具有抗急性酒精肝损伤的药物及其应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体是具有抗急性酒精肝损伤的药物及其应用。

背景技术：

肝损伤所引起的肝脏疾病已成为困扰全球医疗领域的一个重要问题。肝损伤包括化学性肝损伤、药物性肝损伤、免疫性肝损伤和酒精性肝损伤等类型，其中酒精性肝损伤在临床上最为常见。酒精性肝损伤包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化，由长期过量饮酒所致，主要表现为恶心、呕吐、黄疸、肝脏肿大和压痛，可并发肝衰竭和上消化道出血等。目前临床上多采用抗病毒、抗纤维化、人工肝支持治疗、肝移植、免疫调节联合治疗。某些疗法虽十分有效，但价格昂贵，并且滥服中草药对肝损伤也有较大毒副作用，因此市场上亟需安全有效、作用机制明确的抗急性酒精肝损伤药物。

民族药种类多，来源广，抗急性酒精肝损伤具有价廉易得、不良反应小等特点，如何从民族药中提取得到抗急性酒精肝损伤药物的有效成分一直是现代民族药领域具有挑战性的研究。

短穗兔耳草（Lagotis brachystachy Maxim）属玄参科兔耳草属植物，藏名直打萨曾，以全草入药，为常用藏药的上品，具有治肺胃淤血、肺结核、血热性化脓症等功效。短管兔耳草为玄参科植物短管兔耳草Lagotis brevituba Maxim的干燥全草，可作为藏药洪连入药。洪连能清热解毒、利湿、平肝，可用于治疗湿热黄疸。现代研究表明短穗兔耳草有治肺胃淤血、肺结核、血热性化脓症等功效，能治赤巴病、培根病，适用于血热性化脓症、肺胃淤血、赤巴胸闷、黄水病、脓疡；短管兔耳草有抗菌消炎、抗肿瘤、降尿酸等作用，主要用于治疗全身发烧、肺病、肾炎、高血压、动脉粥样硬化、月经不调等疾病。但未见短穗兔耳草和短管兔耳草中的提取物、有效部位或活性成分治疗急性酒精性肝损伤方面的研究报道。此外，也未见任何关于短穗兔耳草和短管兔耳草作为单方或复方用于治疗急性酒精性肝损伤的公开报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供具有抗急性酒精肝损伤的药物及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

具有抗肝急性酒精损伤作用的药物，其有效成分为短穗兔耳草和短管兔耳草。

作为本发明进一步的方案：所述具有抗急性酒精肝损伤作用的药物，其有效成分为短穗兔耳草50-95%乙醇提取部位。

作为本发明进一步的方案：所述具有抗急性酒精肝损伤作用的药物，其有效成分为短管兔耳草50-95%乙醇提取部位。

作为本发明进一步的方案：短穗兔耳草50-95%乙醇提取部位、短管兔耳草50-95%乙醇提取部位的制备过程为：将短穗兔耳草和短管兔耳草分别称取100 g，分别用6-15倍体积50-95%乙醇加热回流2-4次，每次1-2h，合并提取液，用旋转蒸发仪回收乙醇，浓缩得醇提物。

短穗兔耳草和短管兔耳草在制备预防急性酒精肝损伤药物中的应用。

短穗兔耳草和短管兔耳草在制备抗急性酒精肝损伤药物中的应用。

作为本发明进一步的方案：短穗兔耳草的有效部位为短穗兔耳草50-95%乙醇提取部位，短管兔耳草的有效部位为短管兔耳草50-95%乙醇提取部位。

作为本发明进一步的方案：短穗兔耳草50-95%乙醇提取部位、短管兔耳草50-95%乙醇提取部位的制备过程为：将短穗兔耳草和短管兔耳草分别称取100g，分别用6-15倍体积50-95%乙醇加热回流2-4次，每次1-2h，合并提取液，用旋转蒸发仪回收乙醇，浓缩得醇提物。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、短穗兔耳草为玄参科植物短穗兔耳草Lagotis brachystachys Maxim的干燥全草，主要有肺胃淤血、肺结核、血热性化脓症等功效，能治赤巴病、培根病，适用于血热性化脓症、肺胃淤血、赤巴胸闷、黄水病、脓疡。短管兔耳草为玄参科植物短管兔耳草Lagotis brevituba Maxim的干燥全草，具有抗菌消炎、抗肿瘤、降尿酸等作用，主要用于治疗全身发烧、肺病、肾炎、高血压、动脉粥样硬化、月经不调等疾病。两种兔耳草为多年生植物，且分布广泛，资源丰富，均可作为藏药洪连入药。药理学实验表明，两种兔耳草均具有抗急性酒精性肝损伤作用，具有较好的保肝效果。

2、该发明有效提取部位安全性高。

该发明有效部位的制备方便，市场前景广阔，蕴藏极大的经济效益和社会效益。有望开发成为新一代安全有效，用于多种类型的抗肝损伤药物。

附图说明

图1是本发明小鼠肝组织病理切片（HE，×200）示意图（A-I）；

（A）：正常组肝组织结构完整，肝小叶结构清晰，肝细胞排列整齐，核圆且清晰，胞浆丰富；

（B）：模型组可见大部分肝小叶结构破坏，肝索排列紊乱，中央静脉出现大量瘀血，肝血窦扩张，肝细胞体积增大，胞质疏松淡染，部分肝细胞发生气球样变和核固缩，大量肝细胞呈灶状坏死；

（C）：阳性药组可见肝组织结构较完整，肝小叶结构较清晰，肝细胞坏死数量明显减少，胞浆较丰富；

（D）：短穗兔耳草50-95%乙醇提取部位低剂量组肝索排列紊乱，肝血窦扩张，大量肝细胞呈灶状坏死；

（E）：短穗兔耳草50-95%乙醇提取部位中剂量组肝小叶结构较清楚，肝细胞坏死数量明显减少；

（F）：短穗兔耳草50-95%乙醇提取部位高剂量组肝小叶结构较清楚，肝细胞坏死数量明显减少；

（G）：短管兔耳草50-95%乙醇提取部位低剂量组肝索排列紊乱，肝血窦扩张，肝细胞出现大量核增生及核固缩，大量肝细胞呈灶状坏死；

（H）：短管兔耳草50-95%乙醇提取部位中剂量组肝小叶结构较清楚，肝细胞出现部分核固缩，肝细胞坏死数量明显减少；

（I）：短管兔耳草50-95%乙醇提取部位高剂量组肝小叶结构较清楚，肝细胞出现少量核固缩，肝细胞坏死数量明显减少；

图2为各组小鼠肝组织TNF-α mRNA 表达的比较；图中，1:正常组；2:模型组；3:联苯双酯组（阳性药组）；4:短穗兔耳草4.0 g·kg-1给药组；5:短穗兔耳草2.0 g·kg-1给药组；6:短穗兔耳草1.0 g·kg-1给药组；7:短管兔耳草4.0 g·kg-1给药组；5:短管兔耳草2.0 g·kg-1给药组；6:短管兔耳草1.0 g·kg-1给药组；与正常组比较，* P＜0.05，** P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1 短穗兔耳草有效部位的制备方法

短穗兔耳草称取100g，用6倍体积（600ml）50%乙醇加热回流2次，每次1h，合并提取液，用旋转蒸发仪旋干，得到短穗兔耳草50%乙醇提取部位。

实施例2 短穗兔耳草有效部位的制备方法

将短穗兔耳草称取100g，用10倍体积（1000ml）60%乙醇加热回流3次，每次2h，合并提取液，用旋转蒸发仪回收乙醇，得到短穗兔耳草60%乙醇提取部位。

实施例3 短穗兔耳草有效部位的制备方法

将短穗兔耳草称取100g，用15倍体积（1500ml）95%乙醇加热回流3次，每次2h，合并提取液，用旋转蒸发仪回收乙醇，得到短穗兔耳草95%乙醇提取部位。

实施例4短管兔耳草有效部位的制备方法

短管兔耳草称取100g，用6倍体积（600ml）50%乙醇加热回流2次，每次1h，合并提取液，用旋转蒸发仪旋干，得到短管兔耳草50%乙醇提取部位。

实施例5 短管兔耳草有效部位的制备方法

将短管兔耳草称取100g，用10倍体积（1000ml）60%乙醇加热回流3次，每次2h，合并提取液，用旋转蒸发仪回收乙醇，得到短管兔耳草60%乙醇提取部位。

实施例6 短管兔耳草有效部位的制备方法

将短管兔耳草称取100g，用15倍体积（1500ml）95%乙醇加热回流3次，每次2h，合并提取液，用旋转蒸发仪回收乙醇，得到短管兔耳草95%乙醇提取部位。

实施例7 两种兔耳草乙醇提取物对乙醇所致小鼠急性肝损伤的疗效试验研究

1 材料与仪器

1.1材料和试剂

短穗兔耳草、短管兔耳草提取物，提取方法，见实施例1-6。

ALT测试盒（IFCC法）、AST测试盒（速率法）、TC测试盒（氧化酶法）、TG测试盒（酶法），均购自南昌百特生物高新技术股份有限公司；超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、还原性谷胱甘肽（GSH）、考马斯亮蓝测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；TNF-α ELISA试剂盒，购自欣博盛生物；NF-κB ELISA试剂盒，购自武汉华美生物工程有限公司；动物组织总RNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；反转录试剂盒，购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；苏木素-伊红染液，购自南京建隶生物工程研究所；联苯双酯滴丸，购自浙江万邦药业股份有限公司；无水乙醇，购自西陇化工股份有限公司。

1.2仪器

AU480全自动生化分析仪，购自贝克曼库尔特公司；UV-2100紫外分光光度计，购自北京瑞利分析仪器公司；DY89-II电动匀浆机，购自宁波新芝生物科技股份有限公司；Allegra64R高速冷冻离心机，购自美国Beckman公司；Multiskan GO全波长酶标仪，购自美国Thermo公司；超低温冰箱，购自美国Thermo公司；电热恒温水温箱，购自上海博迅实业有限公司；电子分析天平，购自北京赛多利斯仪器系统有限公司；TKY-BMB型石蜡包埋机，购自湖北省泰康医疗设备有限公司；包埋专用冷台，购自湖北省泰康医疗设备有限公司；半自动轮转式切片机LeicaRM2245，购自北京长恒荣创科技有限公司；XI15正置显微镜，购自日本奥林巴斯有限公司。

1.3实验动物

90只雄性小鼠，昆明种，SPF级，体重18-22g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司（生产许可证号SCXK(湘)2013-0004）。饲养温度：22-26℃，自由水食，适应性饲养一周后进行实验。

2实验方法

将小鼠随机分为共9组，每组10只，分别为正常组、模型组、联苯双酯组（阳性对照组）、短穗兔耳草低（SL）、中（SM）、高（SH）剂量组、短管兔耳草低（GL）、中（GM）、高（GH）剂量组。连续给药7d，0.15ml/10g小鼠，正常组和模型组灌胃生理盐水，阳性药组灌胃联苯双酯（150mg/kg，450mg溶于45ml水），每天给药4h后，以0.14ml/10g剂量一次灌胃50%乙醇溶液，灌胃后禁食，于造模后16h各组取血2份，全血5000r/min，离心5min，取血清，一份应用全自动生化分析仪按照说明测定ALT、AST、TC、TG各项指标；另一份用酶标仪按照说明测定TNF-α、NF-κB各项指标。断颈脱臼致死，并于冰台快速分离相同部位肝脏组织3份，其中一份10%甲醛固定，制备病理切片；一份肝脏组织称取0.1g左右，制备成10%的肝组织匀浆，5000r/min离心5min取上清液，按照各个测试盒说明书进行测定SOD、MDA、GSH、蛋白的含量；另一份肝脏组织称取15mg左右，按动物组织总RNA提取试剂盒和反转录试剂盒说明书操作，测定TNF-α相对表达量。

3 实验结果

表1短穗兔耳草和短管兔耳草提取物对乙醇致肝损伤小鼠血清ALT、AST、TC、TG含量的影响（±s，n=10）

注：与正常组比较，* P＜0.05，** P＜0.01；与模型组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01。

从表1可以看出，模型组与正常组比较，血清中ALT、AST、TC、TG含量显著增高，具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05），表明造模成功。短穗兔耳草（2.0,4.0g/kg）中、高剂量组和短管兔耳草（4.0g/kg）高剂量组与模型组比较，ALT、AST、TC、TG含量显著降低（P＜0.01或P＜0.05），短管兔耳草（2.0g/kg）中剂量组TC、TG含量显著降低（P＜0.05），短管兔耳草（2.0g/kg）中剂量组ALT、AST含量虽有所降低，但无统计学意义（P>0.05），说明短穗兔耳草60%乙醇提取部位和短管兔耳草60%乙醇提取部位都具有较强的保肝作用。

表2短穗兔耳草和短管兔耳草提取物对乙醇致肝损伤小鼠肝匀浆SOD、MDA、GSH活性的影响（±s，n=10）

注：与正常组比较，* P＜0.05, ** P＜0.01；与模型组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01。

从表2可以看出，模型组与正常组比较，肝组织匀浆中SOD、GSH含量极显著降低，MDA含量极显著升高，说明造模成功。短穗兔耳草（4.0g/kg）高剂量组和短管兔耳草（4.0g/kg）高剂量组与模型组比较，SOD、GSH含量明显升高，MDA含量明显降低，具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。短穗兔耳草（1.0g/kg,2.0g/kg）低、中剂量组SOD含量显著升高，MDA含量显著降低（P＜0.01或P＜0.05），短管兔耳草（2.0g/kg）中剂量组MDA含量显著降低，GSH含量显著升高（P＜0.05）。

表3短穗兔耳草和短管兔耳草提取物对乙醇致肝损伤小鼠血清TNF-α、NF-kB含量的影响（±s，n=10）

注：与正常组比较，* P＜0.05, ** P＜0.01；与模型组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01。

从表3可以看出，模型组与正常组比较，血清中TNF-α、NF-kB含量极显著升高，说明造模成功。短穗兔耳草（1.0,2.0,4.0g/kg）各剂量组和短管兔耳草（4.0g/kg）高剂量组与模型组比较，TNF-α、NF-kB含量明显降低，具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。短管兔耳草（2.0g/kg）中剂量组NF-kB含量明显降低（P＜0.05），短管兔耳草（1.0g/kg）低剂量组TNF-α、NF-kB含量和短管兔耳草（2.0g/kg）中剂量组TNF-α含量虽有所降低，但无统计学意义（P>0.05）。

参考图1-2，RT-PCR检测结果显示，与正常组比较，模型组小鼠肝组织中TNF-α mRNA的相对表达量极显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，联苯双酯组小鼠肝组织中TNF-α mRNA的相对表达量显著降低（P＜0.01）；短穗兔耳草提取物1.0 g·kg^-1给药组和短管兔耳草提取物1.0 g·kg^-1给药组均显著下调小鼠肝组织中TNF-α mRNA的相对表达量（P＜0.05）；短穗兔耳草提取物2.0，4.0 g·kg^-1给药组和短管兔耳草提取物2.0，4.0 g·kg^-1给药组小鼠肝组织中TNF-α mRNA的相对表达量均极显著降低（P＜0.01）。

4 实验结论

以上实验结果表明，短穗兔耳草50-95%乙醇提取部位和短管兔耳草50-95%乙醇提取部位均具有治疗急性酒精性肝损伤的作用。

以上实施方式，应当指出，对于本领域普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明做出任何修改和改动，而所有这些修改和改动同样落入本发明权利要求所限定的范围。