一种盐酸沙格雷酯杂质Ⅰ用于诱导骨髓间充质干细胞分化的用途的制作方法

本发明属于药物领域，涉及已知化合物的新用途，具体涉及一种盐酸沙格雷酯杂质ⅰ用于诱导骨髓间充质干细胞分化的用途。
背景技术：
：盐酸沙格雷酯片1993年在日本首次上市，商品名为anplag，是一种5-ht2受体阻滞剂，能够抑制血小板凝聚、抑制血管收缩，具有抗血栓作用以及改善微循环。其适应症为改善慢性动脉闭塞症引起的溃疡、疼痛以及冷感等缺血性诸症状。盐酸沙格雷酯杂质ⅰ是盐酸沙格雷酯的一种光降解杂质，其化学结构式如下：现有技术中，盐酸沙格雷酯杂质ⅰ主要用于盐酸沙格雷酯原料及制剂的质量控制，没有关于其药理活性的报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供盐酸沙格雷酯杂质ⅰ用于诱导骨髓间充质干细胞分化的用途。本发明通过下面的技术方案得以实现：盐酸沙格雷酯杂质ⅰ在制备用于诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的药物中的应用。一种用于诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的药物制剂，含有上述盐酸沙格雷酯杂质ⅰ。优选地，所述药物制剂还含有药学上可以接受的载体或赋形剂制成药学上可接受的剂型。优选地，所述剂型为固体分散体，所述载体或赋形剂为聚维酮k-30。优选地，所述盐酸沙格雷酯杂质ⅰ与聚维酮k-30的质量比为1:(4.5-5.5)。上述药物制剂的制备方法：将盐酸沙格雷酯杂质ⅰ和聚维酮k-30按质量比溶于无水乙醇中配置成所需浓度的溶液，常温搅拌，减压蒸发除去溶剂，干燥，粉碎即得固体分散体。优选地，常温搅拌3-5h后45-55℃条件下减压蒸发除去溶剂，真空干燥后粉碎过5号筛。本发明的优点：本发明提供了盐酸沙格雷酯杂质ⅰ在制备用于诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的药物中的应用，盐酸沙格雷酯杂质ⅰ可以用于诱导骨髓间充质干细胞成骨分化，这突破了现有技术对盐酸沙格雷酯杂质ⅰ的认知水平；为了克服盐酸沙格雷酯杂质ⅰ水溶性较差生物利用度低的问题，本发明提供了盐酸沙格雷酯杂质ⅰ-聚维酮k-30固体分散体，该制剂可以显著提高盐酸沙格雷酯杂质ⅰ的水溶性，进而提高其生物利用度。附图说明图1为盐酸沙格雷酯杂质ⅰ诱导bmscs成骨早期钙盐沉积检测结果；图2为盐酸沙格雷酯杂质ⅰ诱导bmscs成骨早期成骨相关蛋白colⅰ表达检测结果。具体实施方式下面结合具体实施例进一步介绍本发明的技术方案。实施例1盐酸沙格雷酯杂质ⅰ诱导骨髓间充质干细胞(bmscs)成骨分化作用一、实验材料低糖dmem培养基(gibco，usa)，胎牛血清(gibco，usa)，0.25％胰蛋白酶(含0.02％edta，gibco，usa)，茜素红s(sigma，usa)，羊colⅰ多克隆抗体(santacruz，usa)。盐酸沙格雷酯杂质ⅰ自制，hplc归一化纯度大于98％。二、实验方法1、bmscs分离和培养取3周龄并且身体健康的sd大鼠2只，体重约100g，不限雌雄，给予过量10％水合氯醛进行腹腔注射致死，75％酒精浸泡消毒10min，在无菌条件下将大鼠双侧的胫骨及股骨取出，并将附着组织清除干净，清除关节处软骨组织及两侧骨端时，注意保持关节的完整。注射器抽取5mldmem完全培养基(含10％胎牛血清，100u/ml青霉素，100u/ml链霉素)，自一端开始冲洗，骨髓腔反复冲洗干净后，将其制成分散充分的骨髓细胞悬液，并接种在25cm2塑料瓶中于37℃、5％co2进行培养，48h后首次全培养液换液，换液前用pbs轻轻冲洗未贴壁细胞。然后每隔2-3d换液一次，待细胞达到90％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化传代。2、盐酸沙格雷酯杂质ⅰ干预液的配制精密称取盐酸沙格雷酯杂质ⅰ适量，用dmso溶解配制成母液，用0.22μm滤膜过滤除菌后于4℃保存备用。3、bmscs的成骨诱导培养取体外扩增的第三代细胞，以1×105个/孔的种植密度接种到6孔培养板中进行传代培养，24h后依据分组情况选用不同培养基继续培养72h，分组情况为：对照组：dmem完全培养基；低浓度干预组：dmem完全培养基+5μm盐酸沙格雷酯杂质ⅰ；中浓度干预组：dmem完全培养基+10μm盐酸沙格雷酯杂质ⅰ；高浓度干预组：dmem完全培养基+20μm盐酸沙格雷酯杂质ⅰ。4、钙盐沉积实验对上述使用不同培养基继续培养72h进行茜素红s染色：弃去培养基上清并以pbs清洗，戊二醛固定后经ddh2o清洗，加入0.4％茜素红s，光镜下观察监测，待出现红色物质堆积时(约5min)，弃去染液，ddh2o终止反应和洗涤，光镜下观察。5、westernblot检测成骨相关基因的蛋白colⅰ表达分别收集干预组与对照组继续培养72h的细胞，ripa细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白。bradford法测定蛋白含量，sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至pvdf膜。常规封闭、洗膜后与特异性抗体4℃孵育过夜，colⅰ抗体工作浓度为1:500，洗膜后加入1:5000酶标兔抗羊或兔抗鼠多克隆抗体(igg/hrp)37℃孵育2h，ecl显色。用bio-rad图像分析系统照相，用quantityone软件分析，以相应蛋白条带灰度值/β-actin蛋白带灰度值表示相对蛋白含量。6、统计学分析数据用珋x±s表示，采用spss10.0统计软件，多组间比较采用重复测量设计资料方差分析，两组间比较采用独立样本t检验，各实验均重复3次。三、实验结果1、盐酸沙格雷酯杂质ⅰ诱导bmscs成骨早期钙盐沉积检测结果与对照组相比，各干预组于显微镜下均出现红色矿化结节，且红色矿化结节面积与干预组中盐酸沙格雷酯杂质ⅰ的干预浓度成剂量依赖关系，对照组无明显红色矿化结节出现。显微镜观察结果如图1所示。2、盐酸沙格雷酯杂质ⅰ诱导bmscs成骨早期成骨相关蛋白colⅰ表达检测结果与对照组相比，各干预组成骨相关蛋白colⅰ的表达水平均显著上调，且上调水平与干预组中盐酸沙格雷酯杂质ⅰ的干预浓度成剂量依赖关系。westernblot检测结果如图2所示。实施例2固体分散体的制备将盐酸沙格雷酯杂质ⅰ和聚维酮k-30按如下质量比溶于无水乙醇中配置成盐酸沙格雷酯杂质ⅰ质量浓度为10mg/ml的溶液，常温磁力搅拌4h(100r/min)，于50℃减压旋转蒸发除去溶剂，真空干燥24h，粉碎过5号筛，置于干燥器内保存备用。固体分散体1：盐酸沙格雷酯杂质ⅰ和聚维酮k-30质量比为1:5；固体分散体2：盐酸沙格雷酯杂质ⅰ和聚维酮k-30质量比为1:4.5；固体分散体3：盐酸沙格雷酯杂质ⅰ和聚维酮k-30质量比为1:5.5；固体分散体4：盐酸沙格雷酯杂质ⅰ和聚维酮k-30质量比为1:4；固体分散体5：盐酸沙格雷酯杂质ⅰ和聚维酮k-30质量比为1:6。分别将固体分散体1-5置于(75±5)％高湿条件下(常温不避光)放置24h，测定吸湿率，吸湿率(％)＝(吸湿后重量-吸湿前重量)/吸湿前重量×100％。结果如下表：固体分散体1固体分散体2固体分散体3固体分散体4固体分散体5吸湿率(％)0.120.160.174.885.13在上述固体分散体中，聚维酮k-30为载体，可以显著提高盐酸沙格雷酯杂质ⅰ的水溶性，进而提高其生物利用度。同时，申请人还发现，通过控制盐酸沙格雷酯杂质ⅰ与聚维酮k-30的质量比在1:(4.5-5.5)范围内，制得的固体分散体不易吸湿，采用常规包装即可，不用特别地对该固体分散体进行防吸湿包装。本发明提供了盐酸沙格雷酯杂质ⅰ在制备用于诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的药物中的应用，盐酸沙格雷酯杂质ⅰ可以用于诱导骨髓间充质干细胞成骨分化，这突破了现有技术对盐酸沙格雷酯杂质ⅰ的认知水平；为了克服盐酸沙格雷酯杂质ⅰ水溶性较差生物利用度低的问题，本发明提供了盐酸沙格雷酯杂质ⅰ-聚维酮k-30固体分散体，该制剂可以显著提高盐酸沙格雷酯杂质ⅰ的水溶性，进而提高其生物利用度。当前第1页12