源头阻断包虫病病原细粒棘球绦虫传播的疫苗的制作方法

本发明属于疫苗领域，涉及用于防控细粒棘球绦虫传播的疫苗，特别涉及一种源头阻断包虫病病原细粒棘球绦虫传播的疫苗。

背景技术：

包虫病(echinococcosis)是由棘球绦虫幼虫寄生于人及某些动物体内所致的一种严重的人畜共患寄生虫疾病。95％以上的包虫病例为细粒棘球蚴(echinococcusgranulosus,e.g)感染所致的囊型包虫病(cystisechinococcosis,ce)，呈世界性分布。我国西部九省区(新疆、甘肃、宁夏、青海、四川、内蒙,西藏,云南和黑龙江省或自治区)为高流行区，人群患病率可高达1％～10％，严重影响我国西部农牧区的经济发展和群众健康。e.g为双宿主寄生虫，其成虫寄生于犬(终末宿主)的小肠内，幼虫寄生于人或家畜等食草动物(中间宿主)的脏器内，在犬和家畜之间往复循环。犬在包虫病的传播中起最关键作用，只有控制了犬体内的e.g，才能切断病原循环链，控制包虫病的传播。若能对犬实施免疫预防，将极大简化控制方法，加快控制进程。但目前犬免疫研制停滞不前，其中一个重要原因是保护性抗原的筛选及其生产的屏障。由于e.g寄生的中间宿主种类多、数量大、分布广等因素影响，我国包虫病的综合防治仍然面临着诸多困难和巨大挑战。

目前对包虫病患者的治疗其唯一治愈的方法是进行包虫囊摘除。但手术对人体带来的损伤比较大，且有可能复发。化疗药物的治疗效果非常有限，且可产生一些严重的不良反应。因此，需要研究更有效的解决方法，免疫预防是防止包虫病流行的最理想的途径，通过分子生物学技术将细粒棘球绦虫的抗原制成基因工程疫苗，为包虫病的免疫预防和免疫诊断提供了新的思路。国内外学者在这方面已经取得了很多的进展，抗e.g疫苗经历了死疫苗、基因工程亚单位蛋白疫苗等，但至今为止，还没有接种犬等终末宿主的疫苗，犬抗细粒棘球绦虫疫苗的研制将大大加快包虫病的控制和消除，是包虫病防控研究的当务之急。

egm家族融合蛋白(egm123)是细粒棘球绦虫成虫发育的特异表达基因，它们以egm-his融合蛋白的形式高效表达。

霍乱肠毒素(ct)是霍乱弧菌致病的主要毒力因子，同时也具有很强的免疫原性。ct具有2个亚单位，1个a亚单位(cta)和5个b亚单位(ctb)以氢键和盐桥连接在一起，形成紧凑而稳定的ab5型圆桶状六聚体蛋白，并能以高亲和力与表达于所有有核细胞细胞膜上的神经节苷酯(gm1)结合。

卡介苗(bcg)是一种弱化了的牛型分支杆菌，是目前预防结合病最有效的方法，自1921年以来全球已经有40亿人接种了bcg疫苗，其安全性已经得到了证实。随着大量的研究表明，bcg不只是一种活疫苗还是一种而且还是外源基因的表达载体，这个发现为bcg的应用开辟了新的领域。重组bcg疫苗是以bcg为载体利用基因工程技术将外源基因导入到bcg中，依靠bcg在宿主体内复制，表达一种或多种外源抗原，诱导对多种疾病的体液免疫和细胞免疫。bcg即是一种活疫苗也是目前所知道的最强的免疫佐剂之一。由此可见，重组bcg疫苗集载体与佐剂于一体，一次接种可获得强而持续的免疫保护。耻垢分枝杆菌(mycobacteriumsmegmatis，ms)是一种生长快转化率高的非典型分支杆菌，是一种非致病的分支杆菌，且成功的用来作为一个外源蛋白的表达宿主。耻垢分枝杆菌和bcg一样可以用来作为疫苗载体。

技术实现要素：

本发明的目的是提供两种新的用于防控细粒棘球绦虫传播的疫苗。

本发明所提供的用于防控细粒棘球绦虫传播的疫苗，具体为如下两种：

第一种：用于防控细粒棘球绦虫传播的亚单位疫苗，为(或其活性成分为)由霍乱毒素b亚单位和细粒棘球绦虫egm123蛋白融合而成的融合蛋白。

其中，所述霍乱毒素b亚单位位于所述融合蛋白的n端，所述细粒棘球绦虫egm123蛋白位于所述融合蛋白的c端。

在本发明中，所述霍乱毒素b亚单位的氨基酸序列具体如序列表中序列1所示；所述细粒棘球绦虫egm123蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列2所示。

更进一步，所述融合蛋白具体可为如下任一：

(a1)氨基酸序列如序列表中序列3的第24-285位所示的蛋白质；

(a2)氨基酸序列如序列表中序列3所示的蛋白质；

(a3)与(a1)或(a2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。

所述亚单位疫苗在使用时可以多次(如三次)重复免疫。

第二种：用于防控细粒棘球绦虫传播的成套疫苗，由分别单独包装的疫苗a和疫苗b组成；所述疫苗a为如上任一所述的亚单位疫苗；所述疫苗b(或其活性成分)为能够表达细粒棘球绦虫egm123蛋白的重组耻垢分枝杆菌。

在所述疫苗b中，所述细粒棘球绦虫egm123蛋白的氨基酸序列具体可如序列表中序列2所示。

在本发明中，所述能够表达细粒棘球绦虫egm123蛋白的重组耻垢分枝杆菌具体是按照包括如下步骤的方法制备得到的：将所述细粒棘球绦虫egm123蛋白的编码基因克隆入pmv261载体的多克隆位点(如ecori和sali)处，得到重组表达载体；将所述重组表达载体导入耻垢分枝杆菌后得到所述能够表达细粒棘球绦虫egm123蛋白的重组耻垢分枝杆菌。

更进一步，所述细粒棘球绦虫egm123蛋白的编码基因具体为序列表中序列4所示dna分子。

所述成套疫苗和记载有如下内容的可读性载体在制备用于防控细粒棘球绦虫传播的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。所述如下内容具体可为：在用于防控细粒棘球绦虫传播时，所述疫苗a作为基础免疫疫苗使用，所述疫苗b作为加强免疫疫苗使用。

其中，在用于防控细粒棘球绦虫传播时，所述疫苗a作为基础免疫疫苗免疫一次，加强免疫使用所述疫苗b，以增强免疫效果，持续维持抗体水平。在本发明的一个实施例中，所述疫苗a作为基础免疫疫苗免疫一次，2周后采用所述疫苗b进行加强免疫。

所述亚单位疫苗或所述成套疫苗在制备用于预防和/或控制由于细粒棘球绦虫传播所致疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

其中，所述由于细粒棘球绦虫传播所致疾病具体可为包虫病；更加具体为囊型包虫病。

所述亚单位疫苗或所述成套疫苗在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(a1)制备能够提高机体抗细粒棘球绦虫egm123蛋白的抗血清效价的产品；

(a2)制备能够增强肠道黏膜免疫反应的产品。

本发明所提供的所述亚单位疫苗或所述成套疫苗可用于狗。

本发明以霍乱毒素b亚单位为载体制备细粒棘球绦虫egm123基因亚单位疫苗，用该疫苗免疫小鼠后从免疫后小鼠血清效价数据上看，可见该疫苗能起到很高的免疫效果。在此基础上，进一步给小鼠使用表达细粒棘球绦虫egm123蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗进行加强免疫，结果显示小鼠血清效价得到非常明显的提升。可见：本发明所提供的疫苗能够刺激宿主体内免疫应答，提高宿主的免疫水平，在抗包虫病感染中起到重要的保护作用。另外，本发明所提供的疫苗还具有增强肠道粘膜免疫反应的功效。

附图说明

图1为不同时间下iptg诱导融合蛋白ctb-egm123的表达。m：标准分子质量；1：ctb-egm123未诱导；2：ctb-egm123诱导上清2h；3：ctb-egm123诱导沉淀2h；4：ctb-egm123诱导上清3h；5：ctb-egm123诱导沉淀3h；6：ctb-egm123诱导上清4h；7：ctb-egm123诱导沉淀4h；8：ctb-egm123诱导上清5h；9：ctb-egm123诱导沉淀5h。

图2为egm123蛋白的表达。m：标准分子质量；1-4：egm123诱导沉淀5h；5-7：ctb-egm123诱导沉淀5h。

图3为融合蛋白ctb-egm123免疫活性检测。m：蛋白分子质量标准；1：pet28a裂解液；2：pet28a/ctb裂解液；3、pet28a/ctb-egm123。

图4为融合蛋白ctb-egm123和egm123蛋白的免疫活性检测。m：标准分子质量；1：gst蛋白；2：融合蛋白pet28a/ctb-egm123；3：pet28a/egm123蛋白。

图5为egm123和ctb-egm123蛋白免疫小鼠后血清效价的检测免疫效果的对比。

图6为egm123和ctb-egm123蛋白免疫犬后血清效价的检测免疫效果的对比。

图7为表达细粒棘球绦虫egm123蛋白重组耻垢分枝杆菌阳性克隆pcr鉴定。1：阴性对照；2：阳性pmv261/egm123质粒对照；3-7：重组耻垢分枝杆菌阳性克隆。

图8为sds-page检测重组耻垢分枝杆菌蛋白表达。1：egm123蛋白；2：未转化重组质粒的正常耻垢分枝杆菌；3：重组耻垢分枝杆菌；4：重组耻垢分枝杆菌42℃热诱导5小时；m：标准分子质量。

图9为westernblotting检测重组耻垢分枝杆菌蛋白表达。1：egm123蛋白；2：未转化重组质粒的正常耻垢分枝杆菌；3：重组耻垢分枝杆菌；4：重组耻垢分枝杆菌42℃热诱导5小时；m：标准分子质量。

图10为检测ctb-egm123为基础免疫，细粒棘球绦虫egm123蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗为增强免疫的结果。横坐标表示免疫及增强免疫的时间点，纵坐标表示免疫前后产生的抗体水平。0：免疫前。1：ctb-egm123基础免疫后2周；2：细粒棘球绦虫egm123蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗加强免疫后1周；3：细粒棘球绦虫egm123蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗加强免疫后3周；4：细粒棘球绦虫egm123蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗加强免疫后4周。5：细粒棘球绦虫egm123蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗加强免疫后5周；6：细粒棘球绦虫egm123蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗加强免疫后6周；7：细粒棘球绦虫egm123蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗加强免疫后7周；8：细粒棘球绦虫egm123蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗加强免疫后8周；9：细粒棘球绦虫egm123蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗加强免疫后9周；10：细粒棘球绦虫egm123蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗加强免疫后10周。抗体水平：吸光值(od405nm)。

图11为egm123和ctb-egm123蛋白免疫小鼠后，小肠组织学观察结果(he染色，100x,400x)。

图12为egm123和ctb-egm123蛋白免疫小鼠后，小肠组织中iga、igg2a、igg2b、igg3抗体表达的免疫组化结果。goatantimouseiga(a90-403p)，goatantimouseigg2a(a90-107p)，goatantimouseigg2b(a90-109p)，goatantimouseigg3(a90-111p)(blthyl)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pet28a：novagen,inc.,madison,wi。

pmv261载体：biovectorsciencelab。

耻垢分枝杆菌(mc2155)：biovectorsciencelab。

实施例1、细粒棘球绦虫重组ctb-egm123疫苗及其免疫效果检测

一、细粒棘球绦虫重组ctb-egm123疫苗的制备

1、重组原核表达载体的构建

(1)重组原核表达载体pet28a/ctb-egm123的构建

首先，根据原核表达载体pet28a上的多克隆位点，在pet28a载体上引入ctb序列，具体为：人工合成两端分别带有酶切位点nhei和bamhi的ctb序列(“gctagc+序列5+ggatcc”)，并经nhei和bamhi酶切后与经过同样酶切的pet28a载体的骨架大片段相连，测序验证正确后得到中间载体pet28a/ctb。

然后，根据genbank上已经发表的egm123基因编码序列和设计并合成特异性引物用于扩增egm123目的基因片段。引物序列为：

primer-f1(下划线部分为bamhi的识别序列)：

5’-gcggatccatggaaccagtgaattttgcctgccc-3’；

primer-r1(下划线部分为xhoi的识别序列)：

5’-ccctcgagtttcgtctttaaggcacgaaacaacttgaaaagc-3’。

引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。以细粒棘球绦虫成虫cdna(提取成虫总rna后，经反转录后得到cdna)为模板扩增egm123基因片段。反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

将纯化后的egm123pcr产物和中间载体pet28a/ctb分别经bamhi和xhoi双酶切之后回收，连接，转入大肠杆菌bl21，转化菌涂布于含卡那霉素(50μg/ml)的lb培养板，于37℃培养箱倒置培养过夜；挑取单克隆活化进行pcr鉴定，提取阳性克隆质粒再通过bamhi和xhoi双酶切鉴定，初筛阳性菌株送至华大基因公司进行测序鉴定。将经测序后表明在pet28a的酶切位点nhei和bamhi之间插入序列5所示dna片段，同时在酶切位点bamhi和xhoi之间插入序列4所示dna片段的重组质粒命名为pet28a/ctb-egm123。其中，序列4为egm123基因序列，编码序列表中序列2所示的egm123蛋白；序列5为ctb基因，编码序列表中序列1所示的ctb蛋白。

重组表达载体pet28a/ctb-egm123能够编码序列表中序列3所示的蛋白质，其中第1-10位为his标签序列，第24-86位为ctb蛋白序列，第89-285位为egm123蛋白序列，286-293标签序列。

(2)重组原核表达载体pet28a/egm123的构建

根据genbank上已经发表的egm123基因编码序列和pet28a原核表达载体上的多克隆位点，设计并合成特异性引物用于扩增egm123目的基因片段，为了便于定向克隆，在上、下游引物的5’端分别引入了一个酶切位点ecori和sali，并在两条引物的端部加上保护性碱基。引物序列为：

primer-f2(下划线部分为ecori的识别序列)：

5’-catgaattcatggaaccagtgaattttgcc-3’；

primer-r2(下划线部分为sali的识别序列)：

5’-actgtcgacttatttcgtctttaaggcacgaaac-3’。

引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。以细粒棘球绦虫成虫cdna(提取成虫总rna后，经反转录后得到cdna)为模板扩增egm123基因片段。反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

将纯化后的egm123pcr产物和原核表达载体pet28a分别经ecori和sali双酶切之后回收，连接，转入大肠杆菌bl21，转化菌涂布于含卡那霉素(50μg/ml)的lb培养板，于37℃培养箱倒置培养过夜；挑取单克隆活化进行pcr鉴定，提取阳性克隆质粒再通过ecori和sali双酶切鉴定，初筛阳性菌株送至华大基因公司进行测序鉴定。

将经测序后表明在pet28a的酶切位点ecori和sali之间插入序列4所示dna片段的重组质粒命名为pet28a/egm123。其中，序列4为egm123基因序列，编码序列表中序列2所示的egm123蛋白。

2、融合蛋白ctb-egm123以及egm123蛋白的表达和纯化

(1)融合蛋白ctb-egm123的表达

将步骤1构建的测序鉴定正确的含有重组表达载体pet28a/ctb-egm123的大肠杆菌bl21阳性克隆接种于含卡那霉素(50μg/ml)的lb培养基中，于37℃，220rpm(每分钟转速)振荡培养过夜；取过夜培养物，按10％(体积分数)重新接种于含相同浓度卡那霉素的lb培养基中，37℃，220rpm培养至od600为0.6左右时，加iptg至终浓度为0.4mmol/l，继续振荡培养5h。取培养物离心，收集细菌沉淀，用预冷的pbs缓冲液重悬沉淀，一边冰浴，一边先用细胞破碎仪处理菌体，再用超声仪破碎裂解菌体(功率400w，时间5s，间歇5s，总时长为2min)，离心后分别取上清和沉淀进行sds-page(配制5％浓缩胶，12％分离胶，25ma恒流电泳约1h，用0.1％考马斯亮蓝染色2h，然后脱色至本底无色为止)分析检测蛋白表达情况，以表达过程中收集的诱导前菌液做为未诱导对照。

由图1和图2中可以看出，将构建好的重组表达载体pet28a/ctb-egm123转化到大肠杆菌bl21中，经0.4mmiptg诱导培养5h后对菌体进行超声破碎、离心，然后分别对上清和沉淀进行sds-page分析，结果显示与未诱导菌相比，诱导菌在35kda左右有明显差异表达的蛋白条带，与目的蛋白的预测值相一致。对表达菌体破碎和超声处理离心后发现目的蛋白主要存在于沉淀中，说明该重组蛋白ctb-egm123主要以包涵体形式表达，同时发现目的蛋白的表达会随着时间的增加而增加。

(2)egm123蛋白的表达

将步骤1构建的测序鉴定正确的含有重组表达载体pet28a/egm123的大肠杆菌bl21阳性克隆接种于含卡那霉素(50μg/ml)的lb培养基中，于37℃，220rpm振荡培养过夜；取过夜培养物，按1％(体积分数)重新接种于含相同浓度卡那霉素的lb培养基中，37℃，220rpm培养至od600为0.6左右时，加入iptg至终浓度为0.4mmol/l，继续振荡培养5h。取培养物离心，收集细菌沉淀，用预冷的pbs缓冲液重悬沉淀，冰浴超声破碎裂解菌体(功率200w，时间5s，间歇3s，循环10次)，离心后分别取上清和沉淀进行sds-page(配制5％浓缩胶，12％分离胶，25ma恒流电泳约1h，用0.1％考马斯亮蓝染色2h，然后脱色至本底无色为止)分析检测蛋白表达情况，以表达过程中收集的诱导前菌液作为未诱导对照。

由图2中可以看出，将构建好的pet28a/egm123转化到大肠杆菌bl21中，经0.4mmiptg诱导培养5h后对菌体进行超声破碎、离心，然后分别对上清和沉淀进行sds-page分析，结果显示与未诱导菌相比，诱导菌在，诱导菌在25～35kda之间有明显差异表达的蛋白条带，与目的蛋白的预测值相一致。对表达菌体破碎和超声处理离心后发现目的蛋白主要存在于沉淀中，说明该重组蛋白主要以包涵体形式表达，同时发现目的蛋白的高表达。

(3)融合蛋白ctb-egm123以及egm123蛋白的纯化

采用固定金属离子亲和色谱(imac,immobilizedmetal-ionaffinitychromatography)方法纯化。

3、融合蛋白ctb-egm123和egm123蛋白的免疫活性鉴定

采用westernblotting法将未诱导和诱导表达的含有重组表达载体pet28a/ctb-egm123的裂解液及融合纯化蛋白进行sds-page电泳，然后电压80v印迹转移2h，将pvdf膜浸入5％的脱脂奶粉溶液中于37℃封闭1h；pbst洗3次，每次5min；将pvdf膜浸泡于重组egm123-his抗原免疫的兔血清(制备方法如下：新西兰大白兔3只，背部皮下接种100微克(μg)egm123-his蛋白，蛋白溶液与等体积的弗氏完全佐剂(sigma)混合，乳化。3周后，皮下接种100μgegm123-his蛋白，蛋白溶液与等体积的弗氏不完全佐剂混合，乳化，后接种。再分别于两周和四周后，腹腔接种100μgegm123-his蛋白，蛋白溶液与等体积的弗氏不完全佐剂混合，乳化，后接种，耳静脉采血，测定血清效价，血清效价在1:500000以上者，麻醉后，从心脏采血，制备高免血清)(1：400体积比稀释)中，37℃孵育1h，pbst洗3次，每次5min；加抗兔的igg-hrp(thermoscientific公司产品，货号为pc1837159)(1：2000体积比稀释)，室温孵育1h，pbst洗3次，每次5min，使用4-氯-1-萘酚法显色，pbs终止反应。

试验同时设置以载体pet28a、pet28a/ctb、pet28a/egm123分别替代重组表达载体pet28a/ctb-egm123的对照组。同时设置以正常兔血清替代重组egm123-his抗原免疫的兔血清的对照。

由图3和图4可以看出，将pet28a裂解液、pet28a/ctb、pet28a/ctb-egm123及pet28a/egm123经westernblotting分析鉴定，同时使用兔抗egm123血清和正常兔血清做对比，结果表明融合蛋白ctb-egm123和egm123蛋白能被纯化过的egm123-his重组蛋白免疫兔的多抗血清识别，说明诱导表达的融合蛋白ctb-egm123和egm123蛋白具有较强的免疫原性。

二、细粒棘球绦虫重组ctb-egm123疫苗所激起的抗体效价测定

1、小鼠实验

用步骤一制备并已纯化好的融合蛋白ctb-egm123免疫balb/c小鼠，每次免疫接种为20μg/只，免疫同时要加入弗氏佐剂。将弗氏佐剂(第一次为弗氏完全佐剂，第二到三次为弗氏不完全佐剂)与融合蛋白ctb-egm123按照1:1比例(体积比)完全混合为乳剂，进行皮下免疫。三免完成一周后，用elisa测定血清抗体效价。

用elisa测定血清抗体效价的具体操作如下：将egm123-his配成用0.5μg/ml的ph9.6碳酸盐包被液，每孔加入100μl，4℃过夜后，弃包被液，pbs洗3次，每孔加入250μl的5％的脱脂奶粉/pbs。小鼠血清用pbst(含有0.05％tween-20的pbs)做1:20000的初始稀释，然后做1:2的系列稀释，分别将100μl的稀释血清加入奶粉封闭的elisa孔里，37c孵育1小时，用pbst洗板4次，加入100μl羊抗鼠酶标抗体(1:5000稀释),37c孵育1小时，用pbst洗板4次，加入底物，显色30分钟后，用elisa仪读od405的值。高于空白孔2倍的稀释孔的稀释度为效价。

试验同时设置以步骤一制备并已纯化好的egm123蛋白替代融合蛋白ctb-egm123的对照，并以未经免疫的balb/c小鼠作为正常对照。

结果如图5所示，由图可见：小鼠三次免疫后测定血清效价，ctb-egm123免疫前后产生的抗体水平高于egm123。说明用ctb-egm123蛋白免疫小鼠起到了好的免疫效果。与正常小鼠血清相比，ctb-egm123蛋白免疫后的小鼠血清抗体效价可达到1：640000以上。

2、狗实验

从杭州中心购置大比格犬30只，其中10只皮下接种100微克(μg)步骤一制备并已纯化好的egm123蛋白，10只接种步骤一制备并已纯化好的融合蛋白ctb-egm123，10只接种佐剂。蛋白溶液与等体积100微克(μg)quila佐剂(invivogen，l77-374)混合，4℃搅拌乳化1时，背部皮下多点注射(一般3-4个点，0.2ml/点)；然后分别于3周和5周后，皮下接种与上相同剂型和剂量的蛋白和/或佐剂，第三次接种后第1周，腿静脉采血，测定血清效价。方法同小鼠测定血清效价(犬血清用pbst以1：1000的初始稀释，然后做1:2的系列稀释；二抗用羊抗犬酶标抗体(bethyl，a40-118p)(1:5000稀释)。

结果如图6所示，由图可见：狗免疫后血清效价结果进一步证明，ctb-egm123免疫前后产生的抗体水平高于egm123，说明ctb-egm123蛋白可以起到高的免疫反应。

实施例2、细粒棘球绦虫重组ctb-egm123疫苗与细粒棘球绦虫egm123蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗联合免疫效果检测

一、细粒棘球绦虫egm123蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗的制备

1、重组质粒pmv261-egm123的构建

根据genbank上已发表的egm123序列设计引物，引物序列为：

primer-f2(下划线部分为ecori的识别序列)：

5’-catgaattcatggaaccagtgaattttgcc-3’；

primer-r2(下划线部分为sali的识别序列)：

5’-actgtcgacttatttcgtctttaaggcacgaaac-3’。

引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。以细粒棘球绦虫成虫cdna(提取成虫总rna后，经反转录后得到cdna)为模板扩增egm123基因片段。pcr扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸7min。1％凝胶电泳鉴定。

将pcr产物切胶回收，纯化。将纯化后的egm123pcr产物和大肠杆菌-分枝杆菌双穿梭表达载体pmv261分别进行ecori和sali双酶切之后回收，连接后转入到大肠杆菌中，将转化后的大肠杆菌涂布在含有卡那霉素的lb平板上，37℃培养过夜。挑取单克隆培养活化pcr鉴定，并提取重组质粒测序验证正确后-80℃保存。

将经测序后表明在pmv261的酶切位点ecori和sali之间插入序列4所示dna片段的重组质粒命名为pmv261/egm123。其中，序列4为egm123基因序列，编码序列表中序列2所示的egm123蛋白。

2、重组质粒pmv261/egm123转化耻垢分枝杆菌

(1)感受态细菌的制备：将-80℃冻存的耻垢分枝杆菌分区划线的方法接种到加入卡那霉素的m7h10培养基中培养基上，37℃培养。挑取单克隆接种到50毫升m7h9液体培养基中，生长到对数生长期(od600＝0.6-1.0)后，冰浴2.5小时，4℃，3000转离心10分钟，弃去上清。沉淀悬浮于预冷的一半体积的10％无菌甘油中，4℃，2000转离心10分钟，弃去上清。沉淀悬浮于又减少一半体积的10％无菌甘油中，4℃，1500转离心10分钟，弃去上清。沉淀悬浮于1毫升的10％无菌甘油中。

(2)重组质粒转化耻垢分枝杆菌：取出80μl感受态细菌于ep管中，加入2μl重组质粒pmv261/egm123(约0.1μg)，冰浴2min。上述液体转入0.2cm的电转杯中，将电转化仪设置为2500v，25μf，genecontroller设置为1000欧姆，电击转化。加入1ml预热的m7h9培养基，轻轻混匀，转入1.5mlep管中，37℃孵育2h。取出100μl的菌液用涂布器均匀涂于含卡那霉素50μg/ml的m7h10培养基平板上，37℃孵育。

(3)抗性选择和pcr鉴定：在培养了2-3天后，长出转化子，挑取阳性克隆溶于20μl去离子水中，pcr扩增后电泳鉴定。pcr体系如下：2×taqpcrmastermix(tiangen公司产品，货号为kt201-02)10μl；上游引物(primer-f2)0.5μl；下游引物(primer-r2)0.5μl；去离子水4μl；模板5μl。反应条件如下：94℃3分钟；94℃30秒；55℃30秒；72℃30秒，35个循环，72℃5分钟。将扩增好的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳。

结果如图7所示，随机挑选5个克隆结果都为阳性。表明，在长出的转化子中有重组质粒pmv261/egm123存在。

(4)体外表达鉴定：将阳性克隆在含有30μg/ml卡那霉素的m7h9培养基中培养，培养条件为37℃，220转震荡培养。当培养到对数生长期时，升高温度到42℃继续培养5小时，培养结束后4000转离心20分钟，弃去上清，沉淀用pbs洗涤3次后用pbs悬浮加入上样缓冲液，100℃煮5分钟，sds-page，westernblotting检测蛋白表达情况。westernblotting实验用重组egm123-his抗原免疫的兔血清(制备方法同上)检测重组耻垢分枝杆菌中egm123蛋白的表达情况，同时设置阳性对照egm123蛋白，以及没有转化重组质粒的正常耻垢分枝杆菌。

结果如图8和图9所示，经过蛋白电泳后考马斯亮蓝染色，并没有显示出很明显的表达条带，但是经过转膜并加入用重组egm123-his抗原免疫的兔血清后，阳性对照egm123蛋白有反应条带，没有转化重组质粒的正常耻垢分枝杆菌没有特异性的反应条带，而转化后的重组耻垢分枝杆菌也能识别抗egm123抗体。表明了在重组耻垢分枝杆菌中能表达出egm123蛋白，可能以多聚体的形式表达。经过42℃培养5小时后westernblotting还是能检测到特异性的条带，表明该重组疫苗有很好的热稳定性，即使升高温度也能很好的表达蛋白。

二、细粒棘球绦虫重组ctb-egm123疫苗与细粒棘球绦虫egm123蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗联合免疫

实施例1步骤一制备并已纯化好的融合蛋白ctb-egm123免疫balb/c小鼠，25μg/只，与等量的qina佐剂混合乳化，采取皮下多点注射。在基础免疫两周后采集血清，并采用2×10⁶cfu的细粒棘球绦虫egm123蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗(步骤一制备的能够表达细粒棘球绦虫egm123蛋白的阳性重组耻垢分枝杆菌)腹腔接种作为加强免疫。在加强后的每一周收集小鼠血清-20℃冻存，在持续了10周后通过elisa方法检测收集血清中抗体变化情况。

结果如图10所示，由图可见：在用细粒棘球绦虫egm123蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗增强1周后抗体水平提高，第五周后，抗体水平出现了明显的增加。并且抗体水平在后面出现了一段时间的平台期，说明细粒棘球绦虫egm123蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗对于ctb-egm123蛋白作为的亚单位疫苗的免疫原性具有一定的增强作用，加强一次就能维持抗体水平的平稳至10周，可以作为一种联合疫苗与ctb-egm123联合使用。

实施例3、细粒棘球绦虫重组ctb-egm123疫苗增强肠道粘膜免疫反应

用实施例1步骤一制备并已纯化好的融合蛋白ctb-egm123免疫balb/c小鼠，每次免疫接种为20μg/只，免疫同时要加入弗氏佐剂。将弗氏佐剂(第一次为弗氏完全佐剂，第二到三次为弗氏不完全佐剂)与融合蛋白ctb-egm1233按照1:1比例(体积比)完全混合为乳剂，进行皮下免疫。三免完成一周后，采用小鼠免疫后小肠部位组织观察及免疫组化检测方法，取小肠用生理盐水清洗后加入4％的多聚甲醛固定，进行常规的石蜡包埋、切片，he染色组织学观察。goatantimouseiga(a90-403p)，goatantimouseigg2a(a90-107p)，goatantimouseigg2b(a90-109p)，goatantimouseigg3(a90-111p)(blthyl)。

实验同时设置以步骤一制备并已纯化好的egm123蛋白替代融合蛋白ctb-egm123的对照，并以未经免疫的balb/c小鼠作为正常对照。

结果如图11所示，肠腺体周围炎性细胞增加(☆)；淋巴组织反应性增生，伴淋巴细胞灶性浸润(★)；肠绒毛被拉长、肠上皮有嗜酸性变(100×放大图片中箭头所示处)。pbs组：为正常组，无病变；ctb-egm123组：肠绒毛变长，伴淋巴细胞灶性浸润，肠上皮有嗜酸性变；egm123组：肠绒毛变长，腺体周围淋巴细胞浸润。

按免疫组化试剂盒(zli9018，中衫金桥)说明进行免疫组化检测结果如图12所示，小肠组织中iga、igg2a、igg2b、igg3抗体表达。iga：空白对照组与pbs组无阳性反应；ctb-egm123组呈阳性反应，着色比egm123组较深，着色点主要位于绒毛，黏膜面腔缘上，间质中有着色点；egm123组有阳性反应，着色点在于胞浆，但着色比ctb-egm123组浅。igg2a：空白对照组与pbs组都没有变化；ctb-egm123组有阳性反应，着色比egm123组较深，阳性反应强，着色点主要位于绒毛，黏膜面腔缘上；egm123组有阳性反应，着色点在黏膜外腔缘上，但着色比ctb-egm123组弱。igg2b：空白对照组与pbs组均无变化；ctb-egm123组有阳性反应，着色比egm123组较深，阳性反应强，着色点主要位于绒毛，黏膜外腔缘上；egm123组有阳性反应，着色点在于黏膜外腔缘上，阳性反应与ctb-egm123组比相对较弱。igg3：空白对照组与pbs组都均无变化；ctb-egm123组有较强的阳性反应，着色点主要位于绒毛，黏膜外腔缘上；egm123组有阳性反应，反应较弱，与ctb/123组有明显差异。上述结果表明，重组ctb-egm123疫苗有明显的增强肠道黏膜免疫反应。

综合各实施例的检测结果，可见：本发明将ctb直接融合于细粒棘球绦虫egm家族蛋白(egm123)构建成蛋白佐剂疫苗，提高了疫苗蛋白的抗原性和肠道粘膜免疫反应。本发明将egm123基因序列构建到耻垢分枝杆菌的表达质粒上，利用耻垢分枝杆菌在宿主体内存活和表达的特性，并能激活细胞免疫等特性，研制了长效活载体疫苗。

<110>新疆医科大学第一附属医院、新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）

<120>源头阻断包虫病病原细粒棘球绦虫传播的疫苗

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