制备212Pb标记的单克隆抗体的制作方法

本发明涉及用于治疗用途的铅-²¹²的生产。尤其地，本发明的实施方式涉及基于铅-²¹²的放射性标记的蛋白质的生产方法，例如放射性免疫共轭物。

背景技术：

铅-²¹²(²¹²pb)是一种很有前景的治疗性放射性核素，因为它通过短寿命的α发射子体衰变，每一²¹²pb衰变平均导致一个α粒子。

²¹²pb的半衰期是10.6个小时，这限制了对其的使用，因此需要快速、安全地生产和纯化工艺。目前，在针对腹膜癌的临床试验中，基于铅-²¹²的放射性免疫共轭物使用在阳离子交换柱中从²²⁴ra分离的以及在无机酸中洗脱的²¹²pb，所述无机酸必须在放射性标记之前重构。

目前的方法由于低于定量洗脱输出，以及洗脱与标记之间的时间而导致损失。

因此，需要将这些问题考虑在内的新方法。

技术实现要素：

本发明涉及一种生产放射性核素标记的蛋白质的方法，所述方法包括：a)提供一种含有²²⁴ra和²¹²pb的水溶液，以及含有一与螯合剂共轭的蛋白质的水溶液或易溶解制剂，b)混合并孵化a)中提供的溶液以提供一含有放射性核素标记的蛋白质的反应溶液，c)通过凝胶过滤色谱法纯化反应溶液，以及d)从步骤c)的纯化中回收放射性核素标记的蛋白质。

所述蛋白质可以选自由单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、合成蛋白质和肽组成的组。

在步骤d)中回收的放射性核素标记的蛋白质可以包括²¹²bi和²¹²pb。

在本发明的一个实施例中，在步骤a)中含有²²⁴ra和²¹²pb的溶液具有由²²⁴ra和²¹²pb产生的1至10000mbq的放射性活度，例如50至1000mbq，1kb1至1gbq，例如10kbq至100mbq，例如100kbq至10mbq，例如10mbq至200mbq。

在本发明的另一个实施例中，在步骤a)的水溶液中²¹²pb比²²⁴ra的以mbq表示的活度比为0.5-2，例如0.8-1.5，或者例如0.8-1.3，或者优选例如0.9-1.15。

在本发明的另一个实施例中，与在步骤d)中回收的与螯合剂共轭的蛋白质以0.01-50mg的量存在，例如0.1-25mg，例如0.5-10mg，例如1-5mg。

在本发明的另一个实施例中，在步骤a)中溶液的量为10μl至1000ml，例如500μl至100ml，例如1ml至10ml。

在本发明的另一个实施例中，在步骤a)中含有与螯合剂共轭的蛋白质的溶液具有浓度为0.1至4mg/ml的与螯合剂共轭的抗体，例如0.25至2mg/ml，例如0.5至1.5mg/ml，例如0.1至10mg/ml。

在本发明的另一个实施例中，在步骤b)中的混合和孵化进行1-180分钟，例如5-120分钟，例如15-60分钟，例如20-40分钟，例如30-60分钟。

在本发明的另一个实施例中，在步骤c)中的所述凝胶过滤色谱法选自由脱盐纯化、脱盐和缓冲液交换和脱盐凝胶排阻分离构成的组中。

在本发明的另一个实施例中，反复进行脱盐以增加纯度。

在本发明的另一个实施例中，向待纯化的原液中加入螯合剂以络合未络合的放射性核素以进一步增加在脱盐步骤中回收的最终放射性共轭物的纯度。

在本发明的另一个实施例中，步骤c)中的纯化由离心驱动、压力驱动、真空驱动或重力驱动组成的方法中的一种来驱动。

在本发明的另一个实施例中，所述螯合剂是tcmc。

在本发明的另一个实施例中，抗体选自由曲妥单抗、利妥昔单抗、hh1、西妥昔单抗、贝伐单抗、达雷木单抗、阿仑单抗、派姆单抗、依帕珠单抗、l19、f8、f16、加利昔单抗、托西珠单抗、阿仑单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗、阿夫土珠单抗、托西莫单抗、瑞妥昔和替伊莫单抗构成的组的一种或多种。

在本发明的另一个实施例中，所述抗体对选自cd19、cd20、cd22、cd33、cd37、cd38、cd45、cd74、cd138、psma、her-2、egfr、muc-1、muc-18、cea、fbp、ng2、epcam、粘结合蛋白多糖-1、ca-125、lk-26、hmfg、cs-1和bcma构成的组中的抗原具有特异性。

本发明的另一个方面涉及通过本发明的方法回收的放射性核素标记的蛋白质。

本发明的另一个方面涉及用于生产放射性核素标记的蛋白质的试剂盒，所述放射性核素标记的蛋白质包括含有²²⁴ra和²¹²pb的水溶液以及含有与螯合剂共轭的蛋白质的水溶液，用于凝胶过滤色谱法的装置，以及可选地生产放射性核素标记的蛋白质的说明书。

具体实施方式

目前用于生产²²⁴ra标记的蛋白质，例如一抗体的方法，由于小于定量的洗脱输出以及洗脱和标记之间的时间会导致损失。

本发明的目的在于提供一种可替代的新的且具有创造性的方法，其将上述问题考虑在内。

一个解决方案是一种在²²⁴ra溶液中用²¹²pb原位标记单克隆蛋白质(例如一抗体)，随后去除²²⁴ra的方法作为制备基于²¹²pb的放射性标记的蛋白质(例如放射性免疫共轭物)的替代策略。

在本发明的上下文中，放射性免疫共轭物定义为一种包括放射性核素、共轭物和诸如抗体等蛋白质的物质。其也同样表示放射性核素标记的蛋白质或放射性核素标记的抗体。

本发明涉及一种生产放核素标记的蛋白质的方法，所述方法包括：a)提供一种含有²²⁴ra和²¹²pb的水溶液，以及含有与一螯合剂共轭的蛋白质的水溶液或易溶解制剂，b)混合并孵化a)中提供的溶液以提供一含有放射性核素标记的蛋白质的反应溶液，c)通过凝胶过滤色谱法纯化反应溶液，以及d)从步骤c)的纯化中回收放射性核素标记的蛋白质。

所述蛋白质可以选自由单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、合成蛋白质和肽组成的组。

所述蛋白质也可以是一谷氨酸-尿素基序(glu-ureamotif)。所述谷氨酸-尿素基序靶向psma。靶向psma的谷氨酸-尿素基序可以选自psma-617、psma-11、mip-1427组成的组。所述蛋白质也可以选自由生物素或卵白素或类似物，以及叶酸和衍生物组成的组。

由于本发明的尺寸排他性歧视，因此本发明的蛋白质尺寸是任何大于²²⁴ra的尺寸。因此，蛋白质的尺寸以分子质量mr表示是大于300。在一个本发明的实施例中，蛋白质的尺寸的分子量mr为500-500.000。尺寸也可以是分子量mr为40.000-200.000或500-5000。

在本发明的一个优选实施例中，蛋白质为抗体。

在本发明的一个实施例中，用于本发明的方法中的²²⁴ra可以使用离子交换色谱法，耦合²²⁸th的螯合剂树脂(例如ac-树脂或tru-树脂或tho浆液)来制造。所述tho浆液如美国专利us7,887,782中描述的。

本发明的实例表明在²²⁴ra与²¹²pb平衡的溶液中，以单克隆抗体为例的tcmc共轭的蛋白质可以由²¹²pb有效地标记。

随后，使用例如脱盐凝胶排阻分离法可以将²¹²pb标记的共轭物从阳离子²²⁴ra中分离。这意味着可以将随时可以使用的²²⁴ra/²¹²pb溶液从集中供应商运输至终端用户。

在溶液中使用²²⁴ra有两个优点：1)避免了酸萃取步骤，节省了操作时间；2)省时省力，不需要蒸发酸等。产出率也更高。

从在强直性脊柱炎的治疗中使用²²⁴ra的研究可知，在不产生相当大的骨髓毒性的情况下可以将适量(通常少于10mbq)的²²⁴ra施加于患者，这表明只要²¹²pb产物不产生高度的骨髓毒性，在基于²¹²pb的产物中1-2％的²²⁴ra含量是可以被接受的。

如果就²²⁴ra而言需要更纯的产物，则在第二pd-10柱上重复纯化可以实现这一点。与目前基于离子交换的发生器可能需要多次“萃取”(尽管容量快速下降)相比，所述基于²²⁴ra溶液的发生器仅需使用一次。

在与共轭物反应结束时并在进行脱盐步骤之前将第二螯合剂，优选为低分子量的第二螯合剂(例如edtmp)加入原液中以络合未络合的放射性核素可以进一步提高最终产物的纯度。

因此，本发明实施例证明了一种可替代的方法，使用²²⁴ra作为可运输的发生器，用于生产基于²¹²pb的放射性共轭蛋白质，该方法与目前的基于离子交换法相比简单且耗时更少。

浓度比例和含量

在本发明的方法的溶液中的放射性强度可以根据使用目的而不同。在本发明的一个实施例中，在步骤a)中含有²²⁴ra和²¹²pb的溶液具有由²²⁴ra和²¹²pb产生的放射性活度1至10000mbq，例如50至1000mbq，1kbq至1gbq，例如10kbq至100mbq，例如100kbq至10mbq，例如10mbq至200mbq。

在一个实施例中的放射性活度是10kbq至10mbq。

在一个优选的实施例中的放射性活度是10kbq至100mbq。

本发明含有²²⁴ra和²¹²pb的溶液可以由²²⁸th生产。

由于²¹²pb的进一步衰变，回收的放射性核素标记的蛋白质可以包括²¹²bi。因此，本发明的组合物的蛋白质的²¹²bi/²¹²pb的比例可以为²¹²bi/²²⁴ra的1/1的+/-30％的范围内。比例也可以在1/1的+/-20％的范围内，或1/1的+/-10％的范围内。

在本发明的一个实施例中，回收的放射性标记的蛋白质例如是抗体，根据施药和剂量所需的量按比例调整。

因此，在本发明的一个实施例中，回收的放射性标记的核素标记的蛋白质(例如是抗体)随后制成药物组合物。

一种药物组合物包括本发明的回收的放射性核素标记的蛋白质(例如抗体)，以及稀冲液、载体、表面活性剂和/或赋形剂。

可接受的药物载体包括但不限于无毒缓冲液、填充剂、等渗溶液、溶剂和助溶剂、抗菌防腐剂、抗氧化剂、湿润剂、防沫剂及增稠剂等。更具体地，药物载体可以是但不限于生理盐水(0.9％)、半生理盐水、乳酸林格氏液、溶解的蔗糖、葡萄糖，例如3.3％葡萄糖/0.3％生理盐水。所述药学上可接受的载体可以包含辐射分解稳定剂，例如抗坏血酸、人血清白蛋白，其在存储和运输过程中保护放射性药物的完整性。

在一个实施例中，在回收步骤d)之后进行药物组合物的配制。

由于²²⁴ra的衰变系列中含有氡子体，其可能扩散到空气中，为了防止²²⁰rn的逸出，必须将装有该产品的小瓶密封好。

由于α辐射的高度局部性，必须将辐射分解视为潜在问题，并且放射性药物必须设计为使辐射分解最小化。根据本领域的知识，放射性标记的蛋白质(例如抗体)对辐射分解敏感，因此试剂盒系统对于²²⁴ra溶液可能是有利的，其与螯合剂共轭的抗体一起用于清除²¹²pb和/或²¹²bi。

对于单克隆抗体而言，通常建议将产生放射性药物溶液的α颗粒的自身剂量保持在0.5kgy以下，以避免由于辐射分解而降低结合性。因此，建议在注射前几小时至10分钟将试剂盒系统中的螯合剂共轭的蛋白质(例如抗体)加入到²²⁴ra(包括子体)溶液中以浓缩溶液，从而用于远程运输。

通过每剂1kbq至10gbq的放射性核素的量来制备药物组合物。

在本发明的另一个实施例中，步骤a)中的水溶液中的²¹²pb和²²⁴ra之间以mbq为单位的活度比例为0.5至2，例如0.8-1.5、或例如0.8-1.3，或优选地例如0.9-1.15。所述活度比例优选为0.5至2。

术语“活度比例”，例如²¹²pb和²²⁴ra之间的活度比例指的是²¹²pb与²²⁴ra的mbq比。

在本发明的又另一个实施例中，在步骤d)中回收的与螯合剂共轭的蛋白质(例如抗体)的存在量为0.05-50mg，例如0.1-25mg，例如0.5-10mg，例如1-5mg。所述量优选为0.05-50mg。

在本发明的另一个实施例中，在步骤a)中的溶液在体积为100μl至1000ml，例如500μl至100ml，例如1ml至10ml。所述容积优选为100μl至1000ml。

在本发明的另一个实施例中，在步骤a)中含有与螯合剂共轭的蛋白质(例如抗体)的溶液具有浓度为0.1至4mg/ml的与螯合剂共轭的蛋白质(例如抗体)，例如0.25至2mg/ml，例如0.5至1.5mg/ml，例如0.1至10mg/ml。所述浓度优选为0.1至4mg/ml。

混合与孵化

在本发明的又另一个实施例中，步骤b)中进行的混合和孵化的时间为1-180分钟，例如5-120分钟，例如15-60分钟，例如20-40分钟，例如30-60分钟。所述时间优选为30-60分钟。

所述混合可以通过自动振动器进行。温度优选为30-40℃，更优选为37℃。

凝胶过滤色谱法

尺寸排阻色谱法(sec)，也即被人们所知的分子筛色谱法是一种色析层离法，其中溶液中的分子通过其尺寸及某些情况下通过分子量而分离。其经常被用于大分子或大分子复合物(例如蛋白质)，以及工业聚合物。通常情况下，当使用水溶液通过色谱柱来运输样本时，被人们所熟知的技术是凝胶过滤色谱法，相对于凝胶渗透色谱法，所述凝胶渗透色谱法在使用有机溶剂作为流动相时被使用。sec是一种应用广泛的聚合物表征的方法，这是因为其能够提供良好的聚合物摩尔质量分布(mw)结果。

因此，在本发明的另一实施例中，步骤c)中的凝胶过滤色谱法选自由脱盐纯化、脱盐和缓冲液交换和脱盐凝胶排阻分离构成的组。

因此，本发明的凝胶过滤色谱法也是被人们所熟知的尺寸排阻色谱法(sec)，其使用水溶液通过色谱柱来运输。

在本发明的另一实施例中，重复脱盐以提高纯度。脱盐可以重复一次、二次、三次或四次。

在另一个实施例中，在与共轭物反应结束时以及进行脱盐步骤之前，将第二螯合剂，优选为低分子量的第二螯合剂(例如edtmp)加入到原液中以络合未络合的放射性核素，从而进一步提高最终产物的纯度。

色谱柱的示例包括pd-10脱盐柱(sephadexg-25pd-10column)和econo-pac10dg脱盐柱(biorad)。

本发明的方法中的用于纯化的尺寸范围可以改变。在一个实施例中，分子量mr为1000-500000。

所选择的范围确保本发明的放射性核素标记的蛋白质(例如放射免疫共轭物)被纯化。也可以选择其他范围以优选纯化，例如，分子量mr为500-5000，分子量mr为1000-10000。

在本发明的另一实施例中，步骤c)的纯化是通过选自离心驱动、压力驱动、真空驱动或重力驱动构成的组中的一种方法所驱动的。

螯合剂

本发明中的放射性核素将优选地通过使用螯合剂，或更优选双功能螯合剂与蛋白质(例如抗体)共轭。

这些螯合剂可以是环状的、直链的或支链的螯合剂。特别涉及聚氨基多元酸螯合剂，其包含一直链的、环状的或支链的多氮杂烷烃主链，其中主链氮上连接有酸性(例如烃羧基)基团。

本发明的螯合剂适用于结合²¹²pb。其可以通过任何技术人员所熟知的常规键与蛋白质共轭，包括共价键和静电键。

合适的螯合剂示例包括dota和dota衍生物，例如p-异硫氰基苄基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(p-scn-bz-dota)，以及dtpa衍生物，例如p-异硫氰基苄基-二亚乙基三胺五乙酸(p-scn-bz-dtpa)，第一种是环状螯合剂，后者是直链螯合剂。

在一个实施例中，螯合剂是edtmp或dotmp。

在本发明的另一个实施例中，螯合剂是(2-(4-异硫氰基苄基-1,4,7,10-四氮杂-1,4,7,10,四-(2-甲酰基)-环十二烷)，也称为tcmc。

抗体

本发明的抗体可以是单克隆或多克隆的。

在本发明的一个实施例中，抗体选自由由曲妥单抗、利妥昔单抗、hh1、西妥昔单抗、贝伐单抗、达雷木单抗、阿仑单抗、派姆单抗、依帕珠单抗、l19、f8、f16、加利昔单抗、托西珠单抗、阿仑单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗、阿夫土珠单抗、托西莫单抗、瑞妥昔和替伊莫单抗构成的组中的一种或多种。

在本发明的另一个实施例中，抗体对选自cd19、cd20、cd22、cd33、cd37、cd38、cd45、cd74、cd138、psma、her-2、egfr、muc-1、muc-18、cea、fbp、ng2、epcam、粘结合蛋白多糖-1、ca-125、lk-26、hmfg、cs-1和bcma构成的组中的抗原具有特异性。

放射性核素标记的蛋白质

本发明的另一个方面涉及放射性核素标记的蛋白质，例如放射性标记的抗体，其根据本发明的方法回收。

本发明的另一个方面涉及放射性核素标记的蛋白质，例如放射性核素标记的抗体组合物，其含有与一抗体共轭的游离²²⁴ra和²¹²pb。

在本发明的一个实施例中，该组合物包括少于10％的游离²²⁴ra。

在本发明的一个实施例中，该组合物包括少于5％的游离²²⁴ra。

在本发明的另一个实施例中，该组合物包括少于3％的游离²²⁴ra。

在本发明的另一个实施例中，该组合物包括少于2％的游离²²⁴ra。

在本发明的另一个实施例中，该组合物包括大于0.1％的游离²²⁴ra。

所述组合物还可以包括0.1-3％的游离²²⁴ra。该范围也可以是0.1-2％的游离²²⁴ra或0.1-1％的游离²²⁴ra。

所述组合物可以包括少于50％的游离²¹²bi。该量也可以是10-50％或30-50％。

一部分²¹²pb也可以是游离的并且不与螯合剂-抗体共轭。因此，游离²¹²pb的量可以少于20％，例如少于10％。

因此，本发明的一个方面涉及一种放射性核素标记的蛋白质组合物，其含有：与一蛋白质共轭的²¹²pb，与一蛋白质共轭的²¹²bi，0.1％-2％的游离²²⁴ra，少于50％的游离²¹²bi以及少于20％的游离²¹²pb。

术语“游离”指的是放射性核素，其不与螯合剂-抗体耦合。其可以通过本文所描述的以及本领域技术人员已知的技术来测量。

试剂盒

本发明的另一个方面涉及一种用于制造放射性核素标记的蛋白质的试剂盒，例如含有具有²²⁴ra和²¹²pb水溶液的放射性核素标记的抗体，涉及一种含有与一螯合剂共轭的蛋白质(例如抗体)的水溶液，涉及用于凝胶过滤色谱法的装置，以及可选择地涉及用于生产诸如放射性核素标记的抗体的放射性核素标记的蛋白质的说明书。

在一个实施例中，所述试剂盒包括小瓶，其含有中和溶液，以在施药于患者之前调节放射性药物溶液的ph和/或等渗性。

在本发明的一个实施例中，在回收放射性共轭蛋白质或放射免疫共轭物前30分钟至60分钟，将所述螯合剂共轭蛋白质(例如抗体)加入到²²⁴ra和²¹²pb溶液中。

在本发明的一个实施例中，在回收放射免疫共轭物前1至45分钟，将螯合剂共轭蛋白质(例如抗体)加入于²²⁴ra和²¹²pb溶液中。

在本发明的一个实施例中，在回收放射免疫共轭物前20至45分钟，将螯合剂共轭蛋白质(例如抗体)加入到²²⁴ra和²¹²pb溶液中。

综述

应当理解的是，上述与根据本发明的化合物相关的任何特征和/或方面都可以类比地适用于本文所述的方法。

术语x和y，可交替使用。

以下提供图表和示例以说明本发明。其是说明性的，不应以任何方式被解释为限制性的。

实施例

实施例1-测量放射性活度

用耦合到dsa1000数字信号分析仪的液氮冷却的井式高纯度锗检测器(gwc6021，canberraindustries，meridenct，usa)进行y光谱分析。用genie2000软件(version3.1，canberraindustries，meridenct，usa)分析光谱。

使用放射性同位素校准器(crc-25r，capintecinc.,ramsey，nj，usa)测量更大的放射性量。

在cobraii自动伽玛计数器(packardinstruments，downersgrove，il,usa)或hidex自动伽玛计数器(hidex，turku，finland)上计数放射性样本。

实施例2-²²⁴ra-发生器

由²²⁸th源和色谱柱上的锕系元素树脂组成²²⁴ra发生器。该色谱柱可以保留²²⁸th，而²²⁴ra(加上一个或多个子体)可被1mhcl洗脱。所有使用浓缩后的放射性制剂的工作，包括溶剂的蒸发，都在手套箱中进行。

从商业供应商获得1mhno3中的²²⁸th源，以及从eichromtechnologiesllc(lisle，il，usa)以2ml预包装柱的形式获得基于萃取剂的锕系元素树脂。提取锕系元素树脂中的材料，并且用1mhcl对树脂进行预处理。为了使用更少容积的溶剂，将约25％(0.5ml)的树脂重新包装在更小的1mlisolutespe，biotageab,uppsala,sweden色谱柱中。在发生器运行期间释放部分²²⁸th的情况下，将不具活性的树脂引入色谱柱的底部以用作捕捉少量²²⁸th的捕捉层。在小瓶(4ml瓶，e-csample，wheaton，millville，nj，usa)中制备约40％(0.4ml)的柱内含物和0.1mhno3中600μl²²⁸th的浆液，并通过温和搅拌孵化浆液至少四个小时以固定²²⁸th。之后将放射性的浆液装载至色谱柱上。

可以使用2ml的1mhcl常规地从该色谱柱中洗脱镭。为了进一步的纯化，使用未蒸发的2ml的粗制1mhcl并加载到第二锕系元素树脂柱上，所述第二锕系元素树脂柱用额外的0.5ml的1mhcl洗涤，以产生含有²²⁴ra的2.5ml洗脱液。使用加热部件将该溶液蒸发至干燥并且使用n2气通过聚四氟乙烯管入口和小瓶上的橡胶/聚四氟乙烯隔板中的出口吹扫小瓶，并通过一股n2气体流将酸蒸汽引入饱和naoh烧杯中。蒸发后的残余物溶于0.2ml或更多的0.1mhcl中。

通过将来自洗脱液的样品储存最少10个²²⁴ra的半衰期(36天)来研究洗脱液中²²⁸th的可能突破，然后测定活度。

²²⁴ra溶液的纯度

通过对生产的²²⁴ra溶液的5％的样品进行存储，可以评估²²⁴ra和²²⁸th的纯度。使用随机选择的5个至少已经存储三个月的样本，任何存在的²²⁸th在测量时将与²²⁴ra及其子体平衡。测量是使用hidex伽玛计数器实现的，其已经校准以用于²²⁸th。

实施例3-抗体的放射性标记

使用与螯合剂tcmc(2-(4-异硫氰基苄基-11,4,7,10-四氮杂-1,4,7,10,四-(2-甲酰基)-环十二烷)共轭的人源化抗-her2igg1单克隆抗体曲妥单抗(herceptin,roche,basel,switzerland)用于²¹²pb的放射性标记。在与tcmc共轭之前，通过用离心浓缩器(vivaspin15r,50kdamwco,sartoriusstedimbiotech,germany)洗涂四次将曲妥珠单抗样品的缓冲液更换为碳酸盐缓冲液(在不含金属的水中的0.1mnahco3和5mmna2co3)。在更换完缓冲液后，用分光光度法测定抗体浓度。将溶解在5mmhcl中的tcmc溶液加入到碳酸盐缓冲液中的曲妥珠单抗中，其螯合剂浓度超过抗体浓度5倍。在室温下缓慢搅拌期间，允许该混合物反应2个小时。为了从tcmc-曲妥珠单抗中分离未共轭的螯合剂，以及同时将碳酸盐缓冲液更换为0.9％的nacl，使用离心过滤筒(vivaspin15r,50kdamwco)。用0.9％的nacl以1：10的比例稀释样品，并通过离心将抗体共轭物浓缩10倍。重复该过程共3次。将tcmc-曲妥珠单抗共轭物存储于4℃下直至放射性标记。

用10％5mnh4oac缓冲与子体核素平衡的²²⁴ra溶液。使用ph验证溶液的ph在5-6之间。混合tcmc-曲妥珠单抗和放射性溶液并在恒温振荡器上以750rpm和37℃下温育至少30分钟。在下文中，将由²¹²pb标记的曲妥珠单抗和游离²²⁴ra和子体核素组成的该溶液称为“反应混合物”。在最终反应混合物中用不同浓度的tcmc-曲妥珠单抗进行标记，其中浓度范围为0.1至0.4mg/ml。

实施例4-即时薄层色谱测定方法

用即时薄层色谱(itlc)条(型号#150-772,biodexmedicalsystemsinc,shirley,ny,usa)评估反应混合物中²¹²pb标记的抗体的放射性化学纯度。用由7.5％的人血清白蛋白和dpbs中5mmedta组成的2倍过量(容积)的制剂缓冲液混合一份反应混合物，并用naoh调节反应混合物的ph为7。旋转混合该混合物4-5分钟并静置5-10分钟。通常用1-4μl的样品在起始线处点样色谱条，并置于具有约0.5ml0.9％的nacl的小烧杯中用于显影。在溶剂前沿移动到指定的溶剂前沿线后，在切割线处将色谱条切成两半，并将每一半放入5ml的试管中进行计数。在该系统中，²¹²pb标记的抗体不从下半部分迁移，但是与edta络合的²¹²pb迁移至上半部分。

实施例5-纯化放射标记的抗体

本研究中描述的方法的最终所需产物是²¹²pb标记的tcmc-曲妥珠单抗纯溶液。为了获得这个，需要移除游离²²⁴ra和其他共轭的子体核素以纯化我们的反应混合物。评估了两个不同的纯化方法：通过离心浓缩的纯化和通过脱盐柱的纯化。

用vivaspin4和50kdamwco来进行离心浓缩的纯化。将反应混合物装载在浓缩器旋转管中并用0.9％的nacl稀释直至总容积为4ml。通过离心将内容物进一步浓缩约10倍。收集滤液和纯化的抗体溶液，测量放射性活度。根据这些测量结果，估算了该方法的产量：

然后使该样品衰变至少48个小时，以便在²²⁴ra和²¹²pb之间建立平衡，然后重新测量它们并计算纯化的抗体溶液中²²⁴ra的百分比：

使用sephadexg-25pd-10柱(amershambiosciences；uppsala,sweden)用于反应混合物的纯化。首先，根据制造商的说明书使用补充有0.5％bsa的dulbeccopbs作为洗脱缓冲液来平衡柱。在粗反应混合物和加入10倍过量(容积)的制剂缓冲液的反应混合物上进行pd10纯化。

在施加用于络合游离放射性核素和混合物的含有制剂缓冲液的edta到pd10柱之前，使含有制剂缓冲液的edta反应至少10分钟。将反应混合物装载到柱的顶部并允许其在加入另一洗脱缓冲液之前完全进入柱。继续洗脱过程直到在eppendorf管中收集到每份1ml的7份馏分，以用于进一步的放射性活度测量。通常在馏分3-5中洗脱放射性标记的抗体，并且通过测量值估计该方法的产量：

用前述的itlc方法测定馏分4中的产物的rcp。然后使样品衰变至少48小时以便在²²⁴ra和²¹²pb之间建立平衡，然后重新测量它们并计算馏分3-5中²²⁴ra的百分比：

实施例6-结果

²²⁴ra的放射性化学纯度

对于回顾性测量的所有五个样品，²²⁸th低于检测极限，估计每mbq的²²⁴ra(已衰变校正)中有1bq的²²⁸th。因此，所述纯化方法似乎非常适用于制备用于生物学应用的²²⁴ra。

tcmc-曲妥珠单抗的铅-212标记

在存在²²⁴ra的溶液中²¹²pb的标记效果良好，在每ml0.15mg和更高的抗体共轭物(表1)下产率高于90％。

使用微量离心装置从本发明²²⁴ra阳离子中纯化²¹²pb标记的抗体共轭物。表2示出了阳离子²²⁴ra的²¹²pb标记的曲妥珠单抗的浓缩和分离的数据。可以从表中看出，由于该方法，约有三分之一的²¹²pb标记的曲妥珠单抗显著丢失。²²⁴ra与放射性共轭物的分离完成了75％，其表明²¹²pb标记的曲妥珠单抗与²²⁴ra的比率从1：1升高至约3：1，这对于²¹²pb的放射性免疫共轭物的生物医学用途来说是不令人满意的。

使用通过pd-10凝胶过滤一次性脱盐柱，从本发明的²²⁴ra阳离子中纯化²¹²pb标记的抗体共轭物。

表2示出了阳离子²²⁴ra的²¹²pb标记的曲妥珠单抗的浓缩和分离的数据。²¹²pb标记的曲妥珠单抗的回收率通常为80％或更高，这是非常有利的。同样地，²¹²pb标记的曲妥珠单抗的rcp趋于增加至95％以上。而且，当使用edta淬灭反应混合物时，从溶液中去除²²⁴ra是非常有效的，在²¹²pb标记的曲妥珠单抗馏分中的洗脱通常少于2％。因此，使用由²²⁴ra/²¹²pb混合物制备的pd-10纯化的²¹²pb-曲妥珠单抗是可行的。

表1.在²²⁴ra溶液中用²¹²pb标记tcmc-抗体共轭物

表2.使用离心微型浓缩器纯化²²⁴ra溶液中²¹²pb标记的tcmc-抗体共轭物

pd10：

表3.使用sephadexg-25pd-10凝胶过滤一次性脱盐柱纯化²²⁴ra溶液中²¹²pb标记的tcmc-抗体共轭物

实施例7-讨论

本研究表明可以有效地用与²¹²pb平衡的²²⁴ra溶液中的²¹²pb标记tcmc-共轭的单克隆抗体。其后，可以使用脱盐凝胶排阻分离法从阳离子²²⁴ra中分离²¹²pb标记的共轭物。这意味着可以从集中式供应商运输即用的²²⁴ra/²¹²pb溶液至终端使用者。在溶液中使用²²⁴ra的优点是双重的：(1)避免了酸萃取步骤，节省了操作时间；2)省时省力，不需要蒸发酸等。从在强直性脊柱炎的治疗中使用²²⁴ra的研究可知，在不产生相当大的骨髓毒性的情况下可以将适量(通常少于10mbq)的²²⁴ra施加于患者，(3)这表明只要²¹²pb产物不产生高度的骨髓毒性，在基于²¹²pb的产物中1-2％的²²⁴ra含量是可以被接受的。如果在使用²²⁴ra的情况下需要更纯的产物，则在第二pd-10柱上重复纯化可以实现这一点。与目前基于离子交换的可能需要多次“萃取”(尽管容量快速下降)的发生器相比，所述基于²²⁴ra溶液的发生器仅需使用一次。综上所述，当前工作表明使用²²⁴ra作为可运输的发生器，用于生产基于²¹²pb的放射性共轭蛋白质，该方法与目前的基于离子交换法相比简单且耗时更少。

实施例8-使用新型基于²²⁴ra的发生器溶液制备²¹²pb标记的单克隆抗体

方法

放射性活度测量

在cobraii自动伽玛计数器(packardinstruments,downergrove,il,usa)上的70-80kev窗口中或在hidex自动伽玛计数器(hidex,turku,finland)上的60-110kev和520-640kev窗口中测量放射性样品。假定使用能量范围低于110kev的计数器来主要计算来自²¹²pb的γ辐射，该系列中的其他放射性核素的贡献非常小。由于²²⁴ra衰变在具有更多丰度的来自²¹²pb的γ的能量区域中具有适度的γ放射，因此在计数器的70-80kev或60-110kev的窗口中间接测定²²⁴ra的活度。这通过3天或更长时间后的重新测量样品来进行，此时存在于样品中的初始²¹²pb已衰减并且在²²⁴ra和新制造的²¹²pb之间已经达到平衡。评估520-640kev窗口以间接地从高丰度的来自²⁰⁸tl的γ确定²¹²bi。保持²¹²bi样品约20分钟，然后测量以获得²¹²pb和²⁰⁸tl²¹²bi之间的瞬间平衡。在表1中给出了²²⁴ra-系列中具有丰度大于1％的γ-射线。其显示了在60-110和520-640kev窗口内具有x-和/或γ-射线的放射性核素的概述。通过放射性同位素校准器(crc-25r,capintecinc.,ramsey,nj,usa)测量超过50kbq的放射性活度的量。

²²⁴ra-发生器

将钍-228(eckert&ziegler,braunschweig,germany)固定在柱筒内的(eichromtechnologiesllc,lisle,il,usa)锕系树脂上。通过使用hcl洗脱柱，从发生器萃取²²⁴ra。²²⁴ra-发生器设置的详细说明已在别处(专利us9433690b1)描述过。

抗体的放射性标记

将单克隆抗体曲妥珠单抗(herceptin,roche,basel,switzerland)与螯合剂tcmc((macrocyclicsinc.,dallas,tx,usa)共轭，并用于与²¹²pb的放射性标记。

在标记tcmc之前，将曲妥珠单抗的原始缓冲液替换为碳酸盐缓冲液(在欧洲药典的不含金属的水中0.1mnahco3和5mmna2co3)。使用离心浓缩器(vivaspin15r,30or50kdamwco,sartoriusstedimbiotech,germany)，用碳酸盐缓冲液洗涤并浓缩曲妥珠单抗溶液4次，使用对于0.1％的溶液，280nm处的免疫球蛋白的标准吸光度值为1.4的紫外分光光度法(hitachiu-1900,hitachihigh-technologiescorporation,tokyo,japan)来进行浓度测量。为了使tcmc与抗体共轭，将溶解在5mmhcl中的tcmc溶液加入5至10倍摩尔过量的碳酸盐缓冲液中的曲妥珠单抗中。混合物在室温下通过温和搅拌反应2小时之后，通过使用离心浓缩器筒(vivaspin15r,30or50kdamwco)以如上所述的重复方式使未共轭的螯合剂从tcmc-曲妥珠单抗中分离，并通过将碳酸盐缓冲液替换为0.9％nacl来降低ph。将tcmc-曲妥珠单抗共轭物储存于冰箱中直到放射性标记。

使用与0.1mhcl和0.5mnh4oac中的子代平衡的镭-²²⁴用于放射性标记。使用ph纸(merckmilliporegeneralphindicatorpaper,merckkgaa,darmstadt,germany))验证溶液的ph大致为5-6。用²²⁴ra溶液在恒温振荡器(eppendorfag,hamburg,germany)上37℃及750rpm下温育tcmc-曲妥珠单抗。将该溶液称为“反应混合物”。用已述方法检测在²²⁴ra溶液中不同浓度的tcmc-曲妥珠单抗共轭物(范围在0.1至6mg/ml)。通常，反应混合物容积在30-130μl之间。

在具体评估tcmc-曲妥珠单抗(4mg/ml)的²¹²pb和²¹²bi标记的实验中，在5分钟、15分钟和25分钟后从反应烧杯中取出样品，并通过即时薄层色谱法分析。

另外，通过让反应混合物孵育过夜以获得放射性标记的产物升高的辐射剂量来进行辐射分解实验。然后通过高效液相色谱法分析产物。此外，通过使用如前所述的一点测定法，使用抗原阳性肿瘤细胞测定免疫反应活性馏分(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27776176)。

即时薄层色谱分析方法

通过即时薄层色谱(itlc)条(型号#150-772，biodexmedicalsystemsinc,shirley,ny,usa)来测量标记产率，所述标记产率也表示反应混合物中²¹²pb标记的抗体的放射性化学纯度(rcp)。将反应混合物的样品与2倍过量的由7.5％人血清白蛋白和在dulbecoo的pbs中的5mmedta组成的制剂缓冲液(fb)混合，并用naoh调节ph为7。摇晃该反应混合物/fb约5秒并且静置至少5分钟以允许使未结合的放射性同位素形成具有edta的络合物。通常用3μl的样品在起始线处点itlc条并将itlc条，并置于具有少量的0.9％nacl的小烧杯中显影。在溶剂前沿几乎已经移动至顶部后，取出条并沿切割线将其剪成两半，将将每一半放入玻璃管中用于计数。在该系统中，²¹²pb-tcmc-曲妥珠单抗保持在下半部(b)固定，而与edta络合的²¹²pb(和其他游离放射性核素)移动至上半部(u)。与抗体连接的²¹²pb馏分的百分比确定为：

其中，cpm表示每分钟计数率。

免疫反应活性馏分的测定

在单点细胞结合实验中测定²¹²pb-tcmc-曲妥珠单抗的免疫反应活性馏分，如先前公布(等人2016)的那样进行。简而言之，表达人骨肉瘤细胞综合症的16-20×10⁶her2样品在室温下用²¹²pb-tcmc-曲妥珠单抗孵育或在加入²¹²pb-tcmc-曲妥珠单抗前用过量的曲妥珠单抗阻断。测定每个样品洗涤前施加的总活度和洗涤后结合的活度，并且通过洗涤后的总结合确定的分数除以之前施加的总分数并减去测定的与阻断样品相同的分数来测定预估²¹²pb-tcmc-曲妥珠单抗的免疫反应活性馏分的分数。

高效液相色谱法

高效液相色谱法(hplc)系统由1260infinitylv系统结合尺寸排阻tsk凝胶g3000sw×l色谱柱(tosohbioscience,productnumber08541)、uv(220和280nm)和辐射测量(radiomatic150trflowscincillatoranalyzer,perkinelmer)检测仪组成。流动相由含有250mmnacl的50mm磷酸钠(ph7.0)制成。使用0.8ml/min的流速。

放射性标记的抗体的纯化

使用离心浓缩器和纯化或脱盐柱进行纯化。当使用离心浓缩器时，将反应混合物装载至浓缩器旋转管(vivaspin4,50kdamwco,sartoriusstedimbiotech,germany)中并用0.9％的nacl稀释直至总容积为4ml。通过离心将内容物浓缩10倍。收集浓缩液(c)并立即测量(t＝0)。测量纯化过程产量(y)作为浓缩液中与²¹²pb结合的抗体活性的百分比：

装载至离心浓缩器的总活度(t)由在反应混合物被密封纯化之前从反应混合物中取出的样品测定。在首次测量之后至少3天(t＝eq)，此时²²⁴ra和²¹²pb已达到平衡，再次测量所有的样品并计算保持在浓缩液中的²²⁴ra的百分比：

在可替代的纯化方法中，使用评估了的sephadexg-25pd-10柱(gehealthcarebio-sciencesab,uppsala,sweden)用于从未结合的放射性核素分离放射性标记的tcmc-曲妥珠单抗。在用于纯化目的之前用至少20ml的补充有0.5％牛血清白蛋白的dulbeccopbs洗涤柱。用pd-10纯化粗反应混合物和加有制剂缓冲液的反应混合物。使反应混合物与制剂缓冲液反应至少10分钟以允许edta在施用前与未结合的放射性同位素形成络合物。

当用pd-10柱用于纯化时，将样品装载至柱的顶部并允许其在加入更多的洗脱缓冲液之前完全进入柱床。持续洗脱过程直至eppendorf管中收集了每1ml1馏分的至少7馏分。立即测量所有馏分中的活度。通常在馏分3-5(f3-f5)中洗脱放射性标记的抗体。用tlc分析证实了这一点。用这些馏分中的与抗体结合的²¹²pb活度与施用的总²¹²pb活度的百分比预估该方法的产率：

装载至pd-10柱的总施用的²¹²pb活度(t)由密封的参考样品测定，所述参考样品由纯化前取出的反应混合物的等份试样制备。通过前述itlc方法测定馏分4中的产物的rcp。在至少3天后，再次测量样品并计算保留在馏分3-5中的²²⁴ra的百分比：

为了评估放射性核素与蛋白质馏分的共同洗脱液，进行了一个实验，其中如前述地进行放射性标记和pd-10纯化，但是使用未共轭的曲妥珠单抗代替tcmc-共轭的曲妥珠单抗。通过在60-110和520-640kev窗口中的测量值确定在7个收集的馏分中²¹²pb和²¹²bi的存在。通过测量在pd-10纯化结束后5分钟、20分钟、1小时、1天和5天的样品，也可以测量衰变率。这对于确定520-640kev窗口中的γ活度是否反映除了²⁰⁸tl之外还有²¹²bi的存在是有必要的。从第5天的测量值中，此时所有的样品已到达平衡，测定²²⁴ra的量。

通过tcmc-螯合剂保留发射α的²¹²pb子体²¹²bi

在平衡的²²⁴ra溶液中，²¹²bi活性和²¹²pb活性的比率约等1。将密封的与子代平衡的²²⁴ra样品用作测定60-110和520-640kev窗口的效率因子(bq/cpm)的参考。在用edta淬灭反应混合物的pd-10纯化后，测量纯化结束后的10分钟、20分钟、60分钟和22小时的馏分4。使用效率因子预估不同时间点的²¹²bi和²¹²pb的比率。使用在线通用衰减计算器(http://www.wise-uranium.org/rcc.html)基于不同的初始²¹²bi和²¹²pb比率从a样品中没有任何范围²¹²bi的纯²¹²pb至a样品中活度比率为1，作为时间函数测量理论²¹²bi和²¹²pb的比率。假设纯化后馏分4中的所有活度直接与抗体共轭物结合，可以通过比较实验测定的比率和²¹²bi和²¹²pb比率的不同理论值的向内生长曲线来推断保留在tcmc-螯合剂中的²¹²bi部分的估计值。

结果和讨论

在与子体核素平衡的²²⁴ra溶液中用²¹²pb放射性标记tcmc-曲妥珠单抗是成功的。该方法产出的具有rcp的产物在0.15mg/ml的抗体共轭物下已经超过90％，在1mg/ml和更高浓度下超过95％。在三个标记实验中，测定了产物的免疫反应活性馏分，其范围为57-66％，这与先前发布的²¹²pb-tcmc-曲妥珠单抗的免疫反应活性结果是一致的。

由于标记是在与子代平衡的²²⁴ra溶液中进行的，在孵育期间会存在²¹²bi。因此，在到达长期平衡之后，还在²⁰⁸tl窗口中测量rcp以计算²¹²bi。该结果反应在值中为50-80。在4mg/ml的tcmc-曲妥珠单抗浓度下，发现²¹²pb在反应5分钟后已经被定量络合，并且超过80％的²¹²bi也被络合。

在一系列抗体浓度下²¹²pb的成功标记证明可以实现放射性免疫共轭物的各种不同的特异性活度。

由于该研究主要用于示出概念验证，因此与预期用于临床设定相比，使用较低的活度水平。因此在相对小的容积中进行放射性标记，通常在30-130μl，以模拟相关的临床活度浓度。由于使用低容积，因此尽管使用了低活度，但是在终端产物中有可能获得相对较高的特异性活度。在本研究中获得的最高的²¹²pb-tcmc-曲妥珠单抗的特异性活度约为30mbq/mg，这与用于用²¹²pb-tcmc-曲妥珠单抗的近期临床研究中的活度相差无几。

在²²⁴ra完全衰变后，形成了稳定的²⁰⁸pb，这可以在与tcmc螯合剂共轭方面与²¹²pb竞争。通过这里使用的活度水平，由于其有可能实现相对较高的特异性活度，没有迹象表明²⁰⁸pb会影响放射性标记的产率。但是当使用更多的²²⁴ra并且进行以下估计时情况也许会不同：假设在100mbq²²⁴ra溶液中标记了1mg抗体。这相当于4×10¹⁵个分子，鉴于8-20×10¹⁵个可用的铅结合位点，我们可以假设每个抗体有2-5个tcmc螯合剂。100mbq²²⁴ra的完全衰变将形成大约4.5×10¹³²⁰⁸pb个原子。这些数字表明²⁰⁸pb的存在不会在很大程度上影响放射性标记的产量。

本研究中描述的方法的所需最终产物是纯²¹²pb标记的tcmc抗体溶液。为了获得所述的所需的最终产物，纯化具有²¹²pb标记的抗体共轭物溶液以去除²²⁴ra和其他未共轭的子代核素。评估了两个不同的方法；通过离心浓缩的纯化和用脱盐柱的纯化。两种方法均根据基于尺寸的从诸如游离离子、未结合的螯合剂分子和盐等低分子量化合物中分离抗体共轭物。

使用离心浓缩器将²¹²pb-tcmc-曲妥珠单抗从阳离子²²⁴ra和其他未共轭的子体核素中分离，阳离子²²⁴ra和其他未共轭的子体核素在浓缩液中产生70.5±9.6％(n＝6)的与抗体结合的²¹²pb活度。由于该方法，²¹²pb标记的曲妥珠单抗丢失约三分之一是明显的，但是仍然与在pd-10柱纯化之后报道的²¹²pb-tcmc-曲妥珠单抗的产量(73±3％)相符。保留在浓缩液中的²²⁴ra的量为25.9±13.1％(n＝6)，即从放射性免疫共轭物中²²⁴ra的分离只完成了75％。²¹²pb-tcmc-曲妥珠单抗和²²⁴ra的比率仅从1：1升高至约3：1，这对于用于生物医学的²¹²pb标记的放射性免疫共轭物来说不是一个令人满意的结果。而且我们还观察到当施用更大量的抗体共轭物时，在纯化之后保留在浓缩液中的²²⁴ra的百分比略微趋向更高。这个观察结果也许表明膜被蛋白质饱和或堵塞，这降低了离子穿过膜的过滤效率。

当使用pd-10凝胶过滤柱时，²¹²pb-tcmc-曲妥珠单抗从²²⁴ra和其他未共轭的子体核素中的分离更加成功。使用类似pd-10的凝胶过滤柱对于纯化放射性标记的抗体来说是普遍的，并且允许诸如未共轭的放射性核素等低分子量的物质从含有抗体的溶液中快速去除。²¹²pb-曲妥珠单抗的回收是非常有利，其馏分3-5中产出约80％，不受用edta淬灭反应混合物的影响。表3还表明大多数(70％)的蛋白质共轭物从3-4ml(馏分4)中洗脱。这与baidoo等人报道的从2.5-4.2ml(1.7ml)中收集的pd-10洗脱液中的73％的产量是一致的。具有保留在馏分3-5中的少于4％的²²⁴ra，对于从含有²¹²pb-tcmc-曲妥珠单抗的溶液中去除²²⁴ra是相当有效的，并且当使用edta淬灭反应混合物时，倾向于更有效的分离。在一些实验中可以观察到²²⁴ra在4.5ml后开始洗脱，并且为了使²²⁴ra的量最小化，其决定从分析中排除馏分5。在使用edta的情况下，²²⁴ra的突破可降至0.9±0.8％，在不使用edta的情况下，²²⁴ra的突破可降至2.7±3.6％，但是其代价是²¹²pb-tcmc-曲妥珠单抗的产量略微减少约5％，分别减少至76.7±11.7％和76.1±5.9％。与纯化之前相比，itlc分析馏分4增加了²¹²pb-曲妥珠单抗的rcp，平均为98±1％(n＝8)。所有结果表明使用pd-10纯化的从²²⁴ra/²¹²pb混合物制备的²¹²pb-曲妥珠单抗是可行的。

为了检测²²⁴ra溶液中的任何放射性核素是否与曲妥珠单抗非特异性结合从而与蛋白质馏分的共同洗脱，进行了一个实验，其中除了将tcmc-曲妥珠单抗替换为曲妥珠单抗，其他如通常所做的进行放射性标记方案和pd-10纯化。在完成pd-10的纯化之后通过在不同的时间点测量七个收集的馏分来评估²¹²bi、²¹²pb和²²⁴ra的存在。分别在60-110和520-640kev窗口检测总活度的百分比。在不存在edta时的馏分4和5中，显著量(32％)的²¹²bi与抗体共同洗脱。从衰变率可以看出，在该窗口(520-640kev)中测量的活度明显源自²¹²bi的²⁰⁸ti的向内生长，因为²⁰⁸ti随着母体²¹²bi的半衰期而衰减。

当使用edta淬灭反应混合物时，在相同馏分中的²¹²bi的共洗脱减少至1.3％。当edta存在时，²¹²pb的共洗脱在馏分3和4的pd-10洗脱液中是不明显的，而在馏分5中低于2％。当不存在edta时，在馏分3-5中与抗体共洗脱的总²¹²pb活度为约5％。从第5天的测量值可以观察到，在两种情况下，²²⁴ra的共洗脱可忽略不计(小于0.7％)。同时，结果清晰表明在pd-10柱上纯化之前使用edta淬灭反应混合物，当使用²²⁴ra溶液用于制备基于²¹²pb的放射性免疫共轭物时可以最大化产物的纯度。该措施去除了抗体馏分中非特异性结合的²¹²bi和²¹²pb，同时使较少的²²⁴ra保留在最终产物中。

了解当与tcmc螯合的²¹²pb衰变时形成的²¹²bi的命运是有益的。为了避免游离²¹²bi引起的放射毒性，期望在衰变时通过tcmc-螯合剂保留大部分²¹²bi。mizadeh和其同事发现当²¹²pb衰变时，36％的²¹²bi从dota螯合剂中释放，并且他们宣称络合物的分裂是由于激发的²¹²bi核素发射的γ射线的内部转换。我们没有发现当²¹²pb衰变时通过tcmc螯合剂保留²¹²bi的相应检验，因此根据我们的数据进行了估计。我们测定了在纯化结束后的不同时间点的馏分4中的pd-10纯化的产物的²¹²bi和²¹²pb的比率。根据²¹²bi存在的原始量，²¹²bi/²¹²pb的比率在其达到核素处于瞬态平衡的最大稳定水平之前会不同程度的增加。假设馏分4中的所有活度在纯化后直接与抗体共轭物结合，并考虑到从最终纯化到测量时间期间²¹²pb内²¹²bi的内生长，估计²¹²pb衰变后与tcmc螯合剂相关的²¹²bi至少为60％。我们发现该值与先前提到的通过dota螯合剂保留的关于²¹²bi的值非常一致。据称，tcmc-螯合剂的四个n-供体和四个o-供体原子将提供与铋的良好结合能力，因此在tcmc螯合剂中相对高的²¹²bi保留不是不可能的。

当前研究表明tcmc共轭的单隆抗体可以在与子代平衡的²²⁴ra溶液中有效地用²¹²pb标记。当使用浓度4mg/ml的tcmc-曲妥珠单抗时，用²¹²pb标记将在短至5分钟后定量。在该浓度下，还观察到²¹²bi的主要部分将会被抗体共轭物螯合。随后，可以使用脱盐凝胶排阻分离法将²¹²pb标记的共轭物从阳离子²²⁴ra中分离。与当前的基于离子交换的发生器相反，基于离子交换的发生器可能被洗脱几次(超过2周的时间)，本文所描述的液态²¹²pb发生器被设计用于仅制备单剂量。

通过我们提出的方法，可以从集中供应商将即用型²²⁴ra溶液运输至终端用户。从逻辑的角度来看这是有利的，并且由于减少和简化了最终用户所需的工作。我们相信，使用我们的方法是有利的，在医院或放射性药物环境中可以完全避免涉及处理和蒸发具有高放射性水平的浓酸溶液的步骤。省略酸分解步骤的另一好处是医院的总制备时间将缩短，因为其实际只需进行抗体标记和纯化。baidoo等人报道这一部分过程仅需要80分钟的总制备时间，可注射剂量约为210分钟。更短的制备时间减少了衰变引起的活度丢失，因此施给患者更大量的²¹²pb。这有助于限制注射时产品中游离子代核素的量以及使抗体辐射分解可能出现问题的风险最小化。

在评估我们提出的放射性标记抗体的方法方面，解决辐射安全要求也是重要的。与涉及α发射放射性核素的开放源的所有程序一样，必须采取预防措施以避免吸入或摄入。因此所有处理应在生物安全工作台中或在负压手套式操作箱中进行以保护工作者。这在处理²²⁴ra系列时尤其重要，因为²²⁰rn是子代之一。工作空间也需要适当地隔离。²²⁴ra子代之一²⁰⁸tl具有高能量γ射线，2.6mev和36％的丰度，基于此可以确定隔离所需的厚度。baidoo等人已描述了²²⁴ra的活度上升至740mbq的合适隔离为约15cm的铅。当使用15cm的铅时，距离具有与子代平衡的活度的²²⁴ra点源30cm处的剂量率将会从约1600减少至3μsv/h。由于我们在此介绍的²¹²pb发生器溶液用于制备单个患者剂量，因此我们不认为超过baidoo等人所描述的那样是合理的。通过我们的方法，即使²²⁴ra直到纯化也是存在的，这与根据baidoo等人介绍的方法进行工作时仅在柱上存在相反，也不会改变隔离要求，因为在该系列中99％的γ活度源自²¹²pb和子代，以及特别地前述提到的来自²⁰⁸tl的γ射线能。通过baidoo等人描述的方法中包括的蒸发步骤应当在手套箱中或一些封闭的系统中进行，其会收集蒸气以使产生空气传播的放射性活度污染物的风险最小，因此需要专用装置用于此过程。在我们所提出的方法中不需要这种装置。

如先前在讨论中所提及的，当使用更高的临床相关活度的²²⁴ra溶液时，执行当前研究会产生较低的活度水平和辐射分解问题。在放射性标记反应中使用与²¹²pb平衡的²²⁴ra而不是纯²¹²pb的潜在缺点是α粒子活度的增加会导致反应溶液的辐射剂量增加。在放射性标记过程中，抗体共轭物的辐射暴露可能是最高的。此时，²²⁴ra和所有子代将对剂量作出贡献，而在纯化后将主要从²¹²pb和子体递送剂量。来自²²⁴ra和子代的总衰变能量(不包括光子)为27.8mev，而²¹²pb和子体的衰变释放仅为8.8mev。为了将抗体暴露在更高辐射剂量下，在30分钟的孵化后，我们继续将²¹²pb标记的tcmc-曲妥珠单抗储存在处于平衡状态下的²²⁴ra溶液中直到得到约700gy的剂量。用尺寸排阻hplc分析显示包括96％总放射活度的峰值在某一时间与完整tcmc-曲妥珠单抗相符，并且与高分子量化合物和低分子量化合物的相关性分别低于1.3％和2.9％。将暴露于700gy的²¹²pb-tcmc-曲妥珠单抗与未标记的tcmc-曲妥珠单抗进行比较，并在280nm处进行吸收检测。结果显示分子量化合物的峰值在分析放射性标记的抗体时低于igg。该峰值约为11％，未发现未被标记的tcmc-曲妥珠单抗，因此可能由于蛋白质的辐射降解引起。在两个样品之间高分子物质的量是相似的(少于1.6％)。然而，对一部分抗体的明显放射性损伤似乎不影响产物的免疫反应活性馏分。将两个样品²¹²pb-标记的tcmc-曲妥珠单抗暴露于100和700gy下，用pd-10柱纯化，所测定的馏分4的免疫反应活性分别为60％和57％，在两个方案中非特异性结合均是低(少于3％)的。这与文献的结果相符，所述文献的结果为在不显著降低抗体的细胞结合馏分的情况下，暴露在高达1000gy的环境下是可以接受的。

总之，在较高辐射剂量下检查可能的放射性效果表明抗体的辐射剂量应保持在700gy以下。在腹膜内给予²¹²pb-tcmc-曲妥珠单抗的i期研究中，患者接受的最高剂量为27.4mbq/m²。通过使用在成人癌症患者的研究中发现的平均体表面积1.79m²，该剂量相当于每位患者49mbq。由于其相当于i期试验中施加给患者的²¹²pb-tcmc-曲妥珠单抗的最高剂量的大致2倍，为了制备具有该活度的患者剂量，假设100mbq的²²⁴ra活度是足够的是合理的。在用1.5ml反应容积中用100mbq的²²⁴ra标记30分钟(这与pd-10凝胶排阻纯化形式相匹配)期间抗体溶液的辐射剂量估计为534gy。基于这些计算，可以预测本文所述的方法在使用高活度水平的临床环境中也是有用的。

²¹²pb对²²⁴ra的纯度是²¹²pb标记的放射性免疫共轭物的重要质量参数。对于本文提出的原位标记的方法是现有方案的可行替代方法，必须仔细考虑以限定在最终产品中²²⁴ra的可接受限度。幸运的是，已经在动物和人中广泛研究了²²⁴ra，并且毒性特征被人们所熟知。与其他镭同位素一样，静脉注射之后，²²⁴ra主要沉积在骨骼中。由于其具有天然的寻骨性能，在20世纪40年代已经作为强直性脊柱炎的姑息治疗而被引入。它已经被使用了几十年(直到1990年)，然后在2000-2005年被不同的制造商重新引入，显示了相同的迹象。根据国际放射防护委员会提出的模型进行的剂量计算表明，静脉注射²²⁴ra-二氯化物之后在骨表面和红骨髓上的吸收剂量最高，自从引入以来每周1mbq的注射，最多总共十次注射已经被用作成人患者的治疗方案。包括约1000名接受该剂量的患者报告显示，可以施用这样量的²²⁴ra-二氯化物而没有相当大的骨髓毒性。这些历史数据表明，只要²¹²pb产品本身不产生高度的骨髓毒性，每剂量1mbq的²²⁴ra或累积的总10mbq在成人患者中是可以接受的。

在腹膜内施用²¹²pb-tcmc-曲妥珠单抗的i期研究中，没有发现显著的骨髓抑制。从本文得到的结果来看，当使用edta在pd-10纯化前淬灭反应混合物时，在最终产品中剩下的²²⁴ra量可以保持在1％以下。这相当于向给予了50mbq的基于²¹²pb的产品的患者施加0.5mbq的²²⁴ra。约49mbq的患者剂量为先前提到的i期实验中施用的²¹²pb-tcmc-曲妥珠单抗(27.4mbq/m²)的最高剂量。总之，这些估计值表明在假设每剂量的1mbq²²⁴ra是可接受量的情况下，在由²²⁴ra溶液制备的²¹²pb标记的放射性免疫共轭物的最终产品中可以获得足够的²¹²pb对²²⁴ra的纯度。

结论

当前工作证明了用²²⁴ra溶液作为可运输的发生器以用于制造基于²¹²pb的放射性免疫共轭物是便利的。²¹²pb标记的共轭物的制造与当前基于离子交换的方法相比，对于终端使用者来说所花费的时间更少并更容易使用。