以TIPE2基因为靶点在制备治疗肿瘤的药物中的应用的制作方法

本申请涉及肿瘤靶向治疗领域，特别是涉及一种以tipe2基因为靶点在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

背景技术：

tipe2，即肿瘤坏死因子a诱导的蛋白8-2，是tnfaip8家族的一员。据报道，tipe2是一个免疫负调控因子，选择性地高表达于胸腺、脾脏、淋巴结等免疫器官及炎症组织。tipe2负调nf-κb和mapk信号通路，抑制tcr介导的t细胞激活和tlr介导巨噬细胞先天免疫，起到抑制炎症发生、维持免疫稳态具有关键性作用。此外，tipe2还表达于肿瘤细胞或肿瘤组织。临床标本检测发现肝癌、胃癌和非小细胞肺癌中tipe2表达水平较低，但在肾细胞癌、结直肠癌症和甲状腺癌中tipe2呈现高表达。研究发现，tipe2能对肿瘤细胞内ras、rac信号通路起到负性调控作用。tipe2可以直接与ralgds、racgtpases结合，抑制ras、rac介导的信号转导及后续一系列生物学行为。

目前临床上肿瘤免疫疗法可供使用且有效的治疗靶点非常有效，主要有免疫检验点分子pd-1、pd-l1、ctla-4或肿瘤抗原标志物her2、vegf、ny-eso1等有限的分子。由于有效靶点的限制，使得临床上肿瘤免疫治疗的有效范围仅为20％的肿瘤，极大限制了肿瘤免疫治疗的应用范围，因此急需寻找新的肿瘤抗原标志物，为临床上治疗原发性或转移性肿瘤的免疫疗法提供新的作用靶点和治疗策略。

技术实现要素：

本申请的目的是提供一种新的原发性肿瘤或转移性肿瘤的治疗靶点，即tipe2基因，以tipe2基因为靶点在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种以tipe2基因为靶点在制备治疗肿瘤的药物中的应用，其中，以tipe2基因为靶点包括采用基因敲除、基因敲减或者化学药物降低tipe2基因的表达；肿瘤为原发性肿瘤或转移性肿瘤。

需要说明的是，本申请经过研究发现，tipe2基因缺失，不仅能够治疗原发性肿瘤，而且能够抑制肿瘤细胞转移，能够用于治疗转移性肿瘤。因此，可以tipe2基因为靶点制备治疗原发性肿瘤或转移性肿瘤的药物；只要能够降低tipe2基因的表达，就可以起到治疗原发性肿瘤或转移性肿瘤的效果。

本申请的再一面公开了以tipe2基因为靶点的肿瘤浸润白细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用，其中，tipe2基因为靶点包括采用基因敲除、基因敲减或者化学药物降低tipe2基因的表达；肿瘤为原发性肿瘤或转移性肿瘤。

本申请的应用特别指基于肿瘤浸润白细胞进行免疫疗法治疗原发性肿瘤或转移性肿瘤。

需要说明的是，本申请经过研究发现，tipe2基因缺失的肿瘤浸润白细胞，能够增强抗肿瘤免疫反应，因此，同样可以tipe2基因为靶点的肿瘤浸润白细胞制备治疗原发性肿瘤或转移性肿瘤的药物。

本申请的再一方面公开了一种tipe2基因敲除的肿瘤浸润白细胞。

本申请的另一方面公开了本申请的tipe2基因敲除的肿瘤浸润白细胞的制备方法，包括以下步骤，

采用皮下注射方式给tipe2基因缺失的小鼠进行肿瘤细胞种植；

待种植的肿瘤细胞生长为肿瘤组织块后，从小鼠身上取下肿瘤组织块，采用酶混合液对肿瘤组织块进行消化，酶混合液包括胶原酶i、胶原酶iv、透明质酸酶和脱氧核糖核酸酶；其中，肿瘤细胞生长为肿瘤组织块一般在2-3周内，即种植肿瘤细胞后2-3周内即可采取肿瘤组织块，本申请的一种实现方式中是种植后第16天采集的肿瘤组织块；

消化完成后采用rpmi1640完全培养基终止消化，将肿瘤组织块置于细胞筛网上研磨，收集通过细胞筛网的组织研磨液；其中，采用rpmi1640完全培养基终止消化就是直接用rpmi1640完全培养基加满离心管即可终止消化；本申请的一种实现方式中，细胞筛网为70μm筛网，经过研磨后肿瘤细胞全部通过细胞筛网悬浮于组织研磨液中；

对组织研磨液进行4℃低速离心，获取细胞上清液，弃沉淀杂质；对细胞上清液进行4℃高速离心，收集沉淀细胞；其中，4℃低速离心是指在4℃下进行较低速度的离心，该离心速度下，细胞仍然悬浮在溶液中，而较大的杂质则离心沉淀被去除，本申请的一种实现方式中低速离心的速度为60g；4℃高速离心是指在4℃下进行较高速度的离心，该离心速度下，细胞被离心沉淀，用于去除上清液，本申请的一种实现方式中高速离心的速度为1260g；

将收集的沉淀细胞用rpmi1640完全培养基重悬，采用小鼠肿瘤组织淋巴、单核巨噬、粒细胞分离液试剂盒对收集的沉淀细胞进行分离，具体的，将细胞的rpmi1640完全培养基重悬液加入按照试剂盒配制的分离液液面上，1260g、25℃离心后，用吸管吸取并收集离心管中出现的两层环状的乳白色细胞层；其中，小鼠肿瘤组织淋巴、单核巨噬、粒细胞分离液试剂盒，本申请的一种实现方式中，具体采用的是购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司的lds1090z试剂盒，分离液液面或者梯度界面按照其说明书披露的常规方法制备，在此不做具体限定，1260g、25℃离心主要是为了达到更好的分离效果，该参数条件可以在试验允许的误差范围内调整；

采用pbs溶液洗涤所收集的乳白色细胞层，1260g，4℃离心，弃上清，再采用pbs重悬，获得pbs细胞悬液，该pbs细胞悬液即本申请的tipe2基因敲除的肿瘤浸润白细胞。本申请中，1260g，4℃离心，其中1260g的离心速度是为了使细胞沉淀，而又不至于破裂；4℃的离心温度主要是使细胞处在一个较低温度下，减缓其生长代谢，使其能够更稳定的存在。

本申请的一种实现方式中，给tipe2基因缺失的小鼠进行肿瘤细胞种植，其中所采用的肿瘤细胞为llc小鼠肺癌细胞或b16f10小鼠黑色素肿瘤细胞；也就是说，种植llc小鼠肺癌最终获得tipe2基因敲除的肺癌肿瘤浸润白细胞，该肺癌肿瘤浸润白细胞对原发性或转移性的肺癌有很好的治疗效果；种植b16f10小鼠黑色素肿瘤细胞最终获得tipe2基因敲除的黑色素肿瘤浸润白细胞，该黑色素肿瘤浸润白细胞对原发性或转移性的黑色素肿瘤有很好的治疗效果。

优选的，在采用酶混合液对肿瘤组织块进行消化之前，还包括将肿瘤组织块剪成小块，然后再进行消化。可以理解，将肿瘤组织块剪成小块可以更好的的进行消化，提高消化的质量和效率。

优选的，酶混合液中含有50mg/ml的胶原酶i、50mg/ml的胶原酶iv、5mg/ml的透明质酸酶和1u/ml的脱氧核糖核酸酶。

优选的，肿瘤细胞种植中，种植肿瘤细胞的量为每只小鼠2×10⁶个肿瘤细胞。

优选的，从小鼠身上取下肿瘤组织块，具体包括，将脱颈处死的小鼠浸泡于75％酒精中，随后将小鼠放置于无菌超净台上，用手术剪刀和镊子取下肿瘤组织块。

本申请的再一面公开了本申请的tipe2基因敲除的肿瘤浸润白细胞在制备治疗原发性肿瘤或转移性肿瘤的药物中的应用。

可以理解，本申请的tipe2基因敲除的肿瘤浸润白细胞具有很好的肿瘤抑制效果，能够抑制肿瘤生长和肿瘤细胞转移，因此，完全可以制备成相应的药物，用于治疗原发性肿瘤或转移性肿瘤。其中，药物中还可以包括其它药学上可以接受的辅助成份或活性成份，在此不做具体限定。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

本申请为原发性肿瘤和转移性肿瘤的治疗提供了一种新的靶点，即tipe2基因，通过抑制tipe2基因表达，不仅能够抑制原发性肿瘤的生长，而且，能够抑制肿瘤细胞转移。本申请的tipe2基因敲除肿瘤浸润白细胞，可以用于开发新的预防或治疗原发性肿瘤或转移性肿瘤的靶向药物。

附图说明

图1是本申请实施例中llc小鼠肺癌细胞分别种植于野生型小鼠和tipe2基因缺失型小鼠中的肿瘤体积增长结果图；

图2是本申请实施例中b16f10小鼠黑色素肿瘤细胞分别种植于野生型小鼠和tipe2基因缺失型小鼠中的肿瘤体积增长结果图；

图3是本申请实施例中b16f10小鼠黑色素肿瘤细胞分别种植于野生型小鼠和tipe2基因缺失型小鼠后，检测的b16f10小鼠黑色素肿瘤细胞向肺部转移的结果图；

图4是本申请实施例中tipe2基因缺失对cd45⁺cd3⁺cd8⁺细胞比例的影响测试结果图；

图5是本申请实施例中tipe2基因缺失对cd45⁺cd3⁺cd8⁺细胞产生ifn-γ的影响测试结果图；

图6是本申请实施例中tipe2基因缺失型的cd45⁺cd3⁺cd8⁺细胞具有增强的抑制b16f10小鼠黑色素肿瘤生长的能力测试结果图。

具体实施方式

本申请在对mdsc进行研究的过程中发现一个新的治疗靶点，即tipe2基因，通过研究证实，对tipe2基因进行敲除降低tipe2基因的表达，可以有效的抑制肿瘤增长，抑制肿瘤细胞转移，并增强抗肿瘤免疫反应，起到预防、治疗肿瘤的效果。可以理解，只要能够降低tipe2基因的表达就可以抑制肿瘤增长，达到预防或治疗肿瘤的效果；因此，除了基因敲除以外，基因敲减或者化学药物降低tipe2基因的表达，也可以起到相同的预防或治疗肿瘤的效果。

此外，经过本申请研究证实，tipe2基因敲除的肿瘤浸润白细胞进行进一步的分选后，其分选产物可以抑制肿瘤增长，并增强抗肿瘤免疫反应，起到预防或治疗肿瘤的效果；因此，tipe2基因敲除的肿瘤浸润白细胞可以用于开发新的预防或治疗肿瘤靶向药物。

下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

本例采用皮下注射方式分别于野生型小鼠(缩写wt)和tipe2基因缺失型小鼠(缩写tipe2^-/-)分别种植llc小鼠肺癌细胞和b16f10小鼠黑色素肿瘤细胞，其中，llc和b16f10细胞均携带有正常功能的tipe2基因，观察tipe2基因缺失抑制原发性肿瘤生长效果，其中，b16f10细胞携带有正常功能的tipe2基因。

另外，采用尾静脉注射方式分别向野生型小鼠(wt)和tipe2基因缺失型小鼠(tipe2^-/-)注入b16f10小鼠黑色素肿瘤细胞，观察tipe2基因缺失抑制肿瘤转移效果，其中，b16f10细胞携带有正常功能的tipe2基因。

详细如下：

试验1tipe2基因敲除对原发性肿瘤的影响

分别将llc小鼠肺癌细胞和b16f10小鼠黑色素肿瘤细胞培养于dmem完全培养基中，待获得足够数目的细胞，即2×10⁶/只小鼠剂量，采用皮下注射方式分别于野生型小鼠(wt)和tipe2基因缺失型小鼠(tipe2^-/-)种植2×10⁶的剂量。即llc小鼠肺癌细胞分别种植野生型小鼠(wt)和tipe2基因缺失型小鼠(tipe2^-/-)，b16f10小鼠黑色素肿瘤细胞分别种植野生型小鼠(wt)和tipe2基因缺失型小鼠(tipe2^-/-)。然后，采用直尺测量记录的手段，连续记录种植llc小鼠肺癌细胞的肿瘤的长直径和短直径21天，连续记录种植b16f10小鼠黑色素肿瘤细胞的肿瘤的长直径和短直径16天。按照肿瘤体积公式计算肿瘤体积，并统计肿瘤体积变化，以graphpad6.0软件进行数据分析。

其中，肿瘤体积(mm³)＝短直径²×长直径×1/2。

本例的llc小鼠肺癌细胞和b16f10小鼠黑色素肿瘤细胞均购自于atcc。dmem完全培养基包括高糖dmem+10％胎牛血清+1％青霉素和链霉素，均购自hyclone公司。llc小鼠肺癌细胞和b16f10小鼠黑色素肿瘤细胞均携带有正常功能的tipe2基因。

肿瘤体积计算和统计结果如图1和图2所示，图1为统计的llc小鼠肺癌细胞种植野生型小鼠(wt)和tipe2基因缺失型小鼠(tipe2^-/-)的肿瘤体积增长曲线，图2为统计的b16f10小鼠黑色素肿瘤细胞种植野生型小鼠(wt)和tipe2基因缺失型小鼠(tipe2^-/-)的肿瘤体积增长曲线，图1和图2中，横坐标是种植后培养天数，纵坐标是肿瘤体积；“▲”曲线是tipe2^-/-小鼠的肿瘤体积增长曲线，“■”曲线是wt小鼠的肿瘤体积增长曲线。图1和图2的结果显示，tipe2基因缺失在llc和b16f10两个肿瘤模型中均有抑制原发性肿瘤生长的作用。

试验2tipe2基因敲除对肿瘤细胞转移的抑制作用

本例采用尾静脉注射方式分别向野生型小鼠(wt)和tipe2基因缺失型小鼠(tipe2^-/-)注入2×10⁵的b16f10小鼠黑色素肿瘤细胞，其中，b16f10细胞携带有正常功能的tipe2基因，记录注入b16f10细胞14天时的肺部转移的b16f10肿瘤细胞数目，以graphpad6.0软件进行数据分析。

结果如图3所示，图3中，横坐标分别是wt小鼠和tipe2^-/-小鼠，纵坐标是b16f10肿瘤细胞数目；图3的结果显示，tipe2基因缺失对b16f10肿瘤转移有抑制作用。

试验3tipe2基因敲除增强抗肿瘤免疫反应

1.肿瘤细胞种植

采用皮下注射方式分别于野生型小鼠(wt)和tipe2基因缺失型小鼠(tipe2^-/-)种植2×10⁶的b16f10小鼠黑色素肿瘤细胞，其中，b16f10细胞携带有正常功能的tipe2基因。待肿瘤生长到16天时，取相同数目的wt和tipe2^-/-的肿瘤组织块，用于提取肿瘤浸润白细胞。

2.肿瘤浸润白细胞提取

将脱颈处死的小鼠浸泡于75％酒精中5分钟，随后将小鼠放置于无菌超净台上，用手术剪刀和镊子取下肿瘤组织块，放置于10cm培养皿中。用剪刀将肿瘤组织剪成小块，加入酶混合液10ml重悬于50ml离心管中，于震荡培养箱200转/分震荡消化45-60分钟，用rpmi1640完全培养基加满离心管终止消化。

将组织块悬液放在70μm细胞筛网上，用5ml注射器手柄反复研磨，使细胞全部通过筛网滴到新的50ml离心管中。弃去筛网，组织研磨液经60g，4℃离心5min，弃沉淀。将细胞上清经1260g，4℃离心10min，弃上清，将细胞沉淀用rpmi1640完全培养基重悬。取15ml离心管按照小鼠肿瘤组织淋巴、单核巨噬、粒细胞分离液试剂盒说明书依次小心加入3ml分离液1、2ml分离液2、1ml分离液3，制成体积比为3:2:1，体积总量与rpmi1640完全培养基重悬的单细胞悬液体积相等的梯度界面。小鼠肿瘤组织淋巴、单核巨噬、粒细胞分离液试剂盒购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，产品编号lds1090z。

用吸管小心吸取细胞悬液样本加于分离液液面上，1260g，25℃离心30分钟。离心后，离心管中出现两层环状乳白色细胞层。用吸管吸取两层环状目的细胞层到新的15ml离心管中，往离心管中加入10mlpbs，混匀细胞。经1260g，4℃离心10min，弃上清，将细胞沉淀用pbs重悬待用，即本例的肿瘤浸润白细胞悬液。本例分别提取了wt肿瘤浸润白细胞和tipe2^-/-肿瘤浸润白细胞。

3.cd45⁺cd3⁺cd8⁺检测

将本例制备的肿瘤浸润白细胞的悬液用购自biolegend公司的流式抗体cd45/cd3/cd8于4℃染色30分钟，然后上流式细胞仪检测wt肿瘤浸润白细胞和tipe2^-/-肿瘤浸润白细胞中cd45⁺cd3⁺cd8⁺细胞的比例。本例的流式细胞仪购自bdbioscience公司。

4.tipe2基因敲除的肿瘤浸润白细胞增强抗肿瘤免疫反应的测试

将本例制备的肿瘤浸润白细胞的悬液用抗cd3/cd28磁珠刺激处理48小时，并于刺激的最后4-6小时加入50ng/ml的佛波酯(缩写pma)、1μg/ml的离子霉素(即ionomycin)和500ng/ml的布雷非德菌素a(缩写bfa)。收集细胞用购自biolegend公司的流式抗体cd45/cd3/cd8于4℃染色30分钟，再用bdcytofix/cytoperm^tm试剂固定破膜后抗体染色ifn-γ及相应同型对照，然后，上流式细胞仪检测wt肿瘤浸润白细胞和tipe2^-/-肿瘤浸润白细胞中各自的cd45⁺cd3⁺cd8⁺细胞产生ifn-γ的比例。

其中，抗cd3/cd28磁珠购自invitrogen公司，货号11456d。

检测cd45⁺cd3⁺cd8⁺细胞比例的结果如图4所示，cd45⁺cd3⁺cd8⁺细胞产生ifn-γ的比例如图5所示。图4和图5的结果显示，tipe2基因缺失不仅增加浸润了肿瘤杀伤性cd8⁺t细胞到肿瘤组织，而且上调了产生抗肿瘤活性细胞因子ifn-γ的cd8⁺t细胞的数目，增强了抗肿瘤免疫活性。

试验4tipe2基因缺失型的cd45⁺cd3⁺cd8⁺细胞抑制b16f10小鼠黑色素肿瘤生长的测试

采用皮下注射方式于tipe2基因缺失型小鼠(tipe2^-/-)种植2×10⁶的b16f10小鼠黑色素肿瘤细胞，其中，b16f10细胞携带有正常功能的tipe2基因。分三组分别腹腔注射同型对照(即isotype抗体组)、清除cd8⁺t细胞(即anti-cd8抗体组)和清除cd4⁺t细胞(即anti-cd4抗体组)，然后，采用直尺测量记录的手段，连续记录种植b16f10小鼠黑色素肿瘤细胞的肿瘤的长直径和短直径13天。按照肿瘤体积公式计算肿瘤体积，并统计肿瘤体积变化，以graphpad6.0软件进行数据分析。

肿瘤体积计算和统计结果如图6所示，图6为统计的b16f10小鼠黑色素肿瘤细胞种植tipe2基因缺失型小鼠(tipe2^-/-)的肿瘤体积增长曲线，横坐标是种植后培养天数，纵坐标是肿瘤体积；“●”曲线是isotype抗体组的肿瘤体积增长曲线，“■”曲线是anti-cd8抗体组的肿瘤体积增长曲线，“▲”曲线是anti-cd4抗体组的肿瘤体积增长曲线。图6的结果显示，tipe2基因缺失的cd45⁺cd3⁺cd8⁺细胞在b16f10肿瘤模型中具有增强的抑制原发性肿瘤生长的作用。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。