用最强(与模型组对比P﹤0.05，P﹤0.01)，实验并设西地那非(30mg/kg)阳性药对照组。提示苦豆碱(25mg/kg，50mg/kg，100mg/kg)具有减轻野百合碱所致大鼠肺动脉高压的作用，对大鼠肺动脉高压的保护作用呈剂量相关性。

表2.苦豆碱对野百合碱致肺动脉高压大鼠超声心动图参数的影响

(与对照组比较：^#P<0.05，^##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01)

(四)HE染色观察组织结构病理变化

4.1实验方法：

在血流动力学指标检测完成之后，取出完整的心肺，分离右肺下叶组织，用6-8ml 4％多聚甲醛冲洗缓慢其中的残留的血液，放入4％多聚甲醛固定48小时。苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，H.E staining)，石蜡切片于65℃烘箱中烘烤20min，之后将玻片依次浸泡于二甲苯Ⅰ(10min)，二甲苯Ⅱ(5min)，无水乙醇Ⅰ(1min)，无水乙醇Ⅱ(1min)，95％乙醇(30s)，80％乙醇(30s)和70％乙醇(30s)，水洗三次，之后于苏木素中浸泡5min，水洗3次，在1％的盐酸酒精溶液中浸泡20s，水洗3次，伊红溶液中浸泡2min，水速洗，之后石蜡切片继续依次浸泡于80％乙醇(30s)，95％乙醇(30s)，无水乙醇Ⅰ(1min)，无水乙醇Ⅱ(3min)，二甲苯Ⅰ(2min)和二甲苯Ⅱ(2min)，最后用中性树胶封片。每组大鼠肺组织石蜡切片HE染色完成后，置于显微镜下观察，每张切片使用400×视野，每个切片分别取20个相对圆整的血管进行拍照记录。选取直径50～300μm肺小动脉，使用显微镜专用测微尺，计算管壁厚度占血管外径的百分比(WT％)和管壁面积占血管总面积的百分比(WA％)。

4.2实验结果：

如图2和图3所示，肺动脉高压模型组大鼠在造模后WT％、WA％相比对照组有明显的升高。对比模型组，苦豆碱给药组随剂量增加大鼠肺组织肺中小动脉肥厚病理变化减轻，WT％、WA％下降(与模型组对比P﹤0.05，P﹤0.01)，实验并设西地那非(30mg/kg)阳性药对照组，提示苦豆碱(25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、)具有减轻野百合碱致肺动脉高压大鼠肺组织中小动脉肥厚的作用。

(五)免疫组化检测大鼠肺中小动脉α平滑肌肌动蛋白表达

5.1实验方法：

在血流动力学指标检测完成之后，取出完整的心肺，分离右肺下叶组织，用6-8ml 4％多聚甲醛冲洗缓慢其中的残留的血液，放入4％多聚甲醛固定48小时。制作成石蜡切片后，于65℃烘箱中烘烤20min，之后将玻片依次浸泡于二甲苯Ⅰ(10min)，二甲苯Ⅱ(5min)，无水乙醇Ⅰ(1min)，无水乙醇Ⅱ(1min)，95％乙醇(30s)，80％乙醇(30s)和70％乙醇(30s)，水洗三次脱蜡。蒸馏水浸泡3次,每次各5分钟，PBS浸泡5分钟；将切片水浴加热至95-98℃，恒温15分钟后取出；

PBS冲洗3次,每次5分钟；用3％双氧水37℃孵育15分钟以淬灭内源性过氧化物酶活性；PBS冲洗3次,每次5分钟；之后封闭、加入一抗室温孵育2小时；PBS清洗3次,每次5分钟；甩去PBS后，加入二抗，37℃孵育30分钟；PBS清洗3次,每次5分钟；甩去PBS后，DAB显色，复染、分化、透明，中性树胶封片。每组大鼠肺组织石蜡切片免疫组化染色完成后，使用400×视野，置于显微镜下观察拍照，记录α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)大鼠肺组织小动脉中的表达情况。

5.2实验结果：

如图4和图5所示，肺动脉高压模型组大鼠在造模后α-SMA表达水平相比对照组有明显的升高。对比模型组，苦豆碱给药组随剂量增加大鼠肺组织肺中小动脉肥厚病理变化减轻，α-SMA表达下降(与模型组对比P﹤0.05，P﹤0.01)。实验并设西地那非(30mg/kg)阳性药对照组，提示苦豆碱(25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)具有减轻野百合碱致肺动脉高压大鼠肺组织中小动脉肌化的作用。

(六)生化指标检测

6.1实验方法：

在血流动力学指标检测完成之后，取出完整的心肺，分离左肺组织，用预冷的生理盐水冲洗其中的残留的血液，放入-80℃冰箱中待用。使用硫酸浸泡过的玻璃匀浆器按按9：1(V/W)加入组织裂解液冰上操作，反复匀浆20次至肉眼不见组织块，离心取上清液。使用牛血清白蛋白按考马斯亮蓝法在酶标仪562nm处检测待测样品吸光度，做总蛋白浓度标准曲线(R²>0.99)并测定各实验组大鼠肺组织蛋白浓度，严格按照试剂盒操作说明进行生化指标检测。

6.2实验结果：

由表3和图6可知，连续灌胃给予苦豆碱对野百合碱所致大鼠肺组织生化指标变化呈现双向反应，随剂量的增加，脑组织中抗氧化剂(SOD、GSH-px、CAT、T-AOC)活性增强，丙二醛(MDA)含量降低，至100mg/kg时肺组织内的氧自由基清除剂活性最强，丙二醛含量最低(与模型组对比P﹤0.05，P﹤0.01)。实验并设西地那非(30mg/kg)阳性药对照组。提示苦豆碱(100mg/kg)均具有减轻野百合碱致大鼠肺组织的氧化应激损伤作用。

表3.苦豆碱对野百合碱致肺动脉高压大鼠肺组织中MDA含量、SOD、GSH-PX、CAT、T-AOC活性的影响(n＝6)

(与对照比较：^##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01)

(七)Western blot检测大鼠肺组织NOX-2、NOX-4蛋白的表达

7.1实验方法：

使用凯基全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA蛋白含量检测试剂盒测定样本总蛋白质浓度并标定蛋白统一浓度。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸纤维素膜(NC膜)进行湿法转膜。转膜结束后取出硝酸纤维素膜，将膜置入5％脱脂奶粉封闭液中封闭1h。封闭结束孵育5％脱脂奶粉稀释的一抗，4℃过夜，室温复温1h，洗膜后孵育二抗。用PBST洗NC膜三次，每次10min。滴加蛋白化学发光剂(ECL)，NC膜固定于片盒内，压入胶片进行曝光。取出胶片，放入显影液和定影液中各1min，最后清水清洗。凝胶图像分析成像系统(培清，JS-860B)对胶片上每个目的条带进行扫描和图像分析。

7.2实验结果：

如图7和图8所示，与对照组比较，模型组大鼠肺组织NOX-2、NOX-4蛋白表达明显增加(与对照组相比P<0.01)；与模型组比较，苦豆碱(100mg/kg)、西地那非(30mg/kg)组大鼠肺组织NOX-2、NOX-4蛋白表达显著减少(与模型组相比P<0.05，P﹤0.01)。提示苦豆碱的保护作用可能通过降低NOX-2、NOX-4的表达与活化，减少肺组织活性氧物质(ROS)的异常增加，对肺动脉高压大鼠起到一定的保护作用。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。