一种肺癌细胞生长抑制剂的制作方法

本发明涉及一种肺癌细胞生长抑制剂，尤其是一种影响肺部肿瘤细胞增殖的菌株——耻垢分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，属于微生物学领域。

背景技术：

耻垢分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是一种抗酸分枝杆菌，它与结核分枝杆菌共享超过2000个同源染色体，具有与结核分枝杆菌及其它分枝杆菌相同的独特细胞壁结构。这些特性使耻垢分枝杆菌成为研究结核分枝杆菌和其它致病性分枝杆菌的实验模型。耻垢分枝杆菌本身具有快速生长和非致病性等特点，与特殊致病分枝杆菌(如结核分枝杆菌)相比，耻垢分枝杆菌可以诱导机体更强大的固有免疫反应，从而易被宿主杀伤并清除。

技术实现要素：

本发明首先提供了一种抗肺部肿瘤的药物或抑制剂，其特征在于，其有效成分是以下(a)或(b)：

(a)耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)；

(b)在耻垢分枝杆菌的基础上进行蛋白、基因等水平上进行改造的且仍具有抗肺部肿瘤活性的耻垢分枝杆菌重组菌株。

本发明通过实验证明：(1)M.smegmatis感染显著抑制人非小细胞肺癌A549细胞的增殖。CCK-8实验结果显示：M.smegmatis感染A549细胞24小时后，A549细胞数量较未感染细胞减少，并随着感染时间延长细胞数量差异逐渐明显。(2)M.smegmatis感染显著抑制人非小细胞肺癌A549细胞的迁移能力；细胞迁移实验证明M.smegmatis感染A549细胞12小时后，发生迁移的细胞数量远低于未感染细胞。(3)裸鼠成瘤实验结果表明M.smegmatis感染后的A549细胞较未感染细胞成瘤能力明显减弱，成瘤较小；并进一步对肿瘤组织进行Ki-67免疫组化和HE染色，结果显示M.smegmatis感染过的肿瘤组织Ki-67蛋白水平显著降低，说明细胞的增殖能力减弱。

本发明成果可以用来开发治疗肺部肿瘤的药物，或用于辅助筛选能够治疗肺癌的药物，并为针对肺癌的免疫疗法研究提供指导。

附图说明

图1：M.smegmatis抑制A549细胞的增殖。

图2：M.smegmatis抑制A549细胞的侵袭能力。

图3：M.smegmatis对A549肿瘤的形成有抑制作用；(A)肿瘤照片，(B)肿瘤体积。

图4：M.smegmatis抑制A549肿瘤组织的增殖。

具体实施方式

实施例1 M.smegmatis对人非小细胞肺癌A549细胞增殖的影响

(A)实验方法：用耻垢分枝杆菌(M.smegmatis mc² 155)和卡介苗(BCG)分别感染A549细胞(MOI＝10)，未感染细胞(Non-infected)和BCG感染细胞作为对照组。通过CCK-8实验对比感染不同时间点细胞增殖能力变化来分析M.smegmati对A549细胞增殖的影响。

(B)结果：如图1所示，M.smegmatis感染A549细胞24小时后，细胞数量较未感染细胞减少，并随着感染时间延长差异逐渐明显。相反，BCG不会抑制A549细胞的增殖，反而具有一定的促进作用，BCG感染A549细胞24小时后，细胞数量较未感染细胞略增多，并随着感染时间延长细胞数量差异逐渐明显。

实施例2 M.smegmatis对人非小细胞肺癌A549细胞迁移能力的影响

(A)实验方法：用M.smegmatis mc² 155和BCG分别感染A549细胞(MOI＝10)，未感染细胞和BCG感染细胞作为对照组。通过细胞迁移实验(transwell)对比A549细胞被感染12小时后，发生迁移的细胞数量的差别。

(B)结果：如图2所示，M.smegmatis感染A549细胞12小时后，发生迁移的细胞数量较未感染细胞显著减少。相反，BCG对A549细胞的迁移能力没有抑制反而具有一定的促进作用，BCG感染A549细胞12小时后，发生迁移的细胞数量较未感染细胞略多。

实施例3 M.smegmatis对人非小细胞肺癌A549细胞成瘤能力的影响

(A)实验方法：(1)用M.smegmatis和BCG分别感染A549细胞(MOI＝10)，未感染细胞和BCG感染细胞作为对照组。感染2小时后更换细胞培养基，并在新鲜培养基中加入终浓度10μg/ml的庆大霉素培养细胞过夜。次日去掉细胞培养基，1×PBS洗涤2遍，加入胰酶消化并离心收集细胞，1×PBS重悬并洗涤细胞3次充分去掉残留的胰酶，离心并收集细胞并用1×PBS将细胞重悬成浓度为5×10⁷个/毫升的细胞悬液，置于冰上用于皮下注射。(2)出生8周BALB/c裸鼠腋下分别接种200微升细胞悬液(M.smegmatis感染、BCG感染及未感染三种细胞系，每种细胞系接种五只)，2周后处死小鼠，量取肿瘤大小、拍照并制作切片进行病理学观察。

(B)结果：如图3、4所示，裸鼠成瘤实验表明M.smegmatis感染后的A549细胞较未感染细胞成瘤能力明显减弱，成瘤较小(图3)；并进一步对肿瘤组织进行Ki-67免疫组化和HE染色，结果显示Ki-67蛋白水平显著降低，说明细胞的增殖能力减弱。相反，BCG感染后的A549细胞成瘤能力没有减弱反而增强。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。