本发明涉及一种药食同源的天然化合物群的制备方法，具体涉及一种基于液态发酵法的降血脂天然化合物群的制备方法。
背景技术：
随着我国社会经济的快速发展和生活方式的改变,居民的营养与健康状况处于快速变迁时期。近20年来，我国居民的谷类(主要是粗粮)摄入量迅速减少，动物性食物的摄入量急剧增加；自20世纪90年代中期起，成人超重与肥胖呈现加快增长趋势。据国家卫生计生委疾病预防控制局公布的《中国居民营养与慢性病状况报告(2015)》显示，2012年18岁及以上成人的血脂异常发生率为40.4％，其也是诱发心脏血管病的危险因素。研究可降低高血脂、又具有药食同源性质的天然化合物，能安全有效控制血脂、辅助治疗慢性病，对于确保我国人群健康、控制心脏血管病发生率具有极其重要的意义。
茯苓poriacocos(schw.)wolf.为多孔菌科卧菌属真菌的干燥菌核，有健脾补中、养心安神、利水渗湿功能；茯苓多糖、三萜皂苷等成分具有良好的降低高血脂效应。山楂为蔷薇科植物山楂crataeguspinnatifidabge的干燥成熟果实，能消食导积、活血散瘀；山楂中黄酮、三萜、有机酸类成分具有降脂作用，防治高脂血症具有确切疗效。以上两者均属于国家卫计委规定的药食同源类原料。红曲是我国传统的食药两用发酵产品，其由红曲霉属真菌接种于大米发酵而成，是一种食疗兼备的传统中药；红曲霉菌也在国家食药局规定的《保健食品的真菌菌种名单》中。红曲霉菌在发酵过程中能代谢产生monacolink等化合物，具有良好的降低胆固醇作用，疗效显著、毒副作用小、耐受性好。
因此，如何利用茯苓、山楂、红曲霉菌制备一种用于降低高血脂的天然化合物群，综合茯苓、山楂、红曲霉菌的效用，安全有效控制血脂、辅助治疗慢性病，是本发明需要解决的问题。
技术实现要素：
本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种基于液态发酵法的降血脂天然化合物群的制备方法，在使用超过上千年的传统中医药中筛选出山楂、茯苓、红曲等，运用现代液体发酵技术，制备一种可以用于降低高血脂的天然化合物群，作为一种原料可广泛用于保健食品。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种基于液体发酵法的降血脂天然化合物群的制备方法，包括以下步骤：
制备山楂、茯苓提取物，并利用所述山楂、茯苓提取物制备中药提取物干粉；
将所述中药提取物干粉与酵母粉、大米淀粉、大豆蛋白粉等按一定比例混合；
加入红曲霉菌，进行液态发酵处理；
喷雾干燥，获取降血脂天然化合物群。
进一步，所述的制备山楂、茯苓提取物，并利用所述山楂、茯苓提取物制备中药提取物干粉，包括：
将山楂、茯苓药材按质量比1：1混合，粗粉碎；
将筛后的粗粉与去离子水按质量体积比1：8～1：10混合，冷浸30分钟后，加热煮沸并保持微沸提取1～1.5小时，趁热过滤；
滤后残渣再按质量体积比1：6～1：8的比例加入离子水混合，加热煮沸并保持微沸提取0.75～1小时，趁热过滤；
收集滤液，减压浓缩成膏状，密度为1.10-1.30g/cm3；
将提取物膏减压干燥成干膏，并粉碎成粉，得到中药提取物干粉；并称量其质量，并折算成原药材质量，备用。
进一步，所述的红曲霉菌在进入液态发酵罐之前经过发酵培养，所述红曲霉菌培养基组成：70-100g/l葡萄糖，0.01-0.02g/l蛋白胨，0.002-0.003g/l磷酸二氢铵，0.0004-0.0006g/l七水硫酸镁，0.0001-0.0002g/l氯化钙，调ph至4.8-5.0，纯化水定容至一定体积，于121℃、0.1mpa压力下灭菌15-30分钟；将红曲霉菌移种于红曲霉菌培养基中，于生物恒温培养摇床中进行培育；摇床温度控制在30-35℃，摇床速度控制在160-200转/分钟，发酵时间控制在16-24小时；以菌丝体生长速度为参照，记录每毫升培养液中孢子数目，并于光学显微镜下观察菌丝体浓度，控制原菌液中所述菌丝体的折算浓度为5.0-8.0×102株/毫升，得到红曲霉菌原菌液。
进一步，所述的将所述中药提取物干粉与酵母粉、大米淀粉、大豆蛋白粉按一定比例混合，包括：
按一定比例混合后加入纯化水，并使用均质乳化机搅拌均匀；物料温度80℃，搅拌速度≥3000转/分钟，搅拌时间为15-30分钟，制成原浆；
以液体发酵体积为计算基础，每100毫升水中的加入干物质质量为准，药材提取物干粉以折算成原药材质量2.5-3％；蛋白质含量≥50％的酵母粉：3％-3.5％；大米淀粉：0.8-1.2％；大豆蛋白粉：2.0-2.5％；nano3:0.18-0.22％；mgso4·7h2o:0.08-0.12％；kh2po4:0.18-0.22％；znso4·7h2o:0.34-0.38％。
进一步，将所述原浆加入纯化水稀释，于发酵罐中搅拌，并使用乳酸调节ph值，搅拌均匀致4.9-5.1；对培养基灭菌，温度123℃，灭菌时间30-45min，得到液态发酵基。
进一步，所述的进行液态发酵处理，包括：将液态发酵基冷却至常温后，按体积比1:100～3:100的比例加入所述红曲霉菌原菌液，得到混合后的液态发酵液。
进一步，将所述液态发酵液于发酵罐中进行液态条件下发酵；发酵期间，根据发酵液溶氧数据调控：
a)无菌空气进入罐中的流速；
b)发酵罐中双桨各自独立桨速。
具体的，所述根据发酵液溶氧数据调控，包括：
根据红曲霉菌的生长特点，发酵期间，发酵罐中传感器所测定的溶解氧浓度应控制在20％～30％；
液态发酵共分2个阶段进行：细胞生长阶段与生物代谢物生物合成的阶段：
其中，第一阶段温度控制在30-32℃；搅拌桨速控制在230-250r/min，上桨速度应稍高于下降速度5-10r/min；通气量1-3wm，wm表示每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值，根据溶解氧浓度调整通气量；
第二阶段，温度控制在22-25℃；搅拌桨速控制在190-210r/min，上下桨速度相同；通气量1-3wm，根据溶解氧浓度调整通气量；
发酵罐中液态发酵液体第一阶段时间控制在2-4天，第二阶段控制在4-8天。
进一步，所述喷雾干燥，获取降血脂天然化合物群，包括：所述液态发酵液，于第二阶段结束后停止发酵，从发酵罐中取出发酵液，减压回收部分水分后，喷雾干燥成固态细粉。
进一步，根据原料投料计量及现有测量方法测定monacolin-k、黄酮、三萜类化合物、有机酸等成分后，按比例添加适当的食用辅料，制备片剂、颗粒剂、软胶囊剂、丸剂或口服液。
本发明所述的液态发酵原料里，包括国家卫计委规定的药食同源原料山楂、茯苓提取物；国家食药局规定的《保健食品的真菌菌种名单》中的红曲霉菌；以及酵母粉、大米淀粉、大豆蛋白粉等。根据本领域的公知常识和辅料的成分，本发明的天然化合物群可以制成本领域常用的各种剂型。
本天然化合物群的各种成分组合作用，实现降低高血脂的效果。经典的抗高血脂动物实验的结果证明，本细粉能明显降低高脂饲料饲养小鼠的异常血脂，具有良好的抗高血脂作用。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
将山楂、茯苓药材按质量比1：1混合，粗粉碎过4目筛，称量。将筛后的原料与去离子水，按1：8(质量：体积)混合，冷浸30分钟后，加热煮沸并保持微沸提取1小时，趁热过滤；滤后残渣再加入去离子水按1：8混合，加热煮沸并保持微沸提取0.75小时，趁热过滤。收集滤液，将滤液减压浓缩成膏状，密度为1.10-1.30g/cm3。将提取物膏减压干燥成干膏，并粉碎成粉，并称量其质量，并折算成原药材质量，备用，其中山楂、茯苓混合药材干浸膏粉出膏率为21.3％。
制备红曲霉菌培养基：按1l算，取葡萄糖80g，蛋白胨0.015g，磷酸二氢铵0.0026g，七水硫酸镁0.0005g，氯化钙0.00015g纯化水定容至1l，于121℃、0.1mpa压力下灭菌15-30分钟。冷却至常温。
红曲霉菌菌种培养：将红曲霉菌种移种于红曲霉菌培养基中，于生物恒温培养摇床中进行培养；摇床温度控制在32℃，摇床速度控制在170转/分钟，发酵18小时。发酵结束后记录每毫升培养液中孢子数目，实测在原菌液中折算浓度为7.2×102株/毫升。
液态发酵前将中药提取物干粉、酵母粉、大米淀粉、大豆蛋白粉等固体粉末，按一定比例混合后加入纯化水，并使用均质乳化机搅拌均匀；均质搅拌前将搅拌机内温度预加热至80℃，投入物料，搅拌速度≥3000转/分钟，搅拌时间为15-30分钟，制成原浆液。以发酵罐体积为计算基础，每100毫升水中的加入干物质质量为准，其中中药提取物以折算成原药材质量2.8％；酵母粉(蛋白质含量≥50％)：3.2％；大米淀粉：1.0％；大豆蛋白粉：2.2％；nano30.20％；mgso4·7h2o0.10％；kh2po40.20％；znso4·7h2o0.36％。均质搅拌前将搅拌机内温度预加热至80℃，以上材料投入均质乳化机后，在转速为3000转/分钟条件下搅拌20分钟，制成原浆液。
液态原浆液加入发酵罐中，补充纯化水至计算体积并搅拌均匀，并使用乳酸调节ph值，搅拌均匀致ph5.0；温度123℃，灭菌时间30-45min，进行灭菌。
灭菌后的液态发酵基冷却至常温后，加入红曲霉菌原菌液，按最终液态发酵基溶液体积比(2.2：100)加入。于发酵罐中进行液态条件下发酵。
根据红曲霉菌的生长特点，发酵罐中电子鼻所测定的溶解氧浓度应控制在25％。液态发酵共分2个阶段进行：细胞生长阶段与生物代谢物生物合成的阶段。其中，第一阶段温度控制在30℃，时间控制在2.5天；搅拌桨速控制在230-250r/min，上桨速度应稍高于下降速度5-10r/min；通气量1-3wm(wm表示每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值)，根据溶解氧浓度调整通气量。第二阶段，温度控制在22-25℃，时间控制控制在4-8天；搅拌桨速控制在190-210r/min，上下桨速度相同；通气量1-3wm，根据溶解氧浓度调整通气量。发酵期间每天从发酵罐中取出样液，观察红曲霉菌丝生长状况、monacolin-k为主的代谢产物浓度。
结束发酵后，从发酵罐中取出发酵液。减压回收部分水分后，调整密度至1.21g/cm3，喷雾干燥成固态细粉，并称量质量，折算出对应喷雾干燥细粉1g含山楂+茯苓原药材1.43g。
实施例2
选择了药理学实验来确认实施例1所制备的固态细粉的降低高血脂作用。实验动物为50只雄性昆明小鼠，体重28±2g，随机分为5组，即，给予一定体积的生理盐水正常组(1)、模型组(2)，低剂量组(3)、中剂量组(4)和高剂量组(5)；每组十只，2-5号组给予高脂饮食。根据药典推荐剂量，山楂为9-12g/天，茯苓为10-15g/天，均取10g/天为最高剂量组，根据动物与人体表面积比换算法，高剂量组为2.6g/kg，中剂量组为1.3g/kg，低剂量组为相当于0.65g/kg；1，2号组给予生理盐水，均灌胃给药，每天1次，连续服用14天。于14天后测定血清胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)及高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)。结果见表1。
表1不同组小鼠血液中tc、tg、ldl-c、hdl-c比较
实验结果显示，本方法制备的天然化合物群与模型组相比，具有良好的降低血液中tc、tg、ldl-c的浓度，升高hdl-c浓度，显示出良好的降低高脂饮食喂养的小鼠血脂的效果；高剂量组效果最好。
实施例3
建立高效液相色谱测定monacolin-k的方法。精密称取喷雾干燥所得的粉末0.1g，置于离心管中，加入10.0mlph3的磷酸水溶液。超声提取30min后再加入10.0ml三氯甲烷，置于涡旋混匀器混匀15min。静置后去掉上层水相，将三氯甲烷层以3000r/min离心3min。使用c18反向色谱柱(4.6mm×250mm)，柱温为室温；紫外检测波长238nm；流动相为乙腈：水：0.5％磷酸＝60：37：3(体积比)；流速为1.0mlmin，进样量10微升。测定1批喷雾干燥样品，固体粉末中monacolin-k含量为1.02％(内酯式+酸式总和)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。