一种显齿蛇葡萄叶黄酮的提取及提取物的微胶囊制备方法与流程

本发明涉及药食两用原料的制备领域，具体涉及从显齿蛇葡萄叶中提取黄酮类物质的方法及其微胶囊制备方法。

背景技术：

消除老年斑是医学美容事业的新课题。由于皮肤肤色变深变浅取决于黑色素细胞的密度和色素的生成量等因素，而黑色素的生成与体内酪氨酸酶有关，也就是说降低酪氨酸酶的活性可以减少黑色素的生成。研究表明：各种黄酮类物质结构上的酚羟基可以消除过剩的氧自由基，抑制过氧化脂质的生成和酪氨酸酶的活性，具有分解色斑的作用。此外黄酮类物质可改善血管的弹性与渗透性，舒张血管，清除血管内壁积存物，从而净化血液，降低血液粘稠度，改善血液的循环状态，增强血液的供氧能力，促进皮下组织血液循环，使肌肤红润光泽，更加有营养，更有弹性。

黄酮类天然产物在人类健康中的作用是国际上过去十余年来天然药物和健康产品研究开发的热点之一，它具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、消炎抑菌等多种奇特功效。二氢杨梅系黄酮类化合物中的一员，其除具有黄酮类化合物的普通特性之外，在解毒、降低血脂和血糖水平，提高SOD活性，以及保肝护肝等方面具有特殊功效。而显齿蛇葡萄幼嫩茎叶中总黄酮、二氢杨梅素含量极高，属黄酮类化合物在植物中分布的特例。因此，可以将显齿蛇葡萄作为集营养、保健、药用功能于一体的资源加以开发利用，对于提高显齿蛇葡萄的综合利用率具有重要意义。

然而，现有技术中，对于显齿蛇葡萄叶中黄酮的提取工艺，往往存在提取温度高、提取工艺复杂、需要引入有机溶剂等。这样存在几点弊端：容易造成有效物质发生化学变化、不利于产业化应用、成本高、不够节能环保，而且提取率也并不太理想。

另外，显齿蛇葡萄叶黄酮在贮存过程中，某些成分会发生有害变化。如何解决其在应用过程中，避免有效成分损失，有效控制活性物质释放的技术，也是本领域亟待解决的技术问题之一；解决这一技术问题，有利于促进显齿蛇葡萄这一药食同源植物的深度开发，且有助于我国天然资源的有效利用。

技术实现要素：

本发明为弥补现有技术中存在的不足，提供一种显齿蛇葡萄叶黄酮的提取方法，该方法具有工艺简单、无需有机溶剂、提取条件温和、提取率高且工艺成本低等特点。

本发明为达到上述目的，采用的技术方案如下：

一种显齿蛇葡萄叶黄酮的提取方法，包括如下步骤：

1)将显齿蛇葡萄茎叶粉碎，过20-60目筛；

2)将过筛所得显齿蛇葡萄茎叶样品和水按照1:15-1:25的料液比混合，在常温、140-160MPa压力下进行水浴浸提，浸提时间为20-30min，；

3)过滤，所得滤液进行浓缩、干燥。优选为真空浓缩、冷冻干燥

优选的，步骤1)中，显齿蛇葡萄茎叶粉碎后，过25-35目筛。

最为优选的，包括如下步骤：

1)将显齿蛇葡萄茎叶粉碎，过30目筛；

2)将过筛所得显齿蛇葡萄茎叶样品和水按照1:20的料液比混合，在常温、150MPa压力下进行水浴浸提，浸提时间为25min；

3)过滤、真空浓缩、冷冻干燥。

本发明第二方面提供一种显齿蛇葡萄叶黄酮微胶囊的制备方法，包括如下步骤：

1)将壳聚糖和氯化钙水溶液混合并进行磁力搅拌，得壳聚糖-氯化钙溶液；

2)包埋：将显齿蛇葡萄叶黄酮加入海藻酸钠水溶液中混匀，然后滴入至步骤1)的壳聚糖-氯化钙溶液中，得包埋体系溶液，滴完后静置；其中，所述显齿蛇葡萄叶黄酮采用上文所述的方法制备；

3)分离微胶囊，水洗、真空干燥。

优选的，步骤2)中，所述显齿蛇葡萄叶黄酮与海藻酸钠的质量比为1:3.5-4.5，最优选为1:4。

优选的，海藻酸钠在步骤2)的包埋体系溶液中的质量分数为1.5-3％。

优选的，壳聚糖在步骤2)的包埋体系溶液中的质量分数为0.6-1.2％。

优选的，氯化钙在步骤2)的包埋体系溶液的质量分数为0.4-1.2％。

优选的，步骤2)的包埋体系溶液的pH控制在5.5～6.5。

优选的，步骤2)中，包埋体系溶液的温度控制在55-65℃，静置时间控制在15～30min。

本发明提供的技术方案具有如下有益效果：

1、本发明提供的提取方法，工艺简单，无需高温条件，也无需有机溶剂，工艺成本低；提取条件温和，活性物质不容易变质，且提取率高，有效成分破坏少。

采用优选条件的常温高压提取技术，将预处理过的显齿蛇葡萄置于高压设备中进行高压处理，使原料中的功效成分更多地溶解到水中，在高压作用下，使有效成分从生物细胞中释放出来，避免了有效成分因高温而遭受破坏，同时也避免了无效物质夹带过多而造成提取产物质量很差的矛盾问题。

2、本发明提供的提取方法，所需投入少，无需锅炉及辅助设备的采购费用及场地费用，和回流提取比较，可节省投资18％。另外，该技术提取效率高，节省原材料，与回流提取比较，可节约20％的运行成本以及30-40％的生产成本。

3、本发明提供的显齿蛇葡萄叶黄酮微胶囊的制备方法，制备过程简单，避免了高温、有机溶剂等有害的条件，利于保持被包埋物的活性。

4、本发明提供的显齿蛇葡萄叶黄酮微胶囊的制备方法，通过多种包埋剂协同作用，调节包埋物的释放速度；壳聚糖是由甲壳素经过脱乙酰基化而制成的直链多糖，其分子链上的伯氨基可与海藻酸钠分子链上的羧基发生静电相互作用，从而在海藻酸钠微胶囊表面复合一层聚电解质膜，这样既提高了微胶囊的稳定性和包埋率，又可调节包埋物生物释放速度。

附图说明

图1水浸提率及总黄酮随料液比的变化曲线；

图2水浸提率及总黄酮随时间的变化曲线；

图3水浸提率及总黄酮随粒度的变化曲线；

图4海藻酸钠质量分数的影响；

图5壳聚糖质量分数的影响；

图6氯化钙质量分数的影响；

图7在模拟胃液环境中的释放曲线；

图8在模拟小肠环境中的释放曲线；

图9显齿蛇葡萄叶黄酮及VC对·OH抑制能力。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明：

实施例中所用部分试验材料和方法说明如下：

材料:海藻酸钠、壳聚糖、氯化钙，均为分析纯。

仪器：Agilent 1260高效液相色谱系统，美国安捷伦公司；ME215S分析天平，德国赛多利斯公司；UV-2600紫外可见分光光度计，日本岛津公司；EYELA旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；SHZ-DA循环水式真空泵，上海和太设备有限公司；JN-02C型高压均质机，广州聚能生物科技有限公司。

实施例1显齿蛇葡萄叶黄酮的提取工艺研究

1、料液比对总黄酮量及水浸提率的影响

取显齿蛇葡萄叶10.0g于500ml烧杯中，分别加入80、100、150、200、250ml蒸馏水，即为1：8，1：10，1：15，1：20，1：25的料液比，在25℃、150MPa压力下进行水浴浸提，浸提20min，取其滤液分别测定总黄酮和水浸提率。实验结果见图1。

由图1可知，随着料液比的增加，总黄酮的提取量也增加，但是其增幅随着料液比的增大而慢慢变小，这就说明总黄酮的提取量已逐步接近平衡。显然，随着水溶剂的增加，提取物浓度被稀释，溶剂的扩散速度加快，所以总黄酮提取量随料液比的增加而增加。由图1还可以看出水浸提率的变化规律与总黄酮的变化规律相似，当料液比达1：20时，总黄酮量无明显增加。尽管水浸提率在料液比超过1：20时仍有增加的趋势，但考虑能源消耗和浸提液的保存等因素，本实验中料液比优选用1：20。

2、时间对总黄酮量及水浸提率的影响

取显齿蛇葡萄样品10.0g于500ml烧杯中，以1：20料液比(g/ml)在25℃、150MPa压力下水浴浸提10、15、20、25、30min，取其滤液分别测定总黄酮及水浸提率，其结果见图2。

由图2可知，总黄酮随着时间的延长，浸出率增加，其增长幅度逐渐变小，特别是到了25min之后，总黄酮的浸出基本处于一条直线上了，这就表明总黄酮的提取已基本完全。水浸提也有相似的变化趋势，时间是影响可溶性物质提取的重要因素，时间增加，必然使显齿蛇葡萄叶中的可溶性物质充分溶出，但时间过长，会导致一些不可口的黄酮和一些植物色素等组分被溶出，同时也会使黄酮类物质氧化。

3、粒度对总黄酮及水提取率的影响

将显齿蛇葡萄叶样品用植物组织捣碎机粉碎，分别通过20、30、40、50、60、120目筛。分别取不同粒度的样品各10.0g于500mL烧杯中,按1:20的料液比加水，在25℃、150MPa压力下水浴浸提20min，取其滤液分别测定其总黄酮及水浸提率。实验结果见图3。

由图3可知，随着样品粒度的减小，样品的总表面积增加，在浸提过程中与水的接触面积亦随之加大，样品中可溶性成分更易于溶出。总黄酮在粒度为30目之前是样品中总黄酮随着增加，而水浸提率亦是如此。在粒度达30目后，可溶性物质的浸出率随着粉碎粒度的增加基本不再变化。

4、正交实验

采用L₉(3³)，做料液比、时间和粒度的三因素三水平的正交实验，L₉(3³)正交试验三水平三因素选择表见下表1所示，正交实验其他条件与实施例1第3点“粒度对总黄酮及水提取率的影响”相同，不再赘述。

表1 L₉(3³)正交试验三水平三因素选择表

正交试验结果见下表2所示：

表2正交试验结果

采用L₉(3³)，做料液比、时间和粒度的三因素三水平的正交实验，结果表明最优浸提方案为A₃B₂C₁,即料液比为1：25，浸提时间为25min，显齿蛇葡萄叶粉碎粒度为30目，但考虑后续工序加工的能源损耗及其有效成分的损失等因素，因此适宜的料液比为1：20、浸提时间为25min。其影响的主次顺序是料液比、样叶粒度和浸提时间。

实施例2显齿蛇葡萄叶黄酮的提取

采用实施例1优选的较佳条件提取黄酮：

将显齿蛇葡萄叶样品用植物组织捣碎机粉碎，过30目筛，取10.0g粉碎过筛后样品于500mL烧杯中，按照料液比1：20加入水，在25℃、150MPa压力下常温高压水浴浸提25min，过滤得滤液，对滤液进行真空浓缩、冷冻干燥。浸提率为44.27％，总黄酮量为43.01g/kg。

实施例3显齿蛇葡萄叶黄酮微胶囊制备工艺研究

微胶囊制备按照如下步骤进行：取一定浓度的壳聚糖和CaCl₂水溶液100mL置于烧杯中，磁力搅拌。另取20mL含显齿蛇葡萄叶黄酮(实施例2制备)的海藻酸钠水溶液(显齿蛇葡萄叶黄酮：海藻酸钠＝1：4，质量比)，以针头匀速滴入壳聚糖-CaCl₂溶液中，得包埋体系溶液，滴完后静置30min，分离微胶囊，水洗后真空干燥。

微胶囊载药量与显齿蛇葡萄叶黄酮包埋率的测定方法：取一定量已干燥的微胶囊(记为w)，置于0.2mol/L pH 7.4的磷酸缓冲液中，待微胶囊充分溶涨并大部分破裂后，剧烈搅拌，使微胶囊完成破裂，滤去不溶物，检测缓冲液中总酚量(记为p)。

微胶囊载药量(％)＝(p÷w)×100％

其中：显齿蛇葡萄叶黄酮在微胶囊中的理论含量为制备一定量(w)微胶囊所用显齿蛇葡萄叶黄酮的量。

1、海藻酸钠质量分数的影响

按照上文的微胶囊制备步骤进行，其中，壳聚糖在包埋体系溶液中的质量分数为0.6％,氯化钙在包埋体系溶液中的质量分数0.8％、包埋体系溶液的pH 5.5，包埋温度60℃和包埋时间20min的条件下。在这些条件下考察不同海藻酸钠质量分数对包埋效果的影响，结果见图4。

由图4可知，随着海藻酸钠质量分数的增加，包埋率先增加后降低，当海藻酸钠质量分数为2.5％时，包埋率达到最大值53.87％。这是因为海藻酸钠质量分数太低，海藻酸钠/壳聚糖聚电解质膜过薄，不能形成微胶囊，或形成的微胶囊机械强度低，不能有效地对芯材进行包埋；海藻酸钠的质量分数过高，体系粘度大，挤出困难且挤出后易变形成饼状物，包埋效果也很差。因此选择海藻酸钠质量分数2.5％进行后续试验。

2、壳聚糖质量分数的影响

按照上文的微胶囊制备步骤进行，其中，海藻酸钠在包埋体系溶液中的质量分数为2.5％、氯化钙在包埋体系溶液中的质量分数为0.8％、包埋温度60℃、包埋时间20min；在这些条件下考察不同壳聚糖质量分数对包埋效率的影响，结果见图5。

由图5可知，当壳聚糖质量分数为1％时，包埋率达到最大值57.92％.。这是因为前期随着壳聚糖质量分数的增加，形成微胶囊的机会增加，包埋率也随之增加；但当壳聚糖质量分数超过1％时，壁材量过高，壁材之间碰撞的机会增加，而壁材芯材之间碰撞的机会减少，故包埋率降低。因此选择壳聚糖质量分数1％进行后续试验。

3、氯化钙质量分数的影响

按照上文的微胶囊制备步骤进行，其中，海藻酸钠在包埋体系溶液中的质量分数2.5％、壳聚糖在包埋体系溶液中的质量分数1％、包埋体系溶液的pH 5.5、包埋温度60℃、包埋时间20min；在这些条件下考察不同氯化钙质量分数对包埋效果的影响，结果见图6。

由图6可知，当氯化钙质量分数为0.8％时，包埋率达到最大量58％。这是由于前期随着氯化钙质量分数的增加，形成微胶囊的机会增加，包埋率也随之增加；但当氯化钙质量分数超过0.8％时，壁材量过量，壁材之间碰撞的机会增加，而壁材芯材之间碰撞的机会减少，故包埋率降低，因此选择氯化钙质量分数0.8％进行后续试验。

4、pH值对微胶囊性能的影响

按照上文的微胶囊制备步骤进行，其中，如下组分在包埋体系溶液中的质量分数分别是：2.5％海藻酸钠，1.0％壳聚糖，0.8％的CaCl₂；在这些条件下考察包埋体系溶液分别在pH＝5.0与pH＝6.0时，对显齿蛇葡萄叶黄酮提取物进行包埋，pH对微胶囊性能的影响。

实验结果见表3。

表3 pH值对显齿蛇葡萄叶黄酮微胶囊性能的影响

从表3的结果可以看出：pH值对壳聚糖、海藻酸钠以及被包埋物质所带的电荷、空间构象均有一定影响。壳聚糖的pKa为6.3，海藻酸钠中古洛糖醛酸的pKa为3.5，甘露糖醛酸的pKa为4.0，在pH5.0时，壳聚糖的氨基和海藻酸钠的羧基大部分离子化，这样两者通过静电作用形成的聚电解质膜较pH6.0时致密，对被包埋物质的扩散限制作用更强，因此包埋率较高，但在pH6.0时海藻酸钠表面的带电量更大，吸附的壳聚糖也更多，形成的聚电解质膜较厚，由于在0.01mol/L的盐酸溶液中，微胶囊表面的壳聚糖膜剂壳聚糖与海藻酸钠的复合膜遭到一定程度的破坏，此时对缓释起主要作用的是聚电解质膜的厚度，因此pH6.0时，微胶囊对显齿蛇葡萄叶黄酮的控释效果较好。

实施例4微胶囊制备

采用实施例3优选的较佳条件制备微胶囊：

配制壳聚糖-CaCl₂溶液：将壳聚糖和CaCl₂水溶液100mL置于烧杯中，磁力搅拌。

包埋：将20mL含显齿蛇葡萄叶黄酮(实施例2制备)的海藻酸钠水溶液(显齿蛇葡萄叶黄酮：海藻酸钠＝1：4，质量比)，以针头匀速滴入壳聚糖-CaCl₂溶液中，得包埋体系溶液，滴完后静置30min，分离微胶囊，水洗后真空干燥。包埋温度控制在60℃，包埋时间为20min。

其中，壳聚糖、CaCl₂、海藻酸钠在包埋体系溶液中的质量分数分别是1.0％、0.8％、2.5％。包埋体系溶液的pH为6.0。

实施例5释放性能检测

对实施例4制备的微胶囊进行释放性能检测：

1、在模拟胃液环境中的释放

在50mL胃液模拟液(含0.09mol/L NaCl和0.01mol/L HCl溶液，pH 2.0中)中加入4g已干燥的微胶囊，37℃，60r/min,在指定时间取样，检测总酚含量，计算释放率。

实验结果参见图7。

2、在模拟肠液环境中的释放

在上述胃液模拟液中处理一定时间的微胶囊，分离后水洗，加入50mL肠模拟液(含76.5mmol/L NaCl的29mmol/L pH 7.4磷酸缓冲液)，37℃，60r/min,在指定时间取样，检测总酚含量，计算释放率

实验结果参见图8。

由图7可见，在模拟胃液环境中停留2h后，微胶囊中酚类物质的释放率为65％，说明在酸性的条件下，微胶囊表面的壳聚糖膜以及海藻酸钠与壳聚糖的复合膜被破坏，导致内溶物释放。此外，在酸性溶液中放置的时间越长，其表面上的复合膜就被破坏越严重，包埋物的扩散就越强，进而降低了微胶囊载模拟肠液环境中处理0.5h后，在模拟肠液环境中25min释放52％；而若在模拟胃液环境中处理1h后，在模拟肠液环境中25min累积释放率就达74％。

实施例6抗氧化性能测定

显齿蛇葡萄叶黄酮清除自由基能力测定:利用羟自由基测定试剂盒进行测定。

1、样品溶液制备

取实施例2制备的显齿蛇葡萄叶黄酮干粉0.1g,，配制0.01、0.02、0.03、0.04、0.05和0.06mg/mL六种不同浓度样品溶液，待用。以同浓度VC作对照。

2、测定方法

根据表4建立自由基反应体系。操作均在37℃水浴中进行。随后将反应体系混匀，室温下水平静置20min，将96孔酶标板空扫，记录每个孔的吸光度值A₀作为空白，再分别取各反应液200Μl至酶标板中，于550nm处测吸光度A_X.所得样液吸光度为A_S＝A_X-A_0..以VC作对照。进行三次平行实验，取平均值。

表4清除羟自由基反应体系

Table3 The reaction system of eliminate·OH

所测样对羟自由基抑制率M按照公式进行计算

式中:AC—对照孔吸光度值；AU—测定孔吸光度值

3、测定结果

产生羟自由基的化学反应属FeSO4-H₂O₂体系最为常见，即Fenton体系。该体系反应产生的·OH的量与H₂O₂的量成正相关。当给予电子受体后，使用giess试剂显色，会生成红色物质，其颜色深浅与·OH量成正比。依据以上原理，利用羟自由基测定试剂盒对显齿蛇葡萄叶黄酮以及VC对羟自由基的抑制能力进行测定，结果见图9，显齿蛇葡萄叶黄酮与VC对·OH的半数抑制浓度IC₅₀及黄酮含量。

由图9可知，显齿蛇葡萄叶黄酮对羟自由基具有一定的抑制作用。当试验浓度在0.01-0.05mg/mL之间时，显齿蛇葡萄叶黄酮对羟自由基的抑制率随着浓度的增加而呈上升趋势，而且提取物抑制效果略强于VC。而当浓度大于0.05mg/mL时，显齿蛇葡萄叶黄酮对羟基自由基的抑制率反而降低。这可能是黄酮化合物在一定浓度下，会与FeSO4-H₂O₂体系中的铁离子与氧发生自氧化反应，生成过氧化物或超氧化物，对·OH的抑制能力下降。

由上述实验可见，本发明提供的显齿蛇葡萄叶黄酮微胶囊制备方法简单可行，是一种制备显齿蛇葡萄叶黄酮微胶囊的较好方法，而且该显齿蛇葡萄叶黄酮微胶囊产品在模拟胃液和肠液环境中具有很好的释放特性。对显齿蛇葡萄叶黄酮进行微胶囊化处理，既解决了其自身在稳定性方面存在的缺憾，又使产品具有缓释的优点，为显齿蛇黄酮作为天然活性成分发挥其多种生物活性开辟了一条新的途径。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。