本发明属于生物医药
技术领域：
，具体涉及一种免疫调节剂及其制备方法和应用。
背景技术：
：系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，sle)是一种弥漫性、全身性自身免疫病。在环境因素、雌激素水平等各种因素相互作用下，导致t淋巴细胞减少、t抑制细胞功能降低、b细胞过度增生，产生大量的自身抗体，并与体内相应的自身抗原结合形成相应的免疫复合物，沉积在皮肤、关节、小血管、肾小球等部位。在补体的参与下，引起急慢性炎症及组织坏死(如狼疮肾炎)，或抗体直接与组织细胞抗原作用，引起细胞破坏(如红细胞、淋巴细胞及血小板壁的特异性抗原与相应的自身抗体结合，分别引起溶血性贫血、淋巴细胞减少症和血小板减少症)。sle可累及机体多个系统，包括关节、肌肉、肾脏、神经系统、血液系统、心脏和消化系统等，给患者多个组织脏器带来病理损害。sle的治疗强调早期诊断和早期治疗，以避免或延缓组织的病理损害。现有治疗药物主要包括非甾体抗炎药、抗疟药、糖皮质激素和免疫抑制剂，其中非甾体抗炎药、抗疟药和糖皮质激素主要用于症状轻微，无明显内脏损害的患者症状改善治疗，以阻止或减少免疫细胞对内脏的损伤；免疫抑制剂如环磷酰胺、硫唑嘌呤等是治疗sle的有效药物之一，能有效的诱导疾病缓解，阻止和逆转病变发展，改善远期预后，其缺陷主要在于长期使用，会使机体免疫功能受到抑制，不能从根本上治疗机体免疫系统紊乱和病情反复。系统性红斑狼疮作为一种自身免疫性疾病，给予抗炎治疗或者免疫抑制治疗，其主要作用在于改善或组织疾病病情的短期发展，且长期使用易导致免疫系统功能紊乱，不能对疾病长期发展带来获益。因此，部分学者提出系统性红斑狼疮的治疗应进行免疫调节，通过影响其调节性t细胞分化、细胞因子分泌、免疫球蛋白的生成等诸多环节来阻断和改善疾病进程，而非免疫抑制。目前，暂无免疫调节剂在系统性红斑狼疮治疗中的应用。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种治疗sle的免疫调节剂及其制备方法，该制剂对于sle的治疗具有较好的效果。本发明的具体技术方案如下：一种免疫调节剂，包括：nkt细胞、树状突细胞、il-11、重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、人血白蛋白和医学上可接受的溶剂。树状突细胞在维持免疫系统的平衡中发挥了重要的作用，其具有抗原提呈与免疫激活作用，免疫调节作用，免疫耐受的维持和诱导，对凋亡细胞的捕获等作用。sle患者体内存在t细胞功能缺陷，进一步的研究表明t细胞的功能缺陷是由潜在的抗原呈递细胞功能缺陷所致，而树状突细胞为最重要的抗原呈递细胞，所以树状突细胞的功能缺陷是导致t细胞功能缺陷的主要原因。在sle患者体内无论是b细胞异常引起的体液免疫反应还是t细胞异常引起的细胞免疫反应都与树状突细胞的功能改变有直接关系。nkt细胞主要包括免疫调节和细胞毒作用，nkt细胞受到刺激后，可以分泌大量的il-11，γ-干扰素，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，白介素13和其它细胞因子和趋化因子，发挥免疫调节作用。系统性红斑狼疮导致血液系统中的粒细胞数减少，而重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子能够作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能。il-11是造血微环境基质细胞产生的多功能细胞因子，有明显促血小板再生的作用，在骨髓造血干细胞的增殖分化中，可刺激巨核细胞成熟并分化为血小板。il-11应用于系统性红斑狼疮血小板减少患者都取得了一定的疗效，证明了il-11可以使患者的巨核细胞成熟分化为血小板。优选地，所述nkt细胞的浓度为5×107～1×108cell/ml；所述树状突细胞的浓度为5×107～1×108cell/ml；所述il-11的浓度为10～30ng/ml；所述重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的浓度为20～40ng/ml；所述人血白蛋白的浓度为1％～5％。更优选地，所述il-11的浓度为20ng/ml；所述重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的浓度为30ng/ml；所述人血白蛋白的浓度为2％。优选地，所述溶剂选自生理盐水或5％葡萄糖注射溶液。优选地，所述免疫调节剂的保存条件为0～4℃。本发明还提供了上述免疫调节剂的制备方法，将人血白蛋白、il-11、重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、nkt细胞和树状突细胞在溶剂中混合，得到所述免疫调节剂。优选地，所述nkt细胞和树状突细胞由外周血单个核细胞诱导分化而来。更优选地，所述nkt细胞的诱导剂为il-2、il-15和il-21；更优选的，所述树状突细胞诱导剂为人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、il-4和tnf-α。本发明还提供了上述的免疫调节剂或上述制备方法得到的免疫调节剂在制备预防或治疗系统性红斑狼疮药物中的应用。本发明的有益效果主要包括以下几点：(1)采用树突状细胞和nkt细胞这两种分化成熟的免疫调节细胞，在回输后可立即发挥效果，联合il-11使用，增强两者在回输后产生的免疫效果，改善机体免疫亢进的情况，缓解病情；(2)采用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子两类型细胞因子，可持续的调控机体内部的造血干细胞进入分裂周期，持续改善机体的免疫细胞的成分比例，从根本上解决机体免疫系统紊乱的问题；(3)选用外周血单个核细胞，进行nkt细胞和树突状细胞的分化培养，同时添加细胞因子，制剂在会输后，可马上发挥作用；il-11和重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子会刺激造血干细胞持续分化，保证的疗效持续稳定。具体实施方式为了解决上述技术问题，本发明提供了一种治疗sle的免疫调节剂及其制备方法，该制剂对于sle的治疗具有较好的效果。下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例11.外周血单个核细胞的分离提取(1)将装有外周血的抗凝管放入无菌操作台中，用一次性移液管将抗凝管中的外周血转移到50ml离心管中，按照1:1的体积比例加入生理盐水，混匀；(2)将步骤(1)得到的血液稀释液缓慢加入装有淋巴细胞分离液的sepmate离心管中(血液稀释液：淋巴分离液＝2:1)，700g离心15min后取上清；(3)将上清液用rpmi1640培养基重悬，500g离心5min去上清，获得外周血单个核细胞沉淀；(4)将外周血单个核细胞沉淀加入rpmi1640+5％fbs完全培养基重悬，按1×106cells/ml的浓度接种于培养瓶中，置于37℃、5％co2培养箱中培养2h，轻轻吹打，弃去悬浮非贴壁细胞，即得到贴壁的外周血单个核细胞。2.nkt细胞的培养(1)取贴壁外周血单个核细胞，加入细胞因子il-2(500u/ml)、il-15(50ng/ml)和il-21(50ng/ml)，继续培养；(2)每天观察细胞，在第5天根据细胞增殖情况进行补液，细胞有增殖则补加含il-2(500u/ml)和il-15(50ng/ml)的完全培养基，并调整细胞密度为1×106cells/ml；(3)每隔3天根据细胞增殖情况补加含il-2(500u/ml)和il-15(50ng/ml)的完全培养基，继续培养9天，得到nkt细胞。3.树状突细胞的培养(1)取贴壁外周血单个核细胞，按照人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子1μg/ml、il-410ng/m的终浓度加入人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和il-4，继续培养，每3.5天换液一次；(2)培养至第7天加入tnf-α30ng/ml，第8天收获悬浮细胞即得到树状突细胞。4.nkt细胞和树状突细胞的流式鉴定分别取上述nkt细胞和树状突细胞，制成1×106cells/ml的细胞悬液，往nkt加入cd3、cd56抗体各5μl，树突状细胞加入hla-dr、cd80、cd86各5μl，室温下避光孵育20min，同时设空白对照，1500r/min离心，弃上清，用rmpi1640基础培养基重悬后上机检测。nkt细胞流式检测结果如表1所示，流式鉴定结果显示nkt细胞具有较高的纯度。表1.nkt细胞流式鉴定结果cd3cd3+cd56+第一次检90.6％36.7％第二次检测92.8％40.1％第三次检测91.5％38.2％树状突细胞的流式检测结果如表2所示，流式鉴定结果显示树突状细胞具有较高的纯度。表2.树状突细胞流式鉴定结果cd80cd86hla-dr第一次检82.1％70.4％96.7％第二次检测83.6％73.1％98.7％第三次检测79.8％70.5％96.2％5.免疫调节剂的制备(1)将人血白蛋白加入生理盐水中，至终浓度为2％；(2)将20ng/ml的il-11、30ng/ml重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhgm-csf)加入含2％人血白蛋白的生理盐水中，混匀；(3)将nkt细胞和树突状细胞按照5×107～1×108cell/ml的浓度加入含有人血白蛋白和细胞因子的生理盐水中，充分混匀后置于4℃条件下保存。按照上述步骤制备如表3所示配方的3种免疫调节剂。表3.不同免疫调节剂各组分比例实施例21.sle模型鼠和正常小鼠sle模型鼠为eb病毒膜抗原bllf1基因转基因小鼠，56只，雌性，体重30～40g；正常小鼠体重30～40g(8只)，购自中山大学医学部实验动物研究中心。2.动物分组及给药正常小鼠用于作为空白组，sle模型鼠随机平均分为7组，分别为模型组、对照组1、对照组2、对照组3、实验组1、实验组2和实验组3，并按照表4所示给药方式给药治疗。表4实验分组及给药分组给药给药时间空白组生理盐水每天1次，连续尾静脉注射14天模型组生理盐水每天1次，连续尾静脉注射14天对照组1回注血必净注射液每天1次，连续尾静脉注射14天对照组2糖皮质激素每天1次，连续尾静脉注射14天对照组3免疫抑制剂硫唑嘌呤每天1次，连续尾静脉注射14天实验组1免疫调节剂a每5天1次，连续尾静脉注射15天实验组2免疫调节剂b每5天1次，连续尾静脉注射15天实验组3免疫调节剂c每5天1次，连续尾静脉注射15天3.检测指标给药结束后，小鼠摘眼取血，1500rpm室温离心15min，取血清2500rpm再离心15min，分别用试剂盒检测血液中的肌酐、尿素氮、inf-α、免疫球蛋白m(igm)、免疫球蛋白g(igg)、补体3和补体4的水平。系统性红斑狼疮会导致肾损伤，进一步影响肾组织功能，肌酐和尿素氮是衡量肾功能的重要指标之一，inf-α是衡量肾组织损伤的重要指标之一。各组小鼠血清中的肌酐、尿素氮和inf-α的含量如表5所示。数据显示，模型组的肌酐、尿素氮、inf-α均高于空白组，具有极显著差异(p<0.001)，说明模型组的三检测指标符合实验所需。对照组1～3与模型组相比，肌酐、尿素氮、inf-α均低于模型组，但不具有统计学意义(p>0.05)说明对照组1～3对缓解sle的病情不显著。实验组1～3与模型组相比，肌酐、尿素氮、inf-α均低于模型组，且具有统计学意义(p<0.05)；与空白组相比，没有统计学意义(p>0.05)，说明实验组1～3对能有效缓解sle的病情。表5.各组小鼠血清中的肌酐、尿素氮和inf-α的含量分组肌酐(μmol/l)尿素氮(mmol/l)inf-α(pg/ml)空白组23.56±1.955.68±0.8452.158±28.467模型组36.91±2.04**13.97±2.64**120.623±42.09*对照组129.25±3.1810.04±3.3780.652±51.76对照组230.38±2.569.15±2.4586.745±18.39对照组328.13±3.759.08±3.8179.886±20.62实验组122.41±1.67#5.24±1.75#50.054±22.81#实验组221.91±1.48#5.06±1.33#51.489±23.47#实验组323.85±2.46#5.51±1.94#50.647±21.55#*表示与对空白照组相比，具有显著性差异，p<0.05；**表示与空白对照组相比，具有极显著性差异，p<0.01；#表示与模型组相比，具有显著性差异，p<0.05；##表示与模型组相比，具有极显著性差异，p<0.01.系统性红斑狼疮是一种多系统损害的慢性自身免疫性疾病，可累及皮肤关节及中枢神经系统等，与多种自身抗体过度产生有关，检测血清抗体和补体水平能够很好的反应机体免疫激活程度。各组小鼠血清中igm、igg、补体3和补体4的变化如表6所示，数据显示，空白组与模型组、对照组1～3、实验组1～3的igm和补体3相比，均不具有统计学意义，p>0.05。模型组的igg和补体4均高于空白组，具有显著性差异(p<0.05)，说明该两检测指标符合实验所需。对照组1～3与模型组相比，igg和补体4均低于模型组，但不具有统计学意义(p>0.05)说明对照组1～3对缓解sle的病情不显著。实验组1～3与模型组相比，igg和补体4均低于模型组，且具有统计学意义(p<0.05)；与空白组相比，没有统计学意义(p>0.05)，说明实验组1～3对能有效缓解sle的病情。表6.各组小鼠血清中igm、igg、补体3和补体4的含量*表示与对空白照组相比，具有显著性差异，p<0.05；**表示与空白对照组相比，具有极显著性差异，p<0.01；#表示与模型组相比，具有显著性差异，p<0.05；##表示与模型组相比，具有极显著性差异，p<0.01。当前第1页12