针对microRNA-155的治疗性药物及其应用的制作方法

本发明涉及microrna-155，尤其是涉及针对microrna-155的治疗性药物及其应用。

背景技术：

癫痫是目前最常见的神经病症之一，全世界大约有6500万人患病^[1,2]。有研究表明，胶质细胞通过增加神经细胞的兴奋性和促进炎症来促进癫痫发生，炎症及神经胶质过度活化导致神经元的兴奋性过高，终致癫痫的反复复发性发生等^[3]。最近的研究表明，微小rna(mirna)在神经系统疾病如癫痫的发病机理中起关键作用^[4～7]。mirna是通过结合靶mrna的3'非翻译区(3'utr)来降低靶mrna的稳定性和减少翻译，从而调节基因表达的微小(～22nt)非编码rna^[8,9]。约60％的人类蛋白质被mirna直接调控^[10]。在不同的病理条件下，它们在脑中差异表达，因此可能成为包括癫痫在内的神经系统疾病的治疗靶点和诊断、预后的生物学标志物^[11～14]。

microrna-155(mir-155)是一个典型的多功能mirna分子。最近的实验证据表明，mir-155在炎症，免疫反应和肿瘤发生中均发挥重要作用^[15～18]。在神经系统中，mir-155被认为是免疫反应中主要的炎症调节剂^[19,20]，并且在巨噬细胞炎症反应和多发性硬化病变期间高度上调^[21,22]。此外，有研究显示，小胶质细胞可能是包括癫痫在内的神经障碍的核心^[3,23,24]。前述背景表明，mir-155可能通过调节小胶质细胞活性进而参与癫痫的发生。

参考文献：

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技术实现要素：

本发明的目的在于提供针对microrna-155的治疗性药物及其应用。

所述针对microrna-155的治疗性药物为预防或治疗癫痫的药物或药物组合物。所述药物由有效量包含序列表所示序列的核酸和药学上可接受的载体或辅料组成。

所述药物或药物组合物可按照药物制备的常用方法制成注射制剂、口服制剂、喷雾制剂、软膏制剂或贴剂等。

所述microrna-155的核苷酸序列设计反义核酸序列及其修饰物，所述修饰包括任意核苷酸的核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或几种的组合或任意核苷酸的增减、替换，只要修饰后的核苷酸序列仍具有与microrna-155反向互补的活性。

本发明公开了microrna-155拮抗剂在预防、治疗癫痫和以痫性发作为特征的神经系统疾病中的用途。通过大量的实验证实，在诱发癫痫发作的小鼠模型中，小鼠大脑皮层和海马组织中microrna-155水平显著升高。给予小鼠侧脑室注射microrna-155的拮抗剂(antagomir)能显著抑制小鼠癫痫发作症状，意味着microrna-155在癫痫的发病机制中起着关键性作用。本发明旨在公开基于microrna-155的拮抗剂或抑制剂的生物制剂的用途，用以治疗和预防颞叶癫痫的发生。

附图说明

图1为在ka诱发的癫痫发作小鼠模型脑组织中mir-155水平上调。

图2为在tle患者的脑标本中mir-155水平上调。

图3为mir-155拮抗剂可显著改善癫痫发作。

图4为mir-155拮抗剂可显著改善癫痫小鼠神经元死亡。

图5为mir-155拮抗剂可显著改善癫痫小鼠炎症因子tnf-α表达。

图6为mir-155拮抗剂可显著改善癫痫小鼠炎症因子il-1β表达。

图7为mir-155拮抗剂可显著改善癫痫小鼠炎症因子il-6表达。

图8为mir-155主要定位于脑内胶质细胞。

图9为ka处理的小胶质细胞mir-155表达上调。

图10为ka处理的小胶质细胞特异性蛋白csf1r表达下调。

图11为mir-155激动剂处理发现mir-155特异性靶向csf1r。

图12为mir-155拮抗剂可显著上调csf1r表达。

图13为mir-155拮抗剂可显著逆转小胶质细胞活化状态。

图14为mir-155拮抗剂处理的小胶质细胞条件培养液可显著降低ka诱发的神经元动作电位的发放。

图15为mir-155拮抗剂处理的小胶质细胞条件培养液可显著降低ka诱发的神经元兴奋性突触后电位(epsc)的频率。

图16为mir-155拮抗剂处理的小胶质细胞条件培养液可显著降低ka诱发的神经元抑制性突触后电位(ipsc)的频率。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步描述本发明，所有实施例仅用于例证本发明，决不限制本发明的保护范围。

用成年雄性c57bl/6小鼠(18～22g)，腹腔注射经典致痫剂海人酸(kainicacid，ka)15mg/kg诱发小鼠癫痫发作，建立小鼠癫痫动物模型。注射海人酸后小鼠表现出双眼凝视、须动增加、呼吸急促、反复洗脸动作，伴有头面部抽搐，逐渐发展为伴有站立并摔倒的全身强直阵挛性发作的癫痫症状，发作等级达到racine分级ⅳ～ⅴ级。24h后，断头取脑，取出双侧海马，提取rna，荧光定量pcr实验显示，ka组小鼠较正常对照组小鼠，海马内microrna-155水平显著升高(参见图1)。收集临床难治性癫痫患者的脑组织标本，检测显示癫痫患者脑组织中microrna-155水平较非癫痫患者也显著升高(参见图2)。这意味着microrna-155的表达变化与癫痫的发生发展密切相关。

进一步给予成年雄性c57bl/6小鼠侧脑室注射microrna-155的特异性拮抗剂(antagomir-155)，小鼠的癫痫发作症状显著改善，发作等级达到racine分级ⅱ～ⅲ级，脑电图显示为异常棘波频率显著减少(参见图3)。fjb免疫荧光实验显示，注射microrna-155拮抗剂后，小鼠海马神经变性显著改善(参见图4)，tnf-α(参见图5)，il-1β(参见图6)和il-6(参见图7)等神经炎症显著改善，意味着拮抗microrna-155可改善小鼠癫痫发作，减轻神经变性症状，改善神经炎症。

因大脑中的主要细胞为神经元，星形胶质细胞和小胶质细胞，通过分析大脑组织中microrna-155在不同细胞中的表达情况，发现其主要表达于胶质细胞(参见图8)。我们接着在原代培养小胶质细胞中用ka处理，荧光定量pcr实验显示，其microrna-155水平也显著升高(参见图9)，进一步通过靶基因预测和检测发现小胶质细胞中特异性受体蛋白csf1r表达显著下调(参见图10)。进一步通过荧光素酶报告基因检测发现csf1r为microrna-155的靶基因(参见图11)，且其蛋白水平在microrna-155拮抗剂处理后显著上调(参见图12)。此外，microrna-155显著改善ka处理的小胶质细胞活化状态(参见图13)。我们进一步收集microrna-155处理的小胶质细胞条件培养液，将其作用于原代培养神经元，发现microrna-155处理的小胶质细胞条件培养液能显著降低神经元动作电位的形成(参见图14)，降低神经元兴奋性突触后电位(参见图15)和抑制性突触后电位(参见图16)的频率。经元的兴奋性。上述研究提示，microrna-155拮抗剂显著改善神经元兴奋性，为癫痫及其相关疾病发病的重要保护性小分子核酸。最后，又收集40例临床癫痫患者及40例健康对照的血液，检测其中microrna-155的含量，发现其在癫痫患者中的含量也显著上调。提示，其有望成为临床癫痫患者的生物标志物。

通过大量的实验证实，小鼠癫痫模型及癫痫患者中microrna-155水平显著升高。给予小鼠侧脑室注射microrna-155的拮抗剂(antagomir)能改善小鼠痫性发作，提示microrna-155拮抗剂为拮抗癫痫及其相关疾病发病的重要保护性小分子核酸。

本发明是在大量动物、细胞和临床样本实验的基础上，旨在开发针对microrna-155的用以治疗和预防癫痫的生物制剂。具体如下：

microrna-155拮抗剂或抑制剂生物制剂：制备的药物可以只含针对microrna-155的反义核苷酸序列或其拮抗剂/抑制剂及其修饰物，也可制成一种药物组合物，其特征在于包含有效剂量的microrna-155拮抗剂或抑制剂的核苷酸序列及药学上可接受的载体；其中，所述的载体可为纳米颗粒，脂质体，胆固醇，壳聚糖，病毒等。合成针对microrna-155的反义核苷酸序列或其拮抗剂/抑制剂，并与上述载体连接形成药物，可制成注射制剂或口服制剂，通过静脉或肌肉注射或口服或鼻吸的方式，用于治疗癫痫。

实施例1.癫痫模型小鼠海马中microrna-155表达水平的检测

1)本实验采用6～8周龄雄性c57bl/6小鼠，具体分为2组：癫痫模型小鼠组及对照组。癫痫模型小鼠组小鼠给予腹腔注射海人酸(ka)15mg/kg，诱发小鼠癫痫发作，制造小鼠癫痫模型。

2)24hr后，常规提取小鼠双侧海马rna：

每100mg组织中加入1mltrizol试剂，电动匀浆器匀浆。室温下放置5min后，加入0.2ml氯仿，混匀后室温下放置5min，4℃12,000r离心15min。将上层水相液转移至新ep管中，加入等体积(0.3ml)异丙醇，混匀后室温下放置10min，4℃12,000r离心10min。弃上清，加入1ml75％乙醇，混匀后4℃12,000r离心10min。弃上清，空气干燥沉淀10min，加入10μldepc处理水，于55～60℃水浴10min溶解rna。获得的rna溶液保存于-80℃。

3)紫外吸收法测定rna浓度及纯度：

按照酶标仪使用说明进行操作，测量前先用溶解rna用的depc水调零。根据260nm处读值获得rna浓度，以a260/a280的比值判定rna纯度。

4)采用tiangen(beijing,china)的mirna加尾法逆转录试剂盒进行逆转录：

逆转录反应体系(10μl)：

2×mirnabuffermix5μl

mirnartenzymemix1μl

totalrna(10pg/μl～1μg/μl)4μl

以上体系混匀后，瞬时离心，42℃孵育60min后，95℃孵育3min(酶失活反应)。停止后4℃备用，产物保存于-20℃。

mirnasreal-timepcr：(pcr试剂来源于roche公司，mir-155,u6等引物由广州锐博生物有限公司合成)

反应体系(20μl)：

反应程序：

95℃30sec--(95℃3sec--65℃30sec)×40cycles—meltingcurve

结果显示：癫痫模型小鼠皮层和海马中microrna-155含量较对照正常组小鼠有明显升高，说明在癫痫小鼠microrna-155可能有促痫作用(图1)。

实施例2.癫痫患者脑组织microrna-155的表达情况

1)收集12例癫痫患者及11例正常对照者癫痫患者脑组织样本(取自2013年至2016年厦门大学附属成功医院神经外科住院患者，每个病例均由两个或以上临床医师确诊分类)。按照实施例2所述方法提取rna，并检测microrna-155的表达。

2)结果显示：癫痫患者脑组织中microrna-155表达水平明显升高(图2)。提示microrna-155的表达变化与癫痫的发生发展密切相关。

实施例3.小鼠脑电图记录显示microrna-155的特异性拮抗剂(antagomir-155)能改善小鼠癫痫发作

采用nicolet尼高力数字化脑电图仪进行描记，以头皮电极描记小鼠脑电图，采用6导联，在小鼠左右额、左右颞和左右顶叶相对的头皮上各放置一根针电极，参考电极置左耳并接地。灵敏度：20μv/mm，纸速：20mm/sec，高频滤波：70hz，低频滤波：0.53hz。

1)本实验采用6～8周龄雄性c57bl/6小鼠，具体分为3组：ka组，antagomir-219处理干预组及阴性对照组。ka组小鼠给予腹腔注射ka15mg/kg和侧脑室微量注射antagomir-155的阴性对照剂antagomir-nc3μl。antagomir-155处理干预组小鼠给予腹腔注射ka15mg/kg,待发作达到iv级以上时，将小鼠麻醉，放置固定在小鼠脑立体定位仪上，给予侧脑室微量注射microrna-155的拮抗剂(antagomir-155)3μl(200nm)。对照组小鼠给予同侧侧脑室微量注射antagomir-155的阴性对照剂antagomir-nc3μl。

2)观察小鼠的行为表现：ka处理小鼠表现为明显的癫痫发作症状，racine分级达到ⅳ级。脑电图显示，干预组小鼠呈现出棘波频率显著减少(图3)。对照组小鼠表现为正常行为，脑电图亦无异常痫性波形(图3)。

实施例4.fjb染色显示microrna-155的特异性拮抗剂(antagomir-155)能改善小鼠神经元死亡

上述小鼠模型制作冰冻切片，fjb染色显示，antagomir-155处理干预组小鼠海马内神经死亡情况较ka组明显改善(图4)。

实施例5-7.qrt-pcr显示microrna-155的特异性拮抗剂(antagomir-155)能改善小鼠脑组织tnf-α，il-1β，il-6等炎症反应

上述小鼠模型2hr后，常规提取两组小鼠脑组织rna，如实施例3的步骤分别检测三组小鼠脑组织内的tnf-α，il-1β，il-6等炎症因子表达水平。结果显示antagomir-155处理干预组小鼠脑组织内炎症因子表达水平较ka组明显降低(图5～7)。这些结果表明拮抗小鼠海马内的antagomir-155表达水平可通过抑制炎症反应而改善小鼠癫痫发作，说明microrna-155在癫痫的发病机制中起着关键作用。

实施例8.qrt-pcr显示mir-155主要表达于小胶质细胞和星形胶质细胞内

我们首先分离培养脑组织中的主要细胞，神经元，星形胶质细胞和小胶质细胞，通过检测不同细胞内mir-155的表达，发现其主要表达于小胶质细胞和星形胶质细胞内(图8)。

实施例9.qrt-pcr显示ka处理后显著上调原代培养小胶质细胞中mir-155表达

通过检测50μmka处理小胶质细胞2小时，12小时，发现其mir-155显著上调(图9)。

实施例10.qrt-pcr显示ka处理原代小胶质细胞特异性蛋白csf1r表达显著下调

上述细胞模型2hr，12hr后，常规提取各组rna，如实施例1的步骤分别检测各组细胞内的mir-155靶向基因的表达水平，发现ka处理后小胶质细胞特异性蛋白csf1r表达显著下调(图10)。

实施例11.luciferaseassay显示mir-155靶向调控csf1r

通过构建csf1r的3’utr野生型及其突变体，转染小胶质细胞细胞系bv2细胞，以mir-155激动剂处理，发现mir-155特异性靶向调控csf1r(图11)。

实施例12.westernblot显示mir-155拮抗剂显著逆转ka处理的原代培养小胶质细胞中csf1r的下调

1)本实验采用新生1-3天小鼠，进行小胶质细胞原代培养，分如下组：正常对照组(加入生理盐水)；癫痫细胞模型组(加入ka，终浓度为50μm)；癫痫细胞模型antagomir-155处理干预组(加入antagomir-155使终浓度为100nm半小时后，加入ka使终浓度为50μm)；

2)12hr后，常规提取各组细胞的rna，如实施例1的步骤分别检测各组细胞的csf1r表达水平。

通过检测mir-155拮抗剂预处理后的小胶质细胞，发现mir-155拮抗剂显著逆转ka处理的原代培养小胶质细胞中csf1r的下调(图12)。

实施例13.癫痫细胞模型中加入microrna-155的拮抗剂后显著抑制ka引起的小胶质细胞的活化

如实施例12的步骤处理细胞。2hr后，免疫荧光染色观察小胶质细胞活化状态，发现microrna-155的拮抗剂后显著抑制ka引起的小胶质细胞的活化(图13)。

实施例14-16.microrna-155拮抗剂处理的小胶质细胞条件培养液显著抑制神经元的兴奋性

1.本实验采用新生1-3天小鼠，进行小胶质细胞原代培养，分如下组：正常对照组(加入生理盐水)；癫痫细胞模型组(加入ka，终浓度为50μm)；癫痫细胞模型antagomir-155处理干预组(加入antagomir-155使终浓度为100nm半小时后，加入ka使终浓度为50μm)；

2.24hr后，收集各组细胞的条件培养液，处理原代培养神经元，8hr后检测神经元动作电位及ipsc/epsc。结果如图14～16所示，antagomir-155拮抗剂处理的小胶质细胞条件培养液显著抑制神经元动作电位的发放(图14)，兴奋性突触后电位(图15)和抑制性突触后电位(图16)的频率，提示antagomir-155拮抗剂可通过小胶质细胞影响神经元的兴奋性。

序列表

<110>厦门大学

<120>针对microrna-155的治疗性药物及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>65

<212>rna

<213>人(homosapiens)

<400>1

cuguuaaugcuaaucgugauagggguuuuugccuccaacugacuccuacauauuagcauu60

aacag65