一种气滞血瘀型子宫肌瘤模型的建立方法与流程
本发明涉及一种气滞血瘀型子宫肌瘤模型的建立。
背景技术：
子宫肌瘤是一种最常见的良性肿瘤，好发于育龄期女性。其病因及发病机制尚未明确，国内外研究者们通过多种理论对其作出解释，目前，被广泛研究者接受的是，子宫肌瘤是一种激素依赖性肿瘤，子宫肌瘤的形成和发展与雌、孕激素关系密切。通过大量的实验研究及临床观察，这一观点也得到了证实。通过子宫肌瘤动物模型的研究不仅能进一步明确子宫肌瘤的发病机制，还能用于筛选出治疗子宫肌瘤更有效的方法及临床前药物筛查。而建立合适的子宫肌瘤动物模型成为其中的关键之处。
目前子宫肌瘤动物造模方法包括如下：单一雌激素诱导法，雌、孕激素联合诱导法，人子宫肌瘤移植法，子宫肌瘤转基因法。中医药对子宫肌瘤的治疗上具有独特的优势，建立病与证紧密联系的病证结合模型，将中医学及现代医学理论为指导，同时考虑病与证，来复制出既有西医疾病特征，又符合中医证候特征的动物模型，已成为中西医结合实验动物研究的新方向。经文献研究发现，子宫肌瘤的主要病机为瘀血阻滞，致体内气机不畅，痰湿内聚，相互搏结于胞宫，其治法以活血化瘀为主。因此，在构建病证结合的子宫肌瘤动物模型过程中，以复制西医疾病造模法为基础，同时，通过中医病因学指导构建符合中医“证”的动物模型。目前对于子宫肌瘤病证结合动物模型的构建方法较少。
技术实现要素：
本发明方案根据西医发病机理，采用雌孕激素负荷法构建子宫肌瘤基本模型，并依据其中医发病机理，结合多因素刺激法构建气滞血瘀子宫肌瘤病证结合模型。
本发明气滞血瘀型子宫肌瘤模型的制备方法，它是在给与己烯雌酚和黄体酮的同时，给予不可预见性刺激。
其中，所述己烯雌酚药液和黄体酮注射液的给药方式是：每日给予己烯雌酚1.35mg/kg，同时每周一、三、五给与黄体酮1.0mg/只，连续五周。
其中，所述己烯雌酚的给药方式是灌胃；所述黄体酮的给药方式是肌肉注射。
其中，给予不可预见性刺激的方法是：从第四周开始，给与肾上腺素注射液0.9mg/kg·d，四小时后给予不可预见性刺激，连续2周。
其中，所述不可预见性刺激包括如下5种：①噪音刺激连续3h；②昼夜颠倒；③5～10℃冰水浴游泳4min；④悬尾10min；⑤50℃烘箱烘10min。
其中，每日随机给予1种刺激，整个周期中每种刺激不少于2次；；所述噪音的音量为60db。
其中，所述肾上腺素注射液的给与方式是皮下注射。
其中，所述动物为大鼠。
本发明还提供了前述方法建立的模型在筛选治疗子宫肌瘤的药物中的应用。
本发明还提供了一种筛选治疗子宫肌瘤的药物的方法，
a、按照前述的方法建立的气滞血瘀型子宫肌瘤模型；
b、将候选物施用于a步骤所述的气滞血瘀型子宫肌瘤模型；
c、用气滞血瘀型子宫肌瘤模型评价潜在的治疗子宫肌瘤的药物。
本发明成功构建了气滞血瘀型子宫肌瘤大鼠模型，可以用于子宫肌瘤药物的筛选和子宫肌瘤的研究，应用前景优良。
根据本发明的上述内容，按照本发明相关领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
附图说明
图1用药后溃烂伤口对比。a：2周脓肿溃烂；b：3周脓肿逐渐痊愈；c:5周脓肿痊愈；
图2各组大鼠子宫形态对比。a:空白组；b:模型组；c:阳药组；d：s-e高组；e:s-e中组；f:s-e低组；
图3各组大鼠子宫病理对比。a:空白组；b:模型组；c:s-e高组；d：s-e中组；e:s-e低组；f:阳药组；
图4各组大鼠子宫系数和卵巢系数的总重量；
图5各组大鼠子宫横径r和子宫直径r。
具体实施方式
实施例1本发明动物模型的制备
1实验目的
观察外源性雌孕激素负荷法结合多因素刺激法构建子宫肌瘤大鼠模型，并从“因”、“脉”、“证”、“治”四个方面进行综合评价，构建符合气滞血瘀子宫肌瘤病证结合动物模型。另外，采用阳性药物桂枝茯苓胶囊(用于治疗子宫肌瘤)以及三棱-莪术治疗(行气活血)，验证本发明的造模是否成功。
2材料与方法
2.1实验材料
2.1.1实验动物
spf级成年雌性未孕sd大鼠，体重180～220g，54只，由简阳达硕动物科技有限公司提供，实验动物许可证号：scxk(川)2013-24。检疫后备用，正常光照条件，适宜湿度、温度，自由摄食、水，适应性饲养3天。
2.1.2实验药物、试剂及主要仪器
生三棱饮片，生产批号：160301，四川皓博有限公司；莪术油，生产批号：ez150801，陕西昊辰生物科技有限公司；桂枝茯苓胶囊，规格：0.31g/粒，生产批号：15110611512，江苏康缘药业股份有限公司；己烯雌酚，生产批号：k9212，成都西亚化工股份有限公司；黄体酮注射液，规格：20mg/ml，生产批号：150610，浙江仙琚制药股份有限公司；盐酸肾上腺素注射液，规格：1mg/ml，批号：160401，远大医药(中国)有限公司。
rat促性腺激素释放激素(gnrh)，elsa，货号：xl-er1964，规格：96孔/盒；rat卵泡刺激素(fsh)elsa，货号：xl-er0427，规格：96孔/盒；rat促黄体生成素(lh)，elsa，货号：xl-er1065，规格：96孔/盒；rat雌二醇(e2)，elsa，货号：xl-er0478，规格：96孔/盒，abcam生产；rat孕激素(p)，elsa，货号：xl-er0477，规格：96孔/盒；rat雌激素受体(er)，elsa，货号：xl-er1021，规格：96孔/盒；rat孕激素受体(pr)，elsa，货号：xl-er0474，规格：96孔/盒；rat肿瘤坏死因子(tnf-α)，elsa，货号：xl-er0359，规格：96孔/盒；rat白细胞介素-1β(il-1β)，elsa，货号：xl-er0187，规格：96孔/盒；上述试剂盒由艾美捷科技有限公司生产，北京永辉生物科技有限公司进口分装。
无水乙醇(ar级)，批号：20160519，规格：500m1/瓶；二甲苯(ar级)，批号：20160512，规格500ml/瓶；硫酸铝钾(ar级)，批号：20160114，规格：500g/瓶；碘酸钠(ar级)，批号：20160104，规格：100g/瓶；盐酸(ar级)，批号：20160118，规格：500ml/瓶；重铬酸钾(ar级)，批号：20160120，规格：500g/瓶；浓硫酸：(ar级)，批号：20160119，规格：500ml/瓶；上述实际均由成都市科龙化工试剂厂生产。血流变仪专用清洗液(含sawz、sawm、sawt)，货号：b4930，北京赛科希德科技发展有限公司；nnf非牛顿流体质控物，货号：2400640，北京赛科希德科技发展有限公司；多聚甲醛，规格：500g/瓶，批号：20160512，国药集团化学试剂有限公司。pbs磷酸盐缓冲液(0.01mph7.2-7.4)，规格：2000ml/袋，批号zli-9062，北京中杉金桥生物技术有限公司。苏木素(ar级)，规格：25g/瓶，批号：lm10n13，北京百灵威科技有限公司；甘油(丙三醇，ar级)，规格：500ml/瓶，批号：20160514，天津市富宇精细化工有限公司。伊红(ar级)，批号：gl01-gmpc，规格：25g/瓶，东京化成工业株式会社；中性树胶，规格：100g/瓶，批号：20160508，中国上海懿洋仪器有限公司。
全自动血流变测试仪，型号：sa-5600，北京赛科希德科技发展有限公司；酶标仪，型号：multlskanmk3，赛默飞世尔仪器有限公司；手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器，型号：syq-dsx-280b，上海申安医疗器械厂；优普超纯水制造系统，型号：uph-ⅱ-10t,成都超纯科技有限公司；图像分析软件，型号：image-proplus6.0，美国mediacybernetics公司。bmj-ⅲ型包埋机，常州郊区中威电子仪器厂；phy-ⅲ型病理组织漂烘仪，常州市中威电子仪器有限公司；tsj-ⅱ型全自动封闭式组织脱水机，常州市中威电子仪器有限公司；shz-d循环水式真空泵，浙江黄岩求精真空泵厂；dy8-i匀浆机，宁波新芝科器研究所；；l-420/l420冷冻离心机，湖南湘仪实验仪器开发公司；
2.2实验方法
2.2.1药物制备
2.2.1.1三棱总黄酮提取
将三棱饮片打成粗粉并过24号目筛，称取适量三棱药粉，置于圆底烧瓶中，加入10倍量60％乙醇，并于浸泡30min后，用电热套加热，微沸回流提取2次，每次1.5小时，用真空抽滤泵趁热抽滤，合并滤液，旋转蒸发仪减压回收溶剂，将收集到的浓缩药液用石油醚进行脱脂，脱脂后在进行聚酰胺柱层析。首先用蒸馏水洗脱，再用乙醇洗脱，将洗脱液回收乙醇，最后恒温干燥箱烘干，得三棱总黄酮浸膏，并用蒸馏水配制成1g生药/ml的溶液，置于4℃冰箱保存。
2.2.1.2三棱总黄酮-莪术挥发油组分配伍药液制备
将购买的莪术油用1％吐温-80配成乳化剂，用蒸馏水配制成1g生药/ml的溶液。将三棱总黄酮与莪术挥发油按1:1进行混合，配置成三棱总黄酮-莪术挥发油组分配伍药液(s-e药液)，置于4℃冰箱保存。
2.2.1.3桂枝茯苓胶囊药液制备
去除桂枝茯苓胶囊内容物，并用蒸馏水溶解，配置成0.09g生药/ml药液，置于4℃冰箱保存。
2.2.2动物造模
将大鼠适应性喂养3天，随机分6组，每组12只。除空白组外，其余每日给予(灌胃)己烯雌酚药液(己烯雌酚的给药量为1.35mg/kg)，另每周一、三、五下肢外侧肌肉注射黄体酮注射液(体酮的给药量为1.0mg/只)，连续五周；从第四周开始，皮下注射盐酸肾上腺素注射液(酸肾上腺素的给药量为0.9mg/kg·d)，四小时后给予慢性不可预见性刺激(①60db噪音刺激连续3h，②昼夜颠倒，③5～10℃冰水浴游泳4min，④悬尾10min，⑤50℃烘箱烘10min，每日随机给予1种刺激，并保证整个周期中每种刺激不少于2次)，连续2周。空白组每日给予蒸馏水2ml，另每周一、三、五下肢外侧肌肉注射生理盐水0.05ml/只，连续五周。
2.2.3动物分组
空白组：空白对照组
模型组：子宫肌瘤+气滞血瘀组
阳药组：桂枝茯苓胶囊阳性药物对照组
s-e高组：三棱总黄酮-莪术挥发油组分配伍高剂量组
s-e中组：三棱总黄酮-莪术挥发油组分配伍中剂量组
s-e低组：三棱总黄酮-莪术挥发油组分配伍低剂量组
每日于己烯雌酚造模后2h给予中药灌胃，阳药组灌桂枝茯苓胶囊药液10ml/kg，s-e高组、s-e中组和s-e低组分别以66.7％、33.3％、16.7％的s-e药液10ml/kg灌胃5周。空白组与模型组灌蒸馏水10ml/kg。
2.2.4动物取材
各组大鼠最后一次用药后，禁食不禁水12h，称重后，取大鼠血清、脾脏、胸腺、子宫、卵巢，脏器称重，子宫测量分角下最大的竖径、横径，子宫、卵巢一半固定于固定液，另一半置液氮中保存。
2.2.5脏器系数
解剖后，剔除各脏器表面脂肪，清除血迹，称取各脏器湿重，计算胸腺、脾脏、子宫和卵巢脏器系数(脏器系数＝脏器湿重/大鼠体重*100)。
2.2.6子宫横径r和直径r
游标卡尺测量子宫分角下最大的竖径r、横径r。
2.2.7子宫病理
将取子宫分角上0.5cm及最彭大处相同部位组织，并用4％多聚甲醛固定液固定，固定组织经全自动脱水机脱水，包埋，切片，最后镜下观察。
2.2.8血清中各指标含量检测
采用酶联免疫试剂盒测定血清中e2、fsh、gnrh、il-1β、lh、p、tnf-α，具体操作方法按照试剂盒说明书进行操作，见附录。
2.2.9子宫匀浆组织中各项指标含量检测
采用酶联免疫试剂盒测定血清中e2、er、il-1b、p、pr、tnf-α，具体操作方法按照试剂盒说明书进行操作，见附录。
2.2.10卵巢匀浆组织中各项指标含量检测
采用酶联免疫试剂盒测定血清中e2、er、il-1b、il-8、p、pr、tnf-α，具体操作方法按照试剂盒说明书进行操作，见附录。
2.3统计学处理
用spss21.0统计学软件对实验数据进行分析处理，结果以均数
3结果
3.1各组大鼠一般行为学对比
造模前，各组大鼠性情温和，毛色柔顺有光泽，饮食尚可。造模后，大鼠逐渐出现饮食减少，生长缓慢，体重减轻，毛色暗淡，毛发竖立，部分大鼠有脱毛现象，以及胸胁部长有球状脓肿，造模后期大鼠呈现易激惹状态，喜打斗。其中s-e高组在用s-e药液灌胃2周后出现脓肿溃烂，用药3周后溃烂创口逐渐痊愈，5周后创口痊愈(见图1)。实验过程中共有16只大鼠死亡，其中因灌胃不当窒息死亡5只(阳药组1只、s-e高组2只、s-e中组1只、s-e低组1只)，因冰水浴死亡4只(模型组1只、阳药组1只、s-e中组1只、s-e低组1只)，因注射肾上腺素操作不当死亡1只(模型组1只)，不明原因死亡4只(空白组1只、阳药组1只、s-e高组1只、s-e中组1只)，另有4只大鼠因股动脉采血操作不当，至动物死亡(空白组2只、模型组1只、s-e低组1只)。
3.2各组大鼠子宫大体观对比
空白组大鼠子宫质地均匀，色泽淡红有关泽，双侧子宫对称，呈y形，未见囊肿、结节及肿胀；模型组大鼠子宫色泽较淡，呈透明水肿状，双侧子宫长短不齐，粗细不均，且部分大鼠子宫可见明显的囊肿、结节及肿胀；药物干预后，各组大鼠子宫体积可见明显缩小，子宫色泽较淡，子宫形态趋于正常，其中以s-e高组和s-e中组改变明显，而阳药组和s-e低组部分大鼠子宫仍可见结节样改变(见图2)。
3.3各组大鼠子宫病理对比
空白组：子宫内膜完整，未见增生、萎缩、充血水肿及变性坏死，无炎性细胞浸润，上皮细胞排列整齐、无增厚、脱落变性，平滑肌细胞体积无增大或缩小，浆膜层未见异常(见图3a)。模型组：子宫平滑肌细胞层厚度不一，子宫平滑肌细胞透明变性、局灶性增生，肌细胞排列紊乱、肌间可见炎细胞浸润，子宫平滑肌轻度肥大(见图3b)。s-e高组：子宫内膜完整，平滑肌细胞透明变性、局灶性增生，平滑肌轻度肥大，粘膜层上皮细胞空泡变性、内膜固有层少量淋巴细胞浸润(见图3c)。s-e中组：子宫肌层较厚、平滑肌轻度肥大，浆膜层未见异常；其中部分平滑肌细胞透明变性、粘膜层上皮细胞空泡变性、内膜固有层嗜酸性粒细胞浸润(见图3d)。s-e低组：子宫平滑肌细胞排列紊乱、透明变性，粘膜层上皮细胞空泡变性，固有层中性粒细胞浸润(见图3e)。阳药组：子宫平滑肌增厚和排列紊乱，少量粘膜层上皮细胞空泡变性，固有层炎细胞浸润(见图3f)。
3.4各组大鼠脏器系数的对比
3.4.1各组大鼠子宫系数、重量和卵巢系数、重量的对比
与空白组比较，模型组子宫系数明显增大，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)；与模型组比较，s-e高组、s-e中组和阳药组子宫系数显著缩小，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)(见表1和图4)。
与空白组比较，模型组卵巢系数明显减小，差异具有统计学意义(p＜0.05)；与模型组比较，s-e中组和阳药组卵巢系数明显增大，差异具有统计学意义(p＜0.05)(见表1和图4)。
表1各组大鼠子宫系数和卵巢系数的比较
注：与空白组对比，*p<0.05，**p<0.01；与模型组对比，#p<0.05，##p<0.01。
3.4.2各组大鼠子宫横径r和子宫直径r的对比
与空白组比较，模型组子宫横径r明显增宽，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)；与模型组比较，s-e高组、s-e中组和阳药组子宫横径r明显变窄，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)(见表2和图5)。
与空白组比较，模型组子宫直径r明显缩短，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)；与模型组比较，s-e高组、s-e中组、s-e低组和阳药组子宫直径r明显缩短，差异具有统计学意义(p＜0.05)(见表2和图5)。
表2各组大鼠子宫横径r和子宫直径r的比较
注：与空白组对比，*p<0.05，**p<0.01；与模型组对比，#p<0.05，##p<0.01。
3.4.3小结
从上述结果可以看出，在造模后，模型组大鼠子宫系数和子宫横径r增大，而子宫直径r和卵巢系数减小，与前期实验结果相符。给予药物干预后，各组大鼠子宫系数和子宫横径r均下降，子宫直径r和卵巢系数上升，由此可见，s-e药液及桂枝茯苓胶囊可明显减小子宫系数，使子宫形态恢复正常，且能增大卵巢系数的作用，其综合疗效以s-e中组和阳药组为佳。
3.4.4各组大鼠脾脏系数、重量和胸腺系数、重量的对比
与空白组比较，模型组脾脏系数明显减小，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)；与模型组比较，s-e高组、s-e中组和阳药组脾脏系数明显增大，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)(见表3)。
与空白组比较，模型组胸腺系数明显减小，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)；与模型组比较，s-e高组、s-e中组和阳药组卵巢系数明显增大，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)(见表3)。
从上述分析表明，造模后的大鼠脾脏和胸腺系数均下降，此造模方法可影响大鼠的免疫功能，而药物干预治疗后，各组脾脏和胸腺系数都有不同程度的恢复，由此可见，s-e药液及桂枝茯苓胶囊可恢复大鼠的免疫功能，其中以s-e高组、s-e中组和阳药组效果最佳。
表3各组大鼠脾脏系数和胸腺系数的比较
注：与空白组对比，*p<0.05，**p<0.01；与模型组对比，#p<0.05，##p<0.01。
3.5各组大鼠血液流变学的改变
血浆粘度、血沉方程k值和红细胞聚集指数各组间数据经检验方差不齐，因此采用多组独立样本秩和检验(kruskal-wallishtest)，红细胞压积各组间数据符合方差齐性检验，结果见表4：
与空白组比较，模型组血浆粘度明显升高，差异有统计学意义(p＜0.05)；与模型组比较，s-e高组、s-e中组和阳药组血浆粘度明显降低，差异有统计学意义(p＜0.05)。
与空白组比较，模型组血沉方程k值明显增大，差异具有统计学意义(p＜0.05)；与模型组对比，s-e高、中，阳药组血沉方程k值明显减小，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
与空白组比较，模型组和s-e中组红细胞聚集指数明显增大，差异具有统计学意义(p＜0.05)，s-e高组红细胞聚集指数明显增大，差异具有统计学意义(p＜0.05)；与模型组对比，s-e高、低和阳药组红细胞聚集指数明显减小，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
与空白组比较，各组间红细胞压积值相近，差异无统计学意义；与模型组比较，s-e高组红细胞压积明显减小，差异有显著统计学意义(p＜0.01)。
通过模型组与空白组各组数据的对比，可知此种造模方法对大鼠血液流变学存在一定的影响，能使血液变稠，改变血液粘度，通过s-e药液及桂枝茯苓胶囊药液治疗后，血液流变学有所改善，血液粘度减轻。
表4对各组大鼠血液流变学的影响
注：与空白组对比，*p<0.05，**p<0.01；与模型组对比，#p<0.05，##p<0.01。
3.6各组大鼠下丘脑中gnrh浓度的对比
与空白组对比，模型组大鼠下丘脑中gnrh的浓度含量相近，无统计学意义(p＞0.05)；与模型组对比，s-e高组、s-e中组、s-e低组和阳药组下丘脑中gnrh的浓度含量相近，无统计学意义(p＞0.05)(见表5)。
表5各组大鼠下丘脑中gnrh浓度的比较
注：与空白组对比，*p<0.05，**p<0.01；与模型组对比，#p<0.05，##p<0.01。
3.7各组大鼠垂体中fsh和lh浓度的对比
与空白组对比，模型组大鼠垂体中fsh浓度明显升高，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)；与模型组对比，s-e高组和阳药组大鼠垂体中fsh浓度明显升高，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)(见表6)。
与空白组对比，模型组大鼠垂体中lh浓度明显升高，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)；与模型组对比，s-e高组和阳药组大鼠垂体中lh浓度明显升高，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)(见表6)。
表6各组大鼠垂体中fsh和lh浓度的对比
注：与空白组对比，*p<0.05，**p<0.01；与模型组对比，#p<0.05，##p<0.01。
3.8各组大鼠血清中指标的比较
3.8.1各组大鼠血清中lh、fsh、gnrh浓度的对比
与空白组对比，模型组大鼠血清中lh和gnrh的浓度虽有升高，但无统计学意义(p＞0.05)；与模型组对比，s-e高组、s-e中组、s-e低组和阳药组血清中lh和gnrh的浓度虽有降低趋势，但无统计学意义(p＞0.05)(见表7)。
与空白组对比，模型组大鼠血清中fsh的浓度降低，但无统计学意义(p＞0.05)；与模型组对比，s-e高组、s-e中组、s-e低组和阳药组血清中fsh的浓度有升高趋势，但无统计学意义(p＞0.05)(见表7)。
表7各组大鼠血清中lh、fsh和gnrh浓度的对比
注：与空白组对比，*p<0.05，**p<0.01；与模型组对比，#p<0.05，##p<0.01。
3.8.2各组大鼠血清中e2和p浓度的对比
与空白组对比，模型组大鼠血清中e2的浓度虽有升高，但无统计学意义(p＞0.05)；与模型组对比，s-e高组、s-e中组、s-e低组和阳药组血清中e2的浓度虽有降低趋势，但无统计学意义(p＞0.05)(见表8)。
与空白组对比，模型组大鼠血清中p的浓度显著升高，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)；与模型组对比，s-e高组和阳药组大鼠血清中p浓度显著升高，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)(见表8)。
表8各组大鼠血清中e2和p浓度的对比
注：与空白组对比，*p<0.05，**p<0.01；与模型组对比，#p<0.05，##p<0.01。
3.8.3各组大鼠血清中il-1β和tnf-α浓度的对比
与空白组对比，模型组大鼠血清中il-1β的浓度相近，无统计学意义(p＞0.05)；与模型组对比，s-e高组、s-e中组、s-e低组和阳药组血清中il-1β的浓度相近，无统计学意义(p＞0.05)(见表9)。
与空白组对比，模型组大鼠血清中tnf-α的浓度明显升高，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)；与模型组对比，s-e高组、s-e中组和阳药组血清中tnf-α的浓度明显下降，差异有统计学意义(p＜0.05)(见表9)。
表9各组大鼠血清中il-1β和tnf-α浓度的对比
注：与空白组对比，*p<0.05，**p<0.01；与模型组对比，#p<0.05，##p<0.01。
3.9各组大鼠子宫中指标的比较
3.9.1各组大鼠子宫中e2和p浓度的对比
从表10可看出，与空白组对比，模型组大鼠子宫中e2浓度明显升高，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)；与模型组对比，s-e高组、s-e中组、s-e低组和阳药组大鼠子宫中e2浓度明显降低，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
从表10可看出，与空白组对比，模型组大鼠子宫中p浓度明显升高，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)；与模型组对比，s-e高组、s-e中组、s-e低组和阳药组大鼠子宫中p浓度明显降低，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
表10各组大鼠子宫中e2和p浓度的对比
注：与空白组对比，*p<0.05，**p<0.01；与模型组对比，#p<0.05，##p<0.01。
3.9.2各组大鼠子宫中er和pr浓度的对比
与空白组对比，模型组大鼠子宫中er和pr浓度明显上升，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)；与模型组对比，s-e高组、s-e中组、s-e低组和阳药组大鼠子宫中er浓度明显降低，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)(见表11)。
表11各组大鼠子宫中er和pr浓度的对比
注：与空白组对比，*p<0.05，**p<0.01；与模型组对比，#p<0.05，##p<0.01。
3.9.3各组大鼠子宫中il-1β和tnf-α浓度的对比
如表12中所示，与空白组对比，模型组大鼠子宫中il-1β浓度明显上升，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)；与模型组对比，s-e高组、s-e中组、s-e低组和阳药组大鼠子宫中il-1β浓度明显降低，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)。
如表12中所示，与空白组对比，模型组大鼠子宫中tnf-α浓度明显升高，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)；与模型组对比，s-e高组、s-e中组、s-e低组和阳药组大鼠子宫中tnf-α浓度明显降低，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)。
表12各组大鼠子宫中il-1β和tnf-α浓度的对比
注：与空白组对比，*p<0.05，**p<0.01；与模型组对比，#p<0.05，##p<0.01。
3.10各组大鼠卵巢中指标的比较
3.10.1各组大鼠卵巢中e2和p浓度的对比
与空白组对比，模型组大鼠卵巢中e2浓度明显上升，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)；与模型组对比，s-e高组、s-e中组、s-e低和阳药组大鼠卵巢中e2浓度明显降低，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)(见表13)。
与空白组对比，模型组大鼠卵巢中p浓度明显升高，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)；与模型组对比，s-e高组、s-e中组、s-e低和阳药组大鼠卵巢中p浓度明显降低，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)(见表13)。
表13各组大鼠卵巢中e2和p浓度的对比
注：与空白组对比，*p<0.05，**p<0.01；与模型组对比，#p<0.05，##p<0.01。
3.10.2各组大鼠卵巢中er和pr浓度的对比
如表14所示，与空白组对比，模型组大鼠卵巢中er浓度明显升高，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)；与模型组对比，s-e高组、s-e中组、s-e低组和阳药组大鼠卵巢中er浓度明显降低，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)。
如表14所示，与空白组对比，模型组大鼠卵巢中pr浓度明显升高，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)；与模型组对比，s-e高组、s-e中组、s-e低组和阳药组大鼠卵巢中pr浓度明显降低，差异具有显著统计学意义(p＜0.01)。
表14各组大鼠卵巢中er和pr浓度的对比
注：与空白组对比，*p<0.05，**p<0.01；与模型组对比，#p<0.05，##p<0.01。
4讨论
本实验运用性激素负荷法建立子宫肌瘤大鼠模型，建模同时给予药物联合情志及外界环境刺激等多因素刺激，造成气滞血瘀证的子宫肌瘤大鼠模型。为中医治疗子宫肌瘤的临床及药理研究提供稳定、可控的，既符合中医理论又尽量与人体疾病接近的病证结合动物模型。
采用本发明方法造模后通过观察模型组大鼠的外在体征及行为学表现，从外在体征上，大鼠逐渐出现饮食减少，生长缓慢，部分大鼠体重减轻，爪甲尾部呈紫暗色，尾部明显脱屑，毛色发暗无光泽，毛发竖立，部分大鼠有脱毛现象，以及胸胁部长有球状脓肿；从行为学上，模型组大鼠表现为弓背、蜷缩、活动减少、易激惹等。以上外部体征及行为学表现均较符合气滞血瘀的症状。
ul在中医学上的发病机制多因经期或产后瘀血内停、结于胞中，积聚成块，久而气滞血瘀发为“癥瘕”、“积聚”。本实验在造模后，通过对大鼠子宫组织的观察可发现子宫整体呈短胖形，肉眼可见子宫呈透明水肿状，且明显可见的囊肿、结节及肿胀，其子宫病理可见子宫粘膜上皮细胞空泡变性，平滑肌细胞透明变性、肌细胞排列紊乱、增生，肌间可见炎细胞浸润。另现代研究表明，ul患者血液流变学呈高凝状态，瘀血内停的血液流变学的主要特征主要表现为黏、凝、浓、聚的状态。血液流变学是研究血液及其有形成分的流动性和形变规律的流变，血液流变学异常是血瘀证辅助诊断的实验室指标之一，血浆粘度是影响全血粘度的重要因素之一，血浆粘度升高则全血粘度增高，血沉方程k值与红细胞聚集性有关，k值越大则红细胞聚集性越强，表明体内有瘀血存在，红细胞聚集指数及红细胞压积均是影响血液黏度的重要指标。本实验中模型组与空白组比较，其中模型组血浆粘度、血沉方程k值、红细胞聚集指数明显增高，二者比较差异有统计学意义(p＜0.05)，说明模型组大鼠处于血瘀状态。
实验结果说明，本发明方法构建了气滞血瘀型子宫肌瘤的大鼠模型。
为验证本证候模型的成立，本实验采用桂枝茯苓胶囊(用于治疗子宫肌瘤)以及三棱-莪术进行验证。实验结果证明，本实验中，经阳性药物治疗后子宫形态逐渐恢复，子宫体积可见明显缩小，血浆粘度、血沉方程k值、红细胞聚集指数，与模型组比较明显降低，差异有统计学意义(p＜0.05)。
实验结果说明，本发明的确成功构建了气滞血瘀型子宫肌瘤大鼠模型，而且该模型可以用于子宫肌瘤药物的筛选。
综上，本发明成功构建了气滞血瘀型子宫肌瘤大鼠模型，可以用于子宫肌瘤药物的筛选，应用前景优良。
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