茚达特罗在治疗结直肠癌中的应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体为肿瘤治疗领域，涉及一系列根据结直肠癌特异性表达的标志物筛选获得的治疗药物。具体的，本发明首次利用基因可变剪切筛选治疗结直肠癌的药物，具体的，所述的药物为茚达特罗(indacaterol)。

背景技术：

结直肠癌是当今世界对人类生存和健康构成极大威胁的恶性肿瘤之一，列西方发达国家癌症死亡谱的第三位。在我国，随着居民生活方式和饮食结构的改变，结直肠癌的发病率上升趋势明显，以每年4％的速度递增，年均增长速度高出世界范围2个百分点。

人类基因组计划发现，人体大概有23,000个基因，远远少于转录出来的蛋白质种类。其中，可变剪切对蛋白质组的多样性发挥着重要的作用。可变剪切通过对前体rna进行剪切重连得到不同的mrna从而被翻译成不同的蛋白质构体。异常的可变剪切与肿瘤的发生、神经以及肌肉相关疾病、心血管疾病均存在着重要的关联。

在肿瘤的发生与发展过程中普遍存在着异常的剪切。大部分肿瘤相关基因由于异常剪切而产生异常的生理学功能。异常剪切的肿瘤标志物在凋亡，增值，免疫逃避，血管生成，侵袭迁移等肿瘤病理学中均发挥着重要的功能。例如抗血管生长因子vegf165b与促血管生成作用的vegf165是由同一转录本经可变剪切产生的。通过可变剪切，vegf165b较vegf165在外显子8上少了5’一小段氨基酸序列。vegf165能够以同样的亲和力结合血管内皮生长因子受体vegfr2，竞争性拮抗vegf165的促血管生成作用。在结直肠癌组织样本中，剪切体(vegf)165b在mrna水平异常下调，而vegf165含量增加。因此可以确定，可变剪切的紊乱在肿瘤生物学过程中发挥着重要的作用。

相较于正常细胞，肿瘤细胞在可变剪切模型上存在着巨大的差异，部分基因的剪切体甚至是存在着有和无的差异。调控肿瘤细胞中的异常剪切事件为精准医疗提供了一个很好的切入点。

茚达特罗(indacaterol)，商品名马来酸茚达特罗吸入粉雾剂，是一种化学品。化学名称(r)-5-[2-(5,6-二乙基二氢茚-2-基氨基)-1-羟乙基]-8-羟基-1h-喹啉-2-酮，分子式为c24h28n2o3，分子量为392.49100。茚达特罗为平喘药(支气管扩张剂)，临床上主要适用于成人慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisorder,copd)患者的维持治疗。

目前关于茚达特罗在治疗copd的作用机理有进一步的研究，即茚达特罗作为β2肾上腺素受体2(adrb2)的激动剂，促进了β-arrestin-2介导的adrb2的细胞内陷。但是，茚达特罗是否能够通过调控可变剪切来治疗癌症，达到降低癌症病灶的效果现有技术中并未提及，且未有动物实验证明其治疗效果。

技术实现要素：

本发明的一个方面是将结直肠癌肿瘤的异常剪切基因作为筛选用于治疗结直肠癌药物的作用靶点，具体的，针对ecm1，usmg5，ppil2，eef1d,cbdw3，zo‐1六个异常剪切基因，从上市的治疗药物中进行筛选能调控其剪切的药物；更进一步的，所述的药物为化学药物。

在本发明的一个具体实施例中，发现了用于成人慢性阻塞性肺疾病(copd)患者的药物茚达特罗可以应用于肿瘤的治疗，在一个具体的实施例中，所述的肿瘤为结直肠癌；在另外一个具体的实施例中，茚达特罗是通过调控细胞中的可变剪接，从而达到抑制细胞增殖、迁移、侵袭的效果。

有益效果：本发明首次通过针对可变剪切事件筛选出可以治疗结直肠癌的有效药物茚达特罗；另外，本申请还首次披露了茚达特罗治疗结直肠肿瘤过程中可能参与的信号通路，具体的，通过抑制细胞的可变剪接，实现对于肿瘤细胞的抑制。

附图说明

图1茚达特罗对sw620具有细胞毒性，且具有剂量依赖性，其ic50值为19.01μm(图1a)，抑制细胞增殖(图1b)，抑制细胞的侵袭和迁移(图1c)。

图2对sw620细胞系施用茚达特罗，分别检测ecm1，usmg5，ppil2，eef1d,cbdw3，zo‐1的表达情况，以dmso为对照，施用茚达特罗使得上述的6个基因mrna剪切变化。

图3为c57小鼠aom/dss结直肠癌模型中，施用茚达特罗可以减少肿瘤灶个数，在0.5mg/kg以及2.5mg/kg浓度下，可以完全消除肿瘤灶。

具体实施方式

实验方法：

1、材料：

结直肠癌细胞系sw620由中国科学院生物化学与细胞生物学研究所提供；rpmi1640、dmem、0.05％trypsin，购于博士德公司；胎牛血清购于四季青公司。氧化偶氮甲烷购于sigma公司(批号098k1488)，葡聚糖硫酸钠mpbiomedicals(批号0216011050)茚达特罗购买自selleck公司(批号s3083)；其他药品为国产分析纯。

2、细胞培养：

结直肠癌细胞系贴壁生长于含10％胎牛血清的rpmi1640培养液中，于37℃，5％co2湿化培养箱中培养，隔天传代一次。

3、细胞迁移、侵袭实验：

2μg/ml的纤维连接蛋白(fn)均匀涂在transwell小室(costarcorp.,cambridge,ma)滤膜背面，晾干。使用胰酶消化处于对数生长期的细胞，3000g转速离心，使用无血清培养基重悬细胞沉淀。计数细胞悬液，取1×10⁵个/孔接种于transwell小室内，transwell小室下层加600μl含10％胎牛血清的培养液，上层加100μl无血清培养基，37℃，5％co2孵箱内培养。培养48h‐72h后取出transwell，吸弃transwell孔内培养基，pbs清洗2次，使用棉签擦净膜上层，加入4％多聚甲醛固定细胞20min，pbs洗3次，0.1％结晶紫染色15min，pbs洗3次，倒置显微镜观察拍照。拍照后将transwell置于33％冰醋酸浸泡，洗脱transwell下层染上的结晶紫，酶标仪采用450nm处进行分光光度检测。

细胞侵袭试验：

matrigel(bdbiosciences,bedford,ma)置于4℃预置过夜。2μg/ml的纤维连接蛋白(fn)均匀涂在transwell小室(costarcorp.,cambridge,ma)滤膜背面，晾干。使用预冷的无血清培养基以1:5的比例稀释4℃过夜的matrigel，取50μl稀释后的matrigel加入transwell小室内，37℃静置30min进行包被。使用胰酶消化处理对数生长期的细胞，3000g转速离心，使用无血清培养基重悬细胞沉淀。计数细胞悬液，取1×10⁵个/孔接种于transwell小室内，transwell小室下层加600μl含10％胎牛血清的培养液，上层加100μl无血清培养基，37℃5％co2孵箱内培养。培养48h‐72h后取出transwell小室，吸弃孔内培养基，pbs洗2次，使用棉签擦净膜上层，加入4％多聚甲醛固定细胞20min，pbs洗3次，0.1％结晶紫染色15min，pbs洗3次，倒置显微镜观察拍照。拍照后将transwell置于33％冰醋酸浸泡，洗脱transwell下层染上的结晶紫，酶标仪采用450nm处进行分光光度检测。

4、cck‐8细胞增殖实验：

细胞增殖实验采用博士德细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(cck‐8)：

(1)取对数生长期的细胞，以2000个/孔，接种于96孔板，每孔加含不同药物浓度的培养液至终体积100μl；置37℃，5％co2培养；并设3个复孔，3个对照孔(不加细胞只加培养液的空白对照)。

(2)细胞接种后3h细胞贴壁，按0h计时，在0h及每隔12h后，分别在实验孔内加入10lcck‐8溶液，37℃孵育4h。

(3)酶联免疫监测仪测定450nm波长的吸光度，以对照调零，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

5、免疫组化：

主要操作步骤如下：

(1)脱蜡水化：将切片依次置于a、二甲苯液3次，每次10分钟；b、95％酒精，5分钟；c、80％酒精，5分钟；d、75％酒精，5分钟；e、50％酒精，5分钟；取出切片，用0.01m,ph7.4的液洗涤3次，每次5分钟。

(2)阻断内源性过氧化物酶：将脱蜡水化后的切片置于3％的过氧化氢甲醇液中15分钟。

(3)pbs洗3次，每次5分钟。

(4)微波抗原修复：将切片置于盛有柠檬酸盐缓冲液(0.01m，ph6.0)的容器中，置入微波炉中，100％功率8分钟，80％功率6分钟，60％功率6分钟；每次微波处理均间隔，补充水分至刻度。

(5)自然冷却至室温，从缓冲液中取出玻片，pbs洗涤3次，每次5分钟。

(6)10％的小牛血清封闭非特异性抗原，室温30分钟。

(7)滴加1:400稀释的一抗工作液，置4℃冰箱中过夜。

(8)切片用pbs液洗涤3次，每次5分钟。

(9)滴加envision加强型二抗工作液，室温下孵育30分钟。

(10)pbs洗涤3次，每次5分钟。

(11)每片滴加新鲜配制的dab显色液，光学显微镜下观察5‐8分钟，以出现棕黄色着色为阳性显色。

(12)切片用自来水冲洗15分钟，以终止显色。

(13)苏木素复染：将上述显色后切片置于gill改良苏木素精染液中持续30秒，取出后自来水流水冲洗蓝化10分钟。

(14)切片脱水：依次经梯度酒精脱水干燥：80％酒精5分钟；90％酒精5分钟；100％酒精2次，每次5分钟。

(15)二甲苯透明。

(16)封片：每片滴加中性树胶，加盖玻片，光学显微镜下观察结果。

6、炎症诱导结直肠癌模型：

取c57小鼠于第一周注射氧化偶氮甲烷10mg/kg，同时开始2.5％葡聚糖硫酸钠自由食用周期，每个周期包含三周21天，与第一周饮用含葡聚糖硫酸钠的水，后两周饮用普通水，以此为一个周期，一共处理三个周期。在模型进行第六周开始分组为生理盐水组及茚达特罗组。

实施例1药物筛选：

针对结直肠癌肿瘤相关可变剪切事件筛选已上市药物，发现茚达特罗(indacaterol)能够调控结直肠癌相关可变剪切事件，从而抑制其在结直肠癌中的作用。

实施例2茚达特罗的细胞学实验：

取培养状态良好的sw620细胞系，对其施用不同浓度的茚达特罗，观察茚达特罗对于细胞系的毒性，以及细胞的增殖、侵袭、迁移状况。首先我们发现，茚达特罗具有细胞毒性，其对sw620细胞的ic50为19.01μm(参见图1a)；且其对于sw620细胞的增殖具有浓度依赖的抑制作用(参见图1b)；同时其对于sw620的迁移、侵袭能力具有显著的抑制作用(参见图1c)。

实施例3茚达特罗与可变剪接的关系：

基于实施例1的同源建模的结果以及本领域技术人员所知晓的可变剪接与肿瘤的关系，我们预测茚达特罗与肿瘤的可变剪接有关，因此我们推测当对细胞施用茚达特罗时，可以改变细胞的可变剪接，为此，我们采用pcr的方法检验了施用了茚达特罗的sw620细胞中6个可变剪切的变化，结果如图2所示。即在细胞中检测常见基因可变剪接剪切事件，其中使用dmso作为阴性对照，结果显示，细胞外基质蛋白1(extracellularmatrixprotein1,ecm1)异常可变剪切在药物处理后得到了矫正；具有同样效应的还包括：骨骼肌增长同源物5(usmg5)；肽基脯氨酰异构酶样蛋白2(peptidylprolylisomeraselike2,ppil2；cbwd3(cobwdomaincontaining3)；紧密连接蛋白zo‐1。该结果提示，茚达特罗通过抑制肿瘤细胞系中的可变剪接，达到了抑制细胞系的增殖、侵袭和迁移的目的。

实施例4炎症诱导结直肠癌实验：

为进一步验证茚达特罗治疗结直肠癌的作用，我们进行了小鼠实验，即在在c57小鼠aom/dss结直肠癌模型中，0.1mg/kg茚达特罗能够减少肿瘤灶个数。肿瘤测量以及免疫组化结果显示，在0.5mg/kg以及2.5mg/kg浓度下，茚达特罗能够完全消除肿瘤灶(参见图3)。

本领域技术人员所公知的是，上述的具体实施例是本领域已知的最佳的实施方式，但是其并不对本申请请求保护的范围有所限制，所属领域技术人员所熟知的本领域的普遍技术均可纳入本申请所要求保护的范围。