一种易缝合阵列微管神经修复支架制备方法及其应用与流程

本发明属于医学技术领域，尤其涉及一种易缝合阵列微管神经修复支架制备方法及其应用。

背景技术：

周围神经损伤是临床上最严重的创伤之一。我国每年因各种原因造成的周围神经病例数额巨大。据统计，我国每年因严重创伤、先天性畸形及肿瘤切除等原因造成的周围神经损伤约200万例；根据Integra Life Science公司估计，全球有关神经修复的市场约为40亿美元。随着现代工业、交通及建筑业的发展，周围神经损伤的发生率呈逐年增加的趋势，给个人、家庭及社会带来沉重负担。尽管周围神经损伤后能够自发再生，并与靶组织重新建立突触联系从而恢复神经功能，但周围神经损伤的临床修复效果仍差强人意，且致残率较高。尤其是长节段(＞3cm)神经缺损，无法实施无张力缝合，修复更为困难，患者预后更差。长节段神经缺损临床治疗的金标准是自体神经移植，但供体来源有限、供区功能损害、供受神经直径不匹配等限制了自体神经的应用。此外，自体神经移植缝合难度大，手术时间长，治疗费用高。

目前已经商品化的神经修复支架包括Neurotube、NeuroGen、Neuromatrix等，虽然手术缝合难度较自体神经移植小，但是其修复效果并不理想。并且大量文献报道目前商品化的神经修复支架不能够有效修复长度大于3cm的长节段神经缺损。主要由于商品化的神经修复支架均为中空导管结构，缺乏内部三维结构，不能引导神经长距离再生。神经修复支架的拓扑结构，尤其是仿生学的设计对神经再生发挥重要的引导作用。桥接支架内部纵向排列的微管结构，能够促进神经细胞迁移以及轴突的延伸。目前，通过梯度冷凝工艺能够制备具有阵列微管结构的神经支架。在大鼠及比格犬长节段神经缺损修复中发现，阵列微管结构的神经支架较中空神经导管组取得更好神经再生及功能恢复。但是通过梯度冷凝工艺制备的神经支架两端为平齐结构，将与受损神经断端直接端端吻合，缝合难度比较大；并且由于其为多孔结构，缝合强不够，存在缝合端分离的风险。有文献报道，在大鼠体内，将神经剥除，留下神经外膜包裹神经支架，用与修复神经缺损。但是此缝合方法不适用于临床上长节段缺损。因为临床上长节段神经缺损往往伴随神经外膜缺失。因此，开发一种既具有内部三维阵列微管结构，又利于缝合的神经修复产品，有望提高临床神经缺损修复效果，同时便于临床修复手术的开展，减少手术时间。

由于目前阵列微管神经支架促进神经再生局限于动物研究，缺乏考虑其在临床转化及临床应用中存在缝合难度大，手术时间长，缝合强度不够的问题。如何实现不同规格阵列微管内芯与外皮结构匹配制备及组装也是一个巨大挑战。因此目前国际上尚无易缝合阵列微管神经支架的报道，也无阵列微管神经支架制作工艺。

目前商品化神经导管，缺乏内部三维结构，不能引导神经长距离再生的困境，同时解决阵列微管神经支架缝合难度大，手术时间长，缝合强度不够的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种易缝合阵列微管神经修复支架制备方法及其应用，旨在解决目前商品化神经导管缺乏内部三维结构问题以及阵列微管神经支架不利于神经缝合，手术时间长，缝合强度不够，难以在临床推广应用的问题。

本发明是这样实现的，一种易缝合阵列微管神经修复支架制备方法，所述包括以下步骤：

步骤一，阵列微管内芯的制备：将壳聚糖溶液倒入胶原溶液中，用匀浆器冰水浴条件下混匀，将混匀凝胶抽真空，放气使气泡破碎；之后离心；将混匀无气泡凝胶注入圆柱形模具，并在圆柱形模具一端塞入与圆柱形模具内经相匹配的铜塞；圆柱形模具装入垂直下落架；待全部浸入液氮后，取出圆柱形模具，去除圆柱形模具的铜塞；用冷冻干燥机冷冻干燥；将制好支架从圆柱形模具中取出，放入京尼平乙醇溶液交联；交联完毕后，用蒸馏水重复清洗；将清洗的神经支架取出，冻干；制得阵列微管神经支架；

步骤二，静电纺丝易缝合神经支架外皮结构的制备：将PCL溶于甲醇/氯仿的混合溶液中，通过微量注射泵控制PCL溶液的流速，通过静电纺丝装置制备易缝合神经支架外皮结构，在真空干燥箱中干燥，除去残余溶剂，得到易缝合神经支架外皮结构；

步骤三，易缝合阵列微管神经修复支架制备：将步骤一中制得的阵列微管神经支架切割成长节段备用，将步骤二中制得易缝合神经支架外皮结构切割成长节段备用；将阵列微管神经支架塞入易缝合神经支架外皮结构中；易缝合神经支架外皮结构两端留有利于将神经断端塞入缝合空间。

进一步，阵列微管内芯的制备具体包括：

0mg～250mg取壳聚糖、0mg～350mg I型胶原分别溶于5ml的浓度为3mg/ml～6mg/ml的醋酸溶液中，4℃，溶解24小时；将壳聚糖溶液倒入胶原溶液中，用匀浆器冰水浴条件下混匀，搅拌速度2500rpm～3000rpm；将混匀凝胶先用真空泵抽真空5min，放气使气泡破碎，重复4次～5次；之后离心机5000rpm离心3min～5min；将混匀无气泡凝胶注入内径为1.5mm的圆柱形模具，并在圆柱形模具一端塞入与圆柱形模具内经相匹配的铜塞；圆柱形模具装入垂直下落架，以1mm/min～5mm/min速度下降；待全部浸入液氮后，取出圆柱形模具，去除圆柱形模具的铜塞；用冷冻干燥机冷冻干燥18h～24h，至干燥；将制好支架从圆柱形模具中取出，放入20ml 1％京尼平乙醇溶液4℃交联4小时～48小时；交联完毕后，用蒸馏水重复洗3次～6次，1小时/次；将清洗的神经支架取出，放入-80℃冷冻30分钟～60分钟，放入预冷冻干机中冻干18小时～24小时；制得阵列微管神经支架。

进一步，静电纺丝易缝合神经支架外皮结构的制备具体包括：将PCL溶于10％的甲醇/氯仿的混合溶液中，甲醇/氯仿按体积质量比占混合溶液的10％，按体积比甲醇∶氯仿＝1∶5，通过微量注射泵控制PCL溶液的流速，静电纺丝装置两极间电压设定为15kV-20kV，注射器和接收器之间的距离为15cm，应用21-G针形喷嘴，接收器为直径1mm-8mm的钢棒，制备易缝合神经支架外皮结构，在真空干燥箱中干燥，除去残余溶剂，得到易缝合神经支架外皮结构。

进一步，易缝合阵列微管神经修复支架制备具体包括：将阵列微管内芯的制备中制得的阵列微管神经支架用锋利刀片切割成8mm-98mm长节段备用；将静电纺丝易缝合神经支架外皮结构的制备中制得易缝合神经支架外皮结构用锋利刀片切割成10mm-100mm长节段备用；用显微镊夹住8mm-98mm长阵列微管神经支架，塞入10mm-100mm长易缝合神经支架外皮结构中；易缝合神经支架外皮结构两端留出1mm-5mm利于将神经断端塞入的缝合空间。

本发明另一目的在于提供一种易缝合阵列微管神经修复支架，所述易缝合阵列微管神经修复支架包括：以胶原、壳聚糖、明胶一种或几种混合制备的阵列微管神经支架；

以胶原、壳聚糖、明胶、丝素蛋白、PCL、PLGA、PPE、PLLA一种或几种混合制备的易缝合神经支架外皮结构；

所述阵列微管神经支架容纳在易缝合神经支架外皮结构内部。

进一步，所述阵列微管神经支架两端面距离易缝合神经支架外皮结构两外端面均为1mm-5mm。

进一步，易缝合阵列微管神经修复支架长度为10mm-100mm，内径为1mm-8mm。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述易缝合阵列微管神经修复支架制备方法制备的易缝合阵列微管神经修复支架的修复方法，该修复方法包括：

阵列微管神经支架利用纵向平行排列的阵列微管结构，通过物理引导神经再生；易缝合外皮结构包裹在阵列微管神经支架外面，使神经塞入，用于神经断端与桥接支架缝合。

本发明提供的一种易缝合阵列微管神经修复支架长度为17mm，内径为1.5mm的易缝合阵列微管神经修复支架制备，通过阵列微管内芯模具及静电纺丝接收钢棒的匹配改变，可以制备长度为10mm-100mm，内径为1mm-8mm的易缝合阵列微管神经修复支架。易缝合神经支架外皮结构两端留出的空间为1-5mm，可利于将神经断端塞入缝合。

本发明的修复方法神经修复的时间与中空导管神经修复时间类似，仅为自体神经移植时间的1/2，显著提高神经缺损手术效率。易缝合阵列微管神经修复支架修复大鼠15mm神经缺损术后12周进行探查发现，易缝合阵列微管神经修复支架组神经支架仍保持良好外形结构，而中空导管组有部分塌陷。术后12周及24周进行应用坐骨神经指数检测对功能恢复进行评估发现：易缝合阵列微管神经修复支架组功能恢复显著优于中空导管组，达到与自体神经修复组相似水平。

本发明通过梯度冷凝制备阵列微管支架内芯结构，应用静电纺丝技术制备神经支架外皮结构，将其匹配组装，形成易缝合阵列微管神经修复支架。此易缝合阵列微管神经修复支架既具有天然材料形成的纵向平行排列的阵列微管结构，通过物理引导神经再生；又具有强度及柔韧性极好合成材料制成的外皮结构；还在外皮两端留出空间，易于将使神经塞入，用于神经断端与桥接支架缝合。本发明可以解决目前商品化神经导管，缺乏内部三维结构，不能引导神经长距离再生的困境，同时解决阵列微管神经支架缝合难度大，手术时间长，缝合强度不够的问题。

附图说明

图1是本发明实施例提供的易缝合阵列微管神经修复支架制备方法流程图。

图2是本发明实施例提供的易缝合阵列微管神经修复支架扫描电镜图。

图中：A：易缝合阵列微管神经修复支架横切面图，中央为具有阵列微管结构的内芯，外周为静电纺丝制备的易缝合外皮结构；B：阵列微管内芯横截面；C：阵列微管内芯纵切面。

图3是本发明实施提供的易缝合阵列微管神经修复支架修复大鼠15mm神经缺损图；

图中：A：易缝合阵列微管神经修复支架修复大鼠15mm神经缺损术中图片；B：各种神经修复材料用于神经修复手术时间对比图；C：术后12周及24周进行应用坐骨神经指数对功能恢复进行评估图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明应用原理作详细描述。

如图1所示，本发明实施例提供的易缝合阵列微管神经修复支架制备方法，包括以下步骤：

S101：阵列微管内芯的制备：0～250mg取壳聚糖、0～350mg I型胶原分别溶于5ml的醋酸溶液(3～6mg/ml)，4℃，溶解24小时；将壳聚糖溶液倒入胶原溶液中，用匀浆器冰水浴条件下混匀，搅拌速度2500～3000rpm；将混匀凝胶先用真空泵抽真空5min，放气使气泡破碎，重复4～5次；之后离心机5000rpm离心3～5min；将混匀无气泡凝胶注入内径为1.5mm的圆柱形模具，并在圆柱形模具一端塞入与圆柱形模具内经相匹配的铜塞；圆柱形模具装入垂直下落架，以1mm/min～5mm/min速度下降；待全部浸入液氮后，取出圆柱形模具，去除圆柱形模具的铜塞；用冷冻干燥机冷冻干燥18h～24h，至干燥；将制好支架从圆柱形模具中取出，放入20ml 1％京尼平乙醇溶液4℃交联4小时～48小时；交联完毕后，用蒸馏水中，重复洗3次～6次，1小时/次；将清洗的神经支架取出，放入-80℃冷冻30分钟～60分钟，放入预冷冻干机中冻干18小时～24小时；制得阵列微管神经支架。

S102：静电纺丝易缝合神经支架外皮结构的制备：将PCL溶于10％的甲醇/氯仿的混合溶液中，甲醇/氯仿按体积质量比占混合溶液的10％，按体积比甲醇∶氯仿＝1∶5，通过微量注射泵控制PCL溶液的流速，静电纺丝装置两极间电压设定为15-20kV，注射器和接收器之间的距离为15cm，应用21-G针形喷嘴，接收器为直径1.5mm的钢棒，制备易缝合神经支架外皮结构，在真空干燥箱中干燥，除去残余溶剂，得到易缝合神经支架外皮结构。

S103：易缝合阵列微管神经修复支架制备：将S101中制得阵列微管内芯用锋利刀片切割成15mm长节段备用，将S102中制得易缝合神经支架外皮结构用锋利刀片切割成17mm长节段备用。用显微镊轻轻夹住15mm长阵列微管神经支架，慢慢塞入17mm长易缝合神经支架外皮结构中。易缝合神经支架外皮结构两端留出1mm的空间，可利于将神经断端塞入缝合。

本发明实施例提供的易缝合阵列微管神经修复支架，原料可以为胶原，壳聚糖，明胶一种或几种混合制备阵列微管内芯。

神经外皮材料可以是胶原，壳聚糖，明胶，丝素蛋白，PCL，PLGA，PPE，PLLA等天然材料或人工合成材料。

本发明实施例提供的易缝合阵列微管神经修复支架长度为17mm，内径为1.5mm的易缝合阵列微管神经修复支架制备，通过阵列微管内芯模具及静电纺丝接收钢棒的匹配改变，可以制备长度为10mm-100mm，内径为1mm-8mm的易缝合阵列微管神经修复支架

易缝合神经支架外皮结构两端留出的空间为1-5mm，可利于将神经断端塞入缝合。

本发明实施例提供一种利用上述制备方法制备的易缝合阵列微管神经修复支架的修复方法，该修复方法包括：

神经支架利用纵向平行排列的阵列微管结构，通过物理引导神经再生，易缝合外皮结构包裹在支架外面，利于神经塞入，便于神经断端与桥接支架的缝合，缩短缝合时间，降低神经断端与桥接支架缝合出分离的风险。

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步描述。

图2是本发明实施例提供的易缝合阵列微管神经修复支架扫描电镜图。

图中：A：易缝合阵列微管神经修复支架横切面图，中央为具有阵列微管结构的内芯，外周为静电纺丝制备的易缝合外皮结构；B：阵列微管内芯横截面；C：阵列微管内芯纵切面。扫描电镜结果证实易缝合阵列微管神经修复支架具有纵向平行排列的微管内芯结构及与内芯相匹配的外皮结构。

图3是本发明实施例提供的易缝合阵列微管神经修复支架修复大鼠15mm神经缺损图；

图中：A：易缝合阵列微管神经修复支架修复大鼠15mm神经缺损术中图片(易缝合阵列微管神经修复支架总长17mm，内芯长15mm，因此桥接神经缺损长度为15mm)；B：各种神经修复材料用于神经修复手术时间对比。易缝合阵列微管神经修复支架组与中空导管组手术时间无差异，均在20min左右，但是自体神经移植修复组需要更长的手术修复时间，为易缝合阵列微管神经修复支架组的两倍；C：术后12周及24周进行应用坐骨神经指数对功能恢复进行评估，发现易缝合阵列微管神经修复支架组取得了与自体神经移植组相似的功能恢复，但是中空导管组功能恢复极差。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。