用于猪的组合疫苗的制作方法

当代集约化养猪业严重依赖兽医医疗产品来保持动物健康，并允许经济运作。除了优化饲料和农场管理系统之外，还定期使用各种治疗方法：药物(例如激素或抗生素)，以及针对细菌或病毒病原体的疫苗接种。从幼年开始影响猪的一些最突出的疾病由细菌引起：如猪肺炎支原体(mycoplasmahyopneumoniae)和胞内劳森氏菌(lawsoniaintracellularis)；并且由病毒引起，如2型猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒。猪肺炎支原体(mhyo)是引起在全世界发生的猪慢性呼吸道疾病，(猪)地方流行性肺炎的主要原因。特别是年轻的仔猪易于受到这种高度传染性疾病的影响。这种细菌相对小，缺少细胞壁，并且属于柔膜菌纲(mollicute)。这些细菌在宿主细胞上或宿主细胞中以寄生生活方式存活。源于mhyo的肺部疾病大部分是免疫介导的病理，导致实变肺炎(consolidatedpneumonia)。细菌定植并损伤肺纤毛上皮，导致纤毛活性丧失。根据圈养条件以及环境压力，此疾病的问题最大的后果是，使得易受其它细菌和病毒病原体对猪呼吸系统的不同继发性感染。这产生了所谓的：猪呼吸道疾病综合征(prdc)，显示出严重的肺部病变。除了动物的不适之外，由于生长速率和饲料转化率的表现降低以及兽医护理和抗生素使用的成本，地方流行性肺炎和prdc对养猪业造成重大的经济损失。胞内劳森氏菌(劳森氏菌)引起增生性肠病，也称为回肠炎，这是全世界断奶后猪的常见肠道疾病。特征性病变是回肠肠隐窝中的未成熟肠细胞的增殖，这种细胞含有致病细菌。从肠细胞中清除细菌导致相关增殖性病变的消退。通过在肠细胞中，但也在肠巨噬细胞中的1.5-2.5µm长的弧菌状细菌的可视化，可以证实组织学病变为劳森氏菌阳性的。可以在临床或亚临床病例中通过pcr检测细菌。临床病例经常存在于生长-育成(grower-finisher)阶段。劳森氏菌属细菌在1995年首次描述(mcorist等人，int.j.syst.bact.,vol.45,p.820-825)。它们是来自脱硫弧菌(desulfovibrionaceae)科的专性细胞内和非运动性革兰氏阴性杆菌。2型猪圆环病毒(pcv2)与在幼猪中观察到的断奶后多系统衰竭综合征(pmws)有关。临床症状和病理学发表于1996年，且包括进行性消瘦，呼吸困难，呼吸急促，和偶发的黄疸(icterus)和黄疸病(jaundice)。因为与作为pk-15细胞的天然污染物的已知pcv不同，新的病原体被称为pcv2。pcv2是圆环病毒属(circovirus)的非常小的无包膜病毒。它包含具有两个主要基因的环状单链dna基因组。orf2基因编码约233个氨基酸的病毒衣壳蛋白。重组表达的pcv2orf2蛋白形成病毒样颗粒，其作为亚单位疫苗非常有效。猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)在1987年首次报道，并在1990年代早期已广为流行。它是动脉炎病毒(arterivirus)属的小的包膜rna病毒，其含有单链正义rna基因组。由于生殖障碍和生长迟缓，这种病毒在养猪业中造成重大损失。如同mhyo，prrsv在多因素prdc中发挥重要作用。临床症状是流产和死胎或木乃伊胎儿，以及耳和外阴的紫绀。在新生猪中，病毒引起呼吸窘迫，以及对继发性呼吸道感染，例如格拉泽氏病(由副猪嗜血杆菌引起)的易感性增加。然而，亚临床感染也很常见。病毒非常易变：除了欧洲变种(1型)和北美变种(2型)之外，现在有第三种基因型：2000年在中国出现的高致病性变种，并且现在在亚洲引起猪中的严重疾病。存在针对这些病原体中的每一种的商业疫苗：针对mhyo，存在各种商业疫苗，并且这些疫苗通常用于大多数商业猪养殖操作中。通常，这些疫苗包含非复制型免疫原，例如亚单位蛋白和/或菌苗(即，完整或不完整的灭活细菌)，其通常通过肠胃外注射施用。一些实例是：respisure™(zoetis)、ingelvac™m.hyo(boehringeringelheim)，和m+pac™(merckanimalhealth)。针对劳森氏菌的疫苗是可商购的，例如enterisol™ileitis(boehringeringelheimvetmedica,usa)，其是减毒活疫苗，和porcilis™ileitis(merckanimalhealth,usa)，其是佐剂化的菌苗。针对pcv2感染的疫苗可以基于完全灭活的pcv2病毒，例如circovac™(merial)，或灭活的嵌合pcv1/pcv2病毒(suvaxyn™pcv,zoetis)。更常见的是重组表达的pcv2orf2蛋白的亚单位疫苗，例如来自基于杆状病毒-昆虫细胞的表达系统。实例是：porcilis™pcv(msdanimalhealth)和ingelvaccircoflex™(boehringeringelheim)。已经描述了基于灭活病毒的针对prrsv的疫苗，并且可商购获得。然而，基于减毒活病毒的疫苗被认为更有效。实例是：porcilis™prrs(msdanimalhealth)、ingelvacprrs™mlv(boehringeringelheim)，和fostera™prrs(zoetis)。为了限制对动物的压力以及护理者的成本和劳动力，已经将一些猪疫苗作为组合疫苗制备。实例是：fostera™pcvmh(zoetis)和porcilispcvmhyo(msdanimalhealth)，其组合来自pcv2和mhyo的抗原。专利申请wo2013/152086(zoetis)描述了用于猪的三价组合疫苗，其将来自pcv2和mhyo的抗原与活prrsv组合，然而，所述疫苗不可商购。因此，本领域对于针对相关的猪疾病的有效的猪用组合疫苗存在兴趣。包含非复制抗原的疫苗的重要组分是佐剂。这为非复制抗原提供免疫刺激，否则非复制抗原将不具有免疫原性。这将触发不同的免疫系统途径，基本机制尚未充分理解。在兽医疫苗中，可以使用多种化合物作为佐剂，例如：矿物油，例如bayol™或markol™，montanide™或石蜡油；非矿物油，如角鲨烯，角鲨烷或植物油，如油酸乙酯；铝盐，例如氢氧化铝，或磷酸铝；肽，例如二甲基甘氨酸或吞噬刺激素(tuftsin)；细菌细胞壁组分，如脂质a和胞壁酰二肽；(合成的)聚合物，如普朗尼克类(pluronics)，右旋糖酐(dextranes)，卡波姆(carbomeres)，吡喃或皂苷；细胞因子；和toll样受体的刺激物，如含有非甲基化cpg基团的免疫刺激性寡脱氧核苷酸；等等。制备佐剂化组合疫苗中要克服的主要问题是防止各种疫苗组分之间的相互作用，所述相互作用会对免疫响应或疫苗的安全性或稳定性产生负面影响。这种相互作用可以例如在抗原本身之间发生，例如因为一些是相当粗糙的产物，例如mhyo和劳森氏菌的菌苗。此外，佐剂可能干扰或甚至破坏疫苗抗原。当组合包含活微生物时，这种不利的相互作用是特别相关的。提供销售许可的登记机构也认识到这一点，例如：usda执行法规9cfr113.35，用于检测包含活病毒的灭活疫苗中的杀病毒活性。通常认识到复杂组合疫苗开发中的这些潜在问题；例如，参见emea的出版物："noteforguidance:requirementsforcombinedveterinaryproducts"(emea,2000,cvmp/iwp/52/97-final)；和1997年4月美国departmentofhealthandhumanservices,foodanddrugadministration,centerforbiologiesevaluationandresearch的出版物"guidanceforindustry,fortheevaluationofcombinationvaccinesforpreventablediseases:production,testingandclinicalstudies",案卷编号97n-0029。这两份出版物都发出了关于当结合抗原和佐剂时，对疫苗的功效和安全性的干扰作用的警告。因此，难以开发组合疫苗，其诱导针对非复制抗原和复制微生物的组合的有效免疫响应，特别是对于涉及多种病原体的复杂组合的有效免疫响应。此外，联合疫苗在动物使用时应该是安全的，即不产生显著的副反应，如发热，局部肿胀，食欲不振等。更实用的性质也是相关的：联合疫苗理想地应该能够经济生产，在配制和储存期间足够稳定，并且在其他抗原存在下，允许对每种抗原的效力测试方法。因此，本发明的目的是通过提供有效且安全的针对与pcv2和prrsv感染相关疾病的猪用组合疫苗，来克服现有技术中的一个或多个缺点，并适应本领域中的需求。遗憾的是，在现有佐剂制剂中直接组合pcv2的非复制抗原和活prrs病毒并不成功。例如：用于几种其他猪疫苗的佐剂制剂是xsolve™(以前称作：microsol-diluvacforte™；msdanimalhealth)。它含有佐剂轻质矿物油和维生素e-乙酸酯与乳化剂tween™80的组合。它用于例如：porcilispcv(包含pcv2orf2抗原)、porcilisileitis(包含劳森氏菌菌苗)，和circumventpcv-mg2(包含pcv2和mhyo抗原)。然而，来自mhyo，劳森氏菌和pcv2的非复制抗原与活prrsv在xsolve中的组合疫苗并不总是有效的。这主要是因为对活prrsv组分的杀病毒作用。此外，如同其他含有矿物油的佐剂，xsolve诱导相对较强的疫苗接种反应。虽然这些都在可接受的限度之内，但改进是期望的。类似地，这4种抗原在称为amphigen™(zoetis)的佐剂中的组合也显示出对prrsv的杀病毒作用。amphigen包含作为佐剂的矿物油和作为乳化剂的卵磷脂。此外，佐剂emunade(矿物油+氢氧化铝)对于活prrsv是杀病毒的。据称，wo2013/152086('086)中描述的佐剂制剂之一对于活prrsv没有显著的杀病毒作用：10％稀释的称为“sp油”的制剂。所述佐剂可作为metastim™商购获得。遗憾的是，被测试的制剂的确切组成没有公开，但sp油的优选组成范围给出在'086的跨第24-25页的段落中。因此，在疫苗中使用10％稀释的这种sp油意味着测试的疫苗包含：0.1-0.3%v/vpluronic™，0.3-0.6%v/v角鲨烷和0.01-0.05%v/vtween80。'086还推荐了许多其他‘合适的’佐剂('086，第25页，第7-15行)，其中有amphigen和xsolve。然而在实践中，证明这些并不合适；一些也体现于'086的图10中。另一种已知的疫苗佐剂是as03™(gsk)，其含有2.1％w/v角鲨烯和2.4％w/v维生素e，和作为乳化剂的1.0％w/v吐温80。然而，这种佐剂描述为用于人类应用，并且用于来自单一病原体物种的抗原，主要是灭活的人流感病毒。此外，as03的使用在科学上与过敏反应的风险增加，以及自身免疫疾病的诱导相关联。进一步地，虽然单价porcilis™mhyo疫苗配制在维生素e-乙酸盐的水溶液(solubilisate)中，然而，当与pcv2抗原组合时，发现完全不同的佐剂和制剂是最佳的：二价组合疫苗porcilispcvmhyo使用emunade™佐剂，其为矿物油和氢氧化铝的混合物，并且需要将抗原以特殊方式组合，如wo2016/091998中所述。prosystem™系列疫苗(merckanimalhealth)是一系列猪疫苗，其含有来自各种细菌物种的多种非复制抗原。这些疫苗是含水制剂，使用氢氧化铝凝胶佐剂。它们被许可用于重新悬浮具有减毒活病毒(例如传染性胃肠炎病毒和轮状病毒)的猪用冻干疫苗。关于所使用的制剂和佐剂，三价组合疫苗3flex™(boehringeringelheim)同样是不同的。它作为3个独立的小瓶销售，其中具有与活prrsv组合的来自mhyo和pcv2的非复制抗原。将它们在现场混合，以形成具有被称作impranflex™佐剂的含水组合物，所述佐剂含有卡波普。在这些过多的选项中，本发明人没有得到指示表明将使用哪种类型的制剂和哪种类型的佐剂用于开发安全和稳定，并且有效对抗与pcv2和prrsv感染相关疾病的组合疫苗。令人惊讶地发现，通过提供猪用组合疫苗，可以满足这个目的，并因此可以克服现有技术的一个或多个缺点，所述组合疫苗包含来自pcv2的非复制抗原和活prrsv，由此将所述疫苗配制为水包油乳液，并且使用角鲨烷和维生素e乙酸酯佐剂。发现这种类型和组成的组合疫苗对于活prrsv是非杀病毒的，并且有效地保护猪抵御pcv2和prrsv的感染。疫苗对目标动物也是安全的，可以经济地生产，在配制和储存时是稳定的，并且允许对最终疫苗中的所有抗原进行效力测试。尚不确切知晓这种特定制剂和这种特定的佐剂选择对于这种抗原组合如此有利的原因。尽管本发明人不希望受任何可能解释这些发现的理论或模型的约束，但本发明人推测角鲨烷和维生素e-乙酸酯在水包油配方中的特定组合可提供来自这些抗原的恰当水平的免疫刺激，从而对其相关疾病是有效的。这不引起显著的疫苗接种副反应，并且显然保护活prrsv免受佐剂和其他抗原的显著杀病毒作用这从现有技术中完全不明显，因为没有包含这些抗原的其他组合疫苗。还证实对于其他猪组合疫苗描述的一些佐剂对这个特定组合不是有用的。因此，一方面，本发明涉及包含来自2型猪圆环病毒(pcv2)的非复制抗原和活的猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)的组合疫苗，其特征在于所述疫苗是包含角鲨烷和维生素e乙酸酯的水包油乳液。“组合疫苗”是包含来自多于单一微生物物种的抗原的疫苗。众所周知，“疫苗”是具有医学作用的组合物。疫苗包含免疫活性组分和药学上可接受的载体。“免疫活性组分”是一种或多种抗原分子，在本文中是：来自pcv2的非复制抗原和活prrsv。这些被靶标猪的免疫系统识别，并诱导保护性免疫响应。所述响应可起源于靶标的先天和/或获得性免疫系统，并且可以是细胞-和/或体液类型。疫苗通常有效降低感染的严重性，例如通过减少病原体的数量，或缩短病原体在宿主动物中复制的持续时间。而且，或者可能作为其结果，疫苗通常有效地减少或改善可能由这种感染或复制，或由动物对该感染或复制的响应，而引起的疾病的(临床)症状。根据本发明的组合疫苗在靶标猪中诱导保护性免疫响应，其效果是预防或降低pcv2和prrsv感染的严重性。组合疫苗也预防或减少与这种感染或复制相关的一种或多种疾病体症。这转化为对经济参数的积极影响，例如：饲料转化，平均日增重，胴体品质，以及幼仔的大小和质量。根据本发明的组合疫苗的观察效果是：对于pcv2：减少血液和淋巴组织中的病毒载量；在育肥猪中：降低死亡率和体重损失；并且对于prrsv，对于育肥猪：减少具有坏死性间质性肺炎的呼吸道疾病，导致改善的生长和饲料转化。对于繁殖猪：减少跨胎盘病毒转移，并且改善繁殖障碍，例如：早产仔猪，死胎或木乃伊仔猪，以及存活仔猪的虚弱和断奶后呼吸道疾病。对于pcv2和prrsv的感染，可以通过血清学的方式检测作为病原体特异性抗体的血清水平增加(使用基于elisa的技术可容易地检测)的根据本发明的组合疫苗的免疫保护诱导，并因此检测其效力。根据本发明的组合疫苗也可俗称为“针对”pcv2和prrsv的疫苗；或称为pcv2和prrsv疫苗。根据本发明的组合疫苗的细节和优选方案将在下文中描述。用于本发明的“药学上可接受的载体”是高纯度等级的水性液体，并且优选是无菌的，例如：水，生理盐溶液或磷酸盐缓冲盐水溶液。载体可包含其他添加剂，例如稳定剂或防腐剂。如本文使用的术语"包含(comprising)"(以及变式诸如"comprise"、"comprises"、和"comprised")意在指由在使用该术语的正文部分、段落、权利要求等所覆盖或包括的，对于本发明可设想的，和以任何可能组合的所有要素，即使此类要素或组合并未明确叙述；并且不排除任何此类要素或组合。因此，任何此类正文部分、段落、权利要求等因此还可以涉及其中术语“包含(comprising)”(或其变式)被替换为术语例如“由……组成("consistof","consistingof")”、或“基本上由……组成(consistessentiallyof)”的一个或多个实施方案。“抗原”是指可在合适条件下诱导免疫响应的分子。抗原可以合成制备或源自生物来源，例如它们可以是微生物或其部分。“非复制”抗原涉及或多或少纯的分子，例如蛋白质，碳水化合物，脂质或核酸，或者是其复杂组合。当从微生物制备时，非复制抗原可以指完整但被杀死的(即非复制性)微生物，或者可以是其部分，例如提取物，级分，匀浆或超声处理物。非复制抗原也可以是基于核酸的或重组产物，例如表达载体或表达的蛋白质，或体外表达系统的产物。所有这些都是本领域中熟知的。对于本发明，prrsv是复制性的。“活prrsv”是指适合用作疫苗组分的活prrsv，即具有降低的致病性水平，也称为减毒的或改良活的。本发明的“减毒”定义为引起较低水平的损伤，和/或具有降低的感染率或复制率。所有都是与未改良的或“野生型”prrsv相比。prrsv的减毒可以在体外获得，例如通过实验动物或在细胞培养物中传代和选择，或通过重组dna技术，所有都是本领域熟知的。虽然将病毒称为“活的”在生物学上是不正确的，但这是提及未灭活病毒的常用方式。因此，对于本发明，涉及prrsv的术语“活的”是指能够在适当条件下复制的prrs病毒，例如在合适的宿主细胞或动物中。“2型猪圆环病毒”和“猪繁殖与呼吸综合征病毒”都是本领域中众所周知的病毒，属于其各自的属和科。这些诱导疾病，如众所周知的教科书中所述，例如："themerckveterinarymanual"(第10版，2010,c.m.kahn编辑，isbn:091191093x)，或“diseasesofswine”,第10版，zimmerman编辑，wiley-blackwell,ames,ia.,usa,isbn:081382267x。这些病原体的每一种都展示其分类群-成员的表征特征，如形态学、基因组学和生物化学特征，以及生物学特征，如生理学、免疫学、或病理学行为。如本领域所知的，微生物作为具体物种的分类基于这些特征的组合。因此，本发明还包括pcv2或prrsv，其以任何方式由此被亚分类为例如亚种、毒株、分离物、基因型、变体、亚型或亚组等。对于本领域技术人员显而易见的是，虽然本发明的特定pcv2或prrsv当前可以归属于特定物种，但是这是可以随时间改变的分类学分类，因为新的见解可以导致重新分类为新的或不同的分类群。然而，因为这不改变微生物本身，或其抗原谱(antigenicrepertoire)，而仅改变其科学名称或分类，所以这种重新分类的微生物仍然在本发明的范围内。用于本发明的pcv2和prrsv可以从多种来源获得，例如来自野外或农场的猪的田间分离物，或来自各种实验室，(保藏)机构或(兽医)大学。“水包油乳液”是众所周知的组合物，包含在外的水相，其含有内部分散的油相。通过选择适当种类和浓度的乳化剂，可以形成这种乳液。用于制备用作疫苗的水包油乳液的方法和设备在本领域中是众所周知的，并且例如描述在手册中，例如：“remington:thescienceandpracticeofpharmacy”(2000,lippincot,usa,isbn:683306472)，和“veterinaryvaccinology”(p.pastoret等人编辑，1997,elsevier,amsterdam,isbn0444819681)。对于本发明，在外的水相包含在药学上可接受的载体中的来自pcv2的非复制抗原和活的prrsv；油相包含作为佐剂的角鲨烷和维生素e-乙酸酯。发现在制备为水包油乳液时，本发明的组合疫苗非常有效，安全和稳定。制备用于根据本发明的组合疫苗的水包油乳液的实施方案和优选方案将在下文中描述。“角鲨烷”是指cas号为111-01-3的化学化合物。一些替代名称是：氢化鲨鱼肝油，六甲基二十四烷，或全氢化角鲨烯。不要将其与角鲨烯(cas号111-02-4)混淆，后者是一种多不饱和c30油，并且可作为胆固醇途径的化合物代谢。然而，角鲨烷是完全氢化形式的角鲨烯，并且因此不易氧化。因此，虽然角鲨烷是非矿物油，并且从注射部位运输，但它是不可代谢的。角鲨烷的前体最初从鲨鱼肝脏获得，但出于环境方面的顾虑，已转为其他天然来源，如橄榄油，或化学合成。因此，角鲨烷的定义中包括天然的，合成的或半合成形式，或其混合物。角鲨烷可以各种纯度商购，例如：来自植物来源，来自worlee(squalane,vegetable)，或croda(pripuresqualane)；或合成的，例如来自kuraray(squalane-pe)。对于本发明，高纯度的角鲨烷是优选的：优选超过75％的纯度，更优选超过80％，90％，或甚至超过95％的纯度，按该优选顺序。“维生素e-乙酸酯”是指cas号为58-95-7的化学化合物。一些替代名称是：生育酚乙酸酯或α-生育酚-乙酸酯。维生素e-乙酸酯是维生素e(生育酚)的乙酸酯，并且可以源自植物材料，诸如种子，坚果，水果或叶子，或来自肥肉，但也可以合成生产。因此，维生素e-乙酸酯的定义中包括天然的，合成的或半合成的形式，或其混合物。维生素e-乙酸酯可以以不同的纯度商购。对于本发明，pcv2的非复制抗原优选为：orf2蛋白。根据本发明的组合疫苗中的每种抗原可以是单一类型，或者可以是多种类型，例如来自相应病原体的一种或多于一种的菌株。根据本发明的组合疫苗中的角鲨烷存在的量为疫苗的约1％至约9％w/v。更优选地，角鲨烷以疫苗的2-7％w/v，或甚至2-5％w/v的量存在，按该优选顺序。最优选地，角鲨烷以疫苗的约3.4％w/v的量存在。因此，在根据本发明的组合疫苗的一个实施方案中，所述疫苗包含约1%至约9％w/v之间的量的角鲨烷。对于本发明，“约”表示数字可以在其所示值附近的±25%之间变化。优选地，“约”是指其值附近±20%，更优选“约”是指其值附近±15、12、10、8、6、5、4、3、2%，或甚至“约”是指其值附近±1%，按该优选顺序。根据本发明的组合疫苗中的维生素e-乙酸酯以疫苗的约1％至约10％w/v的量存在。更优选地，维生素e-乙酸酯以疫苗的2-8％w/v，或甚至3-5％w/v的量存在，按该优选顺序。最优选地，维生素e-乙酸酯以疫苗的约4％w/v的量存在。因此，在根据本发明的组合疫苗的一个实施方案中，所述疫苗包含约1%至约10％w/v之间的量的维生素e-乙酸酯。本发明人发现，在根据本发明的组合疫苗中，使用这些量的角鲨烷和维生素e-乙酸酯有利于针对病原体pcv2和prrsv中的每一种的免疫响应的佐剂作用，并提供稳定性。然而，令人惊讶的是，当施用于靶标猪时，这没有引起任何显著的疫苗接种副反应，也没有对活的prrsv产生任何显著的杀病毒作用。用于根据本发明的组合疫苗中的维生素e-乙酸酯优选为dl-α-生育酚-乙酸酯，其为cas号7695-91-2的化学品的外消旋物。在根据本发明的组合疫苗的一个实施方案中，抗原是：对于pcv2的非复制抗原：orf2蛋白从重组表达系统获得，或通过复制子颗粒递送和表达；复制子颗粒是由alphavax开发的缺陷型甲病毒颗粒。表达的orf2序列的亲本pcv2可以是pcv2血清型a，b，c或d的任一种，或者可以来自这些血清型中的一种或多种的嵌合体。对于prrsv：减毒活病毒来自一种或多种基因型，例如1型，2型和/或3型。更优选地，活的prrsv是来自dv株或nebraska株的减毒形式。在根据本发明的疫苗的一个实施方案中，药学上可接受的载体是水。优选地，水具有高纯度，例如双蒸水，微过滤或反渗透水。更优选地，水是注射用水，并且是无菌的且基本不含热原。基于水包油乳剂的疫苗的便利特征是抗原通常在水相中。这意味着可以单独地制备油相并在水中乳化，采用本身会与保持疫苗抗原的质量或活力不适应的方法和技术。例如，使用在高温下的高能乳化。这产生了用于本发明的油性乳液，其是角鲨烷，维生素e-乙酸酯和聚山梨醇酯80在水中的水包油乳液。为了制备根据本发明的组合疫苗，通过在室温下温和混合，将具有抗原的水相和具有佐剂的油性乳液组合。两个组合物的组合导致它们中的每一种的稀释。因此，每一种都需要制备成中间组合物，其中各种组分的浓度以等于将应用的稀释度的倍数高于最终疫苗中的浓度。通常，水相和油性乳液可以在10:90至90:10之间的任何体积比混合。根据本发明的组合疫苗优选包含约20:80和约80:20之间的体积比的水相和油性乳液，二者均如上所述。因此，在一个实施方案中，根据本发明的组合疫苗由约20:80和约80:20之间的体积比的水相和油性乳液的混合物制备。优选地，体积比在约30:70和约70:30之间；在约40:60和约60:40之间；或者甚至体积比为约50:50，按该优选顺序。显然，当水相和油性乳液的组合比为50:50时，则两个组合物中的每一种以比从所述两种中间组合物的组合制备的最终疫苗制剂中期望浓度高2倍的量或浓度包含其各种组分。在优选的实施方案中，本发明的油性乳液使用具有约8至约20之间的hlb值(亲水-亲油平衡)的乳化剂制备；优选的乳化剂是聚山梨醇酯80。聚山梨醇酯80是指cas号9005-65-6的化学品，又名为：聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯。它具有hlb值14，并且可广泛商购，例如作为吐温80。优选地，聚山梨醇酯80以疫苗的约0.1%至约5％w/v的量存在于根据本发明的组合疫苗中。更优选地，聚山梨醇酯80以疫苗的0.3-3％w/v，0.5-2.5％或甚至1-2％w/v的量存在。最优选地，聚山梨醇酯80以疫苗的约1.6％w/v的量存在。因此，在一个实施方案中，根据本发明的组合疫苗包含约0.1%至约5％w/v之间的量的聚山梨醇酯80。本发明的油性乳液可以任何规模并使用任何合适的均质设备制备，例如：silverson，ultraturrax™或dispax反应器(ika)。技术人员可以实施并优化这种乳化过程，以控制分散相(在此为油性佐剂)的颗粒大小。与乳化剂的类型和浓度的选择一起，这控制了乳液的药物性质以及其稳定性。乳化过程本身的主要参数是：能量输入(功率和rpm)、温度、持续时间和重复循环的次数。下文呈现了乳化过程的实施方案的细节。分散相的颗粒大小优选非常小。当分散相的颗粒直径低于约1微米时，这种乳液通常称为“亚微米乳液”。在根据本发明的组合疫苗的水包油乳液的实施方案中，所述乳液是亚微米乳液。通常可以获得测量1微米或更小的颗粒大小的设备，例如通过激光衍射测量。通常，颗粒大小以纳米(nm)表示，并且作为平均颗粒大小，也称为中值直径，表示为累积颗粒大小分布的d50。对于本发明，颗粒大小以d50的nm表示，如使用mastersizer™(malverninstruments)测量的。颗粒大小测量可以在(浓缩的)油性乳液或组合疫苗中进行；本发明的油相的颗粒折射率为1.48。malvernmastersizer大小分析报告将d50表示为d(0.50)。所有这些都是技术人员熟知的。有许多方法可用于生产此类亚微米乳液，通常通过使用高能乳化过程，例如使用：高压均质器，转子-定子装置，搅拌器，超声波，微孔膜或微通道装置。用于本发明的优选的高能乳化过程是使用高压均质器，优选microfluidiser™(microfluidics)。通常，在500-1500巴(即7000-22000psi)的压力下通过3次将是足够的。以这种方式制备的乳液通常具有d50为500nm或更小的分散相颗粒，并且具有窄的大小分布；对于本发明，分散相是油性佐剂的液滴。通常，在几个步骤中制备具有这种非常细小尺寸的分散相颗粒的乳液。以这种方式，通过低能混合制备初始的相对粗糙的油性乳液，然后进行一次或多次后续高能处理以实现颗粒大小的进一步减小。随后，然后将包含水中的佐剂和乳化剂的‘微流化’油性乳液与包含抗原的水相混合，以制备根据本发明的组合疫苗。因此，在根据本发明的组合疫苗的亚微米水包油乳液的实施方案中，油滴具有500nm或更小的d50；优选d50为250nm或更小。更优选地，d50为150nm或更小。出于产品一致性和质量的原因，不仅可以有利地监测和控制中值粒径，而且还可以有利地监测和控制颗粒大小的分布，也称为大小分布。根据本发明的组合疫苗的亚微米水包油乳液中的油滴的大小分布优选相对较窄。颗粒大小分布的指标是累积颗粒大小分布的d90。因此，在根据本发明的组合疫苗的亚微米水包油乳液的实施方案中，油滴具有低于900nm的d90，更优选地d90低于500nm，400nm或甚至低于300nm，按该优选顺序。最优选地，d90为约250nm。具有如此小的颗粒大小和颗粒大小分布的乳液的优点之一是可以通过过滤对其进行灭菌，而没有显著的材料损失。这是因为典型的灭菌过滤器具有约0.2微米的孔径。这种过滤灭菌克服了对可能损害油性乳液组分的质量的其他灭菌方法(例如通过加热，化学品或辐射)的需要。取决于根据本发明的组合疫苗的预期用途的环境，例如田间条件，或靶标物种的特异性，优化疫苗可以是优选的。这完全在技术人员的能力内，并且一般涉及疫苗功效、安全性或稳定性的细调。如上所述，根据本发明的组合疫苗以能够在猪靶标中诱导针对其相关疾病的保护性免疫响应的量，包含来自pcv2的非复制抗原和活的prrsv。本发明领域的技术人员完全能够测定根据本发明的组合疫苗的有效性，例如通过监测疫苗接种后或攻击感染后的免疫响应，例如通过监测靶标的疾病体症、临床评分，或通过重新分离病原体，并将这些结果与模拟接种动物中所见的疫苗接种攻击反应进行比较。作为适应症，在根据本发明的组合疫苗中使用的抗原的量可以基于在具有这些抗原的相应单价疫苗或组合疫苗中使用的那些。例如，根据本发明的组合疫苗可以每毫升包含：pcv2:1-50µgorf2；和prrsv:10^3-10^6tcid50。定量这些抗原的方法在本领域中是熟知的，并且也可以依赖于针对特定标准品的基于elisa的定量。根据本发明的组合疫苗可以有利地与复制或非复制性，完整或破坏的一种或多种其他抗原组合。然而，优选小心地进行组合，以保证整个组合疫苗的稳定性和功效，以及复制性疫苗组分的生存力。这些选择在技术人员的常规能力范围内。因此，在一个实施方案中，根据本发明的疫苗包含至少一种额外的抗原。额外的抗原是对猪具有致病性的微生物的减毒形式，或者是源自对猪具有致病性的微生物的非复制抗原。微生物可以是对猪具有致病性的任何病毒、细菌、寄生虫、真菌、立克次氏体、原生动物和/或寄生虫。这种对猪具有致病性的微生物的实例为：伪狂犬病病毒，猪细小病毒，典型猪瘟病毒，猪流感病毒，口蹄疫病毒，猪流行性腹泻病毒，传染性胃肠炎病毒，猪呼吸道冠状病毒，水疱口腔炎病毒，猪肺炎支原体，胞内劳森氏菌，胸膜肺炎放线杆菌，短螺旋体，大肠杆菌，嗜血杆菌，链球菌，沙门氏菌，梭菌，巴氏杆菌，猪瘟病毒，钩端螺旋体，博德特氏菌，弓形虫，等孢球虫和旋毛虫。优选的额外抗原是来自以下的一种或多种：猪肺炎支原体，胞内劳森氏菌，胸膜肺炎放线杆菌，副猪嗜血杆菌，猪痢疾短螺旋体和猪流感病毒。因此，在优选的实施方案中，根据本发明的组合疫苗还包含来自猪肺炎支原体(mhyo)的非复制抗原。在替代的优选实施方案中，根据本发明的组合疫苗还包含来自胞内劳森氏菌(劳森氏菌)的非复制抗原。来自mhyo和劳森氏菌的非复制抗原优选是菌苗。对于本发明，“菌苗”是包含灭活(杀死)的细菌的组合物，其中灭活的细菌可以是整个完整细胞，或者可以通过灭活受到一定程度的破损，或其混合物，例如整体灭活的培养物。mhyo或劳森氏菌菌苗优选是杀死的全细胞培养物。mhyo菌苗优选来自11株或j株。注意：mhyo以前称为猪肺炎支原体(m.suipneumoniae)。在根据本发明的组合疫苗中使用的抗原的量可以是：mhyo：2-20％w/v的灭活浓缩mhyo培养物；和/或劳森氏菌：在1x10^7和1x10^10个细胞之间灭活的全细胞。根据本发明的组合疫苗的观察效果是：对于mhyo：预防或减少mhyo引起的肺部病变，如实变肺炎和慢性呼吸道疾病；对于劳森氏菌：减少劳森氏菌的定植和粪便脱落，并且减少回肠炎的体症，以及肠道出血，猪出血性肠病或猪肠道腺瘤病。对于劳森氏菌，根据本发明的组合疫苗的效力可以作为劳森氏菌特异性抗体的血清水平增加(使用基于elisa的技术可容易地检测)通过血清学的方式检测。对于mhyo，疫苗效力的最可靠的测量是在mhyo攻击感染后肺部病变评分的降低。通常基于goodwin量表(goodwinetal.,1969,j.hyg.camb.,vol.67,p.465-476)，在尸检期间，通过肺实变的宏观评估，对此类病变进行评分；所述goodwin量表从零到最多55点/动物(对于完全受影响的肺)。根据本发明的组合疫苗可以有利地与药物化合物组合，例如抗生素，激素和/或抗炎药物。根据本发明的组合疫苗可以包含进一步的赋形剂，以优化疫苗的功效或稳定性，例如稳定剂或防腐剂。稳定剂的实例为：奶粉，明胶，血清白蛋白，山梨糖醇，海藻糖，氨基酸，亚精胺，右旋糖苷或聚乙烯吡咯烷酮防腐剂的实例为：水杨乙汞(thimerosal)，硫柳汞(merthiolate)，酚类化合物或庆大霉素。当在根据本发明的组合疫苗中使用的抗原经过特别选择时，所述组合疫苗可以用作所谓的标记疫苗。这意味着可以通过一些检测方法区分由疫苗引起的针对病原体之一的免疫，与用野生型病原体感染靶标时发生的免疫响应。这也称为diva：“感染的与接种疫苗的动物的区分”。因此，与野生型感染相比，疫苗具有阳性或阴性“标记”。因此，在一个实施方案中，根据本发明的组合疫苗是标记疫苗。在一个实施方案中，组合疫苗用于猪。术语“猪”是指猪科(suidae)的动物，并且优选是猪属(sus)的动物，其也被称为猪。实例为：野生或家养猪，肉猪，野猪，鹿豚(babirusa)或疣猪。这还包括以任意名称表示的猪，例如涉及其性别或年龄，例如：母猪，处女猪(queen)，公猪，阉猪，肉猪，小母猪，断奶仔猪或仔猪。此外，术语猪是指任何类型的猪动物，例如育种或育肥的类型，以及这些类型中任一种的亲本系。技术人员可以想到并且完全可以实现根据本发明的组合疫苗的进一步或额外的实施方案。这些进一步的实施方案也可以以一种或多种组合应用于已经描述的实施方案。因此，在根据本发明的组合疫苗的一个实施方案中，应用一种，多种或所有选自以下的条件：-所述组合疫苗包含约1％至约9％w/v的量的角鲨烷；优选包含2-5％w/v之间的量的角鲨烷；-所述组合疫苗包含约1％至约10％w/v的量的维生素e-乙酸酯；优选包含3-5％w/v之间的量的维生素e-乙酸酯；-维生素e-乙酸酯优选为dl-α-生育酚-乙酸酯；-所述组合疫苗由约20:80和约80:20之间的体积比的水相和油性乳液的混合物制备；-所述组合疫苗包含约0.1％至约5％w/v的量的聚山梨醇酯80；优选包含1-2％w/v之间的量的聚山梨醇酯80；-水包油乳液是亚微米乳液；更优选地，油滴具有500nm或更小的d50；-所述组合疫苗包含至少一种额外的抗原；优选来自以下的一种或多种抗原：胸膜肺炎放线杆菌，副猪嗜血杆菌，猪痢疾短螺旋体和猪流感病毒；-所述组合疫苗还含有来自猪肺炎支原体的非复制抗原；-所述组合疫苗还包含来自胞内劳森氏菌的非复制抗原；-所述组合疫苗是标记疫苗；和-所述组合疫苗用于猪。在根据本发明的组合疫苗的一个实施方案中，所述疫苗包含约1％至约9％w/v的量的角鲨烷；所述疫苗包含约1％至约10％w/v的量的维生素e-乙酸酯；维生素e-乙酸酯为dl-α-生育酚-乙酸酯；所述疫苗由约20:80和约80:20之间的体积比的水相和油性乳液的混合物制备；所述疫苗包含约0.1％至约5％w/v的量的聚山梨醇酯80；水包油乳液是亚微米乳液；且所述疫苗用于猪。根据本发明的组合疫苗可以以不同方式构成，如本文所述。制备根据本发明的组合疫苗的一种有利方式是通过重构冷冻干燥的活prrsv制剂。例如，可以使用尚未包含prrsv的根据本发明的组合疫苗的不完整版本，作为用于冷冻干燥的活减毒prrsv制剂的稀释剂，方便地用于：现有的冷冻干燥的活prrsv疫苗，例如porcilisprrsv或primepac™prrs+。因此，根据本发明的组合疫苗可以由包括至少两个容器的试剂盒(kitofparts)生产：一个容器包含除活prrsv病毒之外的根据本发明的组合疫苗的所有组分；且一个容器包括冷冻干燥形式的活减毒prrsv。然后，试剂盒的组件在一起体现为根据本发明的组合疫苗。因此，在进一步方面，本发明涉及包括至少两个容器的试剂盒：一个容器包含在包含角鲨烷和维生素e-乙酸酯的水包油乳液中的来自pcv2的非复制抗原；且一个容器包含冷冻干燥形式的活prrsv。在活prrsv的重构后，形成根据本发明的完整的组合疫苗。这也称为“现场”混合疫苗，或“现场边”混合。虽然组合疫苗对prrsv不具有杀病毒作用，但优选在疫苗施用前不久进行重构，以确保疫苗的最佳质量。优选地，长沟在施用前8小时内进行，更优选在施用前的6、5、4、3或甚至2小时内，按该优选顺序。根据本发明的试剂盒及其组件，可包含本文所述的用于根据本发明的组合疫苗的任何实施方案(优选的或非优选的)，或根据本发明的组合疫苗的那些实施方案中的两种或更多种的任何组合。根据本发明的试剂盒的进一步有利的用途是如下的一种，其中通过重构冷冻干燥的制剂，将来自劳森氏菌的非复制抗原和活prrsv二者都吸收到本发明的组合疫苗中。因此，在一个实施方案中，根据本发明的试剂盒包括至少三个容器：一个容器包含在包含角鲨烷和维生素e-乙酸酯的水包油乳液中的来自pcv2的非复制抗原；一个容器包含冷冻干燥形式的活prrsv；和一个容器包含冷冻干燥形式的来自劳森氏菌的非复制抗原。在包含至少三个容器的根据本发明的试剂盒的优选实施方案中，包含在包含角鲨烷和维生素e-乙酸酯的水包油乳液中的来自pcv2的非复制抗原的容器，还包含来自mhyo的非复制抗原。冷冻干燥的形式可以是容器(例如瓶)中的冷冻干燥饼，但也可以是如在sphereon™技术中的冻干球(lyosphere)。由于冷冻干燥体的性质，其重构不显著(即小于约5％；更优选小于约1％)改变所用的稀释剂的体积。因此，有待于在根据本发明的试剂盒中提供的，具有除活prrsv之外的所有组分，或具有除活prrsv和来自劳森氏菌的非复制抗原之外的所有组分的根据本发明的组合疫苗的制剂，基本上可以最终量或以其最终浓度与其他组分一起提供。根据本发明的组合疫苗可以通过本领域熟知的方法由相应的抗原和赋形剂制备，并且在本领域技术人员的常规能力范围内。例如，pcv2orf2可以在昆虫细胞培养物中由重组杆状病毒表达，并收获；或者，pcv2orf2蛋白可以使用复制子颗粒递送和表达(同上)。prrsv可以在合适的宿主细胞上培养，例如原代猪巨噬细胞，或细胞系如marc-145或ma104。将这些抗原定量，并以所需的量吸收到水相中。这可以是具有或没有来自mhyo，劳森氏菌的非复制抗原和/或活的prrsv；在根据本发明的组合疫苗的情况下，将其作为根据本发明的试剂盒商品化。通过乳化过程，单独地制备具有在水中的佐剂和乳化剂的油性乳液。随后，以所需的体积比，将其与具有抗原的水相混合。通过适当的测试来监测制造过程的各个阶段，例如用于细菌和病毒，或任何进一步抗原的质量和数量的微生物学和免疫学测试，或用于缺少外来物质的测试；用于化学和生物稳定性的测试；并最终通过体外或体内实验来确定疫苗的功效和安全性。所有这些都是技术人员所熟知的，并且在政府法规(例如药典)和手册(例如remington和pastoret(均见上文))中规定。因此，在进一步方面，本发明涉及制备根据本发明的组合疫苗的方法，其包括以下步骤：-制备包含来自pcv2的非复制抗原和活prrsv的水相；-将所述水相与包含角鲨烷和维生素e-乙酸酯的油性乳液混合。如上所述，用于制备根据本发明的组合疫苗的方法可以有利地适于在后期掺入来自mhyo，或来自劳森氏菌和/或来自活prrsv的抗原，例如通过重构这些抗原的单独的冷冻干燥制剂。因此，在进一步方面，本发明涉及制备根据本发明的组合疫苗的方法，其包括以下步骤：-制备冷冻干燥形式的活prrsv；-制备包含来自pcv2的非复制抗原的水相；-将所述水相与包含角鲨烷和维生素e-乙酸酯的油性乳液混合；和-使用水相和油性乳液的所述混合物重构所述冷冻干燥的活prrsv。包含来自pcv2的非复制抗原的水相任选地包含来自mhyo的非复制抗原。类似地，在进一步方面，本发明涉及用于制备根据本发明的组合疫苗的方法，其包括下述步骤：-制备冷冻干燥形式的活prrsv；-制备冷冻干燥形式的非复制劳森氏菌抗原；-制备包含来自pcv2的非复制抗原的水相；-将所述水相与包含角鲨烷和维生素e-乙酸酯的油性乳液混合；和-使用水相和油性乳液的所述混合物重构所述冷冻干燥的活prrsv和所述非复制劳森氏菌抗原。包含来自pcv2的非复制抗原的水相任选地包含来自mhyo的非复制抗原。或者，在类似的实施方案中：本发明涉及用于制备根据本发明的组合疫苗的方法，其包括下述步骤：-制备包含来自pcv2的非复制抗原的水相和包含角鲨烷和维生素e-乙酸酯的油性乳液的混合物；和-使用所述混合物重构冷冻干燥形式的活prrsv。包含来自pcv2的非复制抗原的水相任选地包含来自mhyo的非复制抗原。可以在这些方法中的不同点添加额外的步骤，例如用于额外的处理，例如用于纯化或储存。制备方法还可包括与额外的抗原或药学上可接受的赋形剂如稳定剂或防腐剂混合。这些变化和任选的更多变化可以作为进一步的步骤在适当的点并入根据本发明的制备方法中。因此，根据本发明的方法，可包含本文所述的用于根据本发明的组合疫苗的任何实施方案(优选的或非优选的)，或根据本发明的组合疫苗的那些实施方案中的两种或更多种的任何组合。如所描述的，可以通过根据本发明的方法制备的根据本发明的组合疫苗，可以有利地用于向猪施用以保护免于pcv2和prrsv感染和/或与pcv2和prrsv感染相关的疾病。因此，在进一步方面，本发明涉及包含角鲨烷和维生素e-乙酸酯，来自pcv2的非复制抗原和活prrsv的水包油乳液，其用于针对pcv2和prrsv的猪疫苗接种。可选地，在进一步方面，本发明涉及来自pcv2的非复制抗原和活prrsv用于制备猪用组合疫苗的用途，其特征在于所述疫苗是包含角鲨烷和维生素e-乙酸酯的水包油乳液。可以应用根据本发明的组合疫苗，用于针对pcv2和prrsv的猪疫苗接种。因此，在进一步方面，本发明涉及针对pcv2和prrsv的猪疫苗接种方法，其中通过向所述猪施用包含角鲨烷和维生素e-乙酸酯，来自pcv2的非复制抗原和活prrsv的水包油乳液。或者，在类似的实施方案中：本发明涉及针对pcv2和prrsv的猪疫苗接种方法，其中通过向所述猪施用根据本发明的组合疫苗。水包油乳液，例如本发明的组合疫苗，优选通过某种肠胃外施用的方式施用，例如通过注射进入皮肤或通过皮肤的所有途径：例如肌内，静脉内，腹膜内，皮内，粘膜下，或皮下。这可以通过不同方式实现，例如使用经典注射器和皮下注射针。或者，肠胃外施用可以通过一些无针注射的方法完成，通过皮内或透皮涂药器如idal™递送疫苗。在根据本发明的疫苗接种方法的一个实施方案中，所述施用通过肌内途径施加。根据本发明的组合疫苗的动物剂量的体积并不重要，只要获得有效的免疫保护。对于不同的施用途径，例如：肌肉内，皮下或皮内，这可能是不同的。优选地，一个动物剂量的体积为每只动物约0.1至10ml；更优选每个动物剂量0.2至5ml，0.5至3ml，或甚至0.5至2ml，按该优选顺序。因此，在根据本发明的施用方法的一个实施方案中，根据本发明的组合疫苗以每只动物约0.1至10ml的剂量施用。根据本发明的疫苗接种方法对靶标猪的施用方案可以是单剂量或多剂量，或者以与猪饲养的实际方面相容的方式。当需要时，可以在生命后期，给予猪靶标根据本发明的组合的第二次或进一步施用，即所谓的加强免疫接种。然而，根据本发明的组合疫苗以如下方式优化：使得单次疫苗接种剂量通常将足以在猪的相关生命期间提供免疫保护，例如在猪的至6月龄的育肥阶段期间。因此，在优选的实施方案中，根据本发明的组合疫苗对每个猪靶仅施用一次，即它是单剂疫苗。优选地，将疫苗接种方法的方案整合至靶标猪可能需要的其他疫苗的现有疫苗接种时间表中，以进一步减少对动物的应激并降低劳动力成本。这些其他疫苗可以同步、同时或顺次的方式，以与其登记用途相容的方式施用。因此，在根据本发明的猪疫苗接种方法的一个实施方案中，根据本发明的组合疫苗与另一猪疫苗组合施用。用于本发明的疫苗接种的靶标猪可以是任何年龄，其中它们易于接种疫苗，和/或易受疫苗保护的疾病或感染的影响。此外，对于根据本发明的疫苗接种，靶标猪的重量，性别，免疫状态等并不重要，尽管有利的是，对健康靶标进行疫苗接种，以及尽可能早地进行疫苗接种以预防mhyo，劳森氏菌，pcv2或prrsv的早期感染(的后果)。因此，在根据本发明的猪疫苗接种方法的一个实施方案中，将本发明的组合疫苗施用于幼猪。对于本发明，“幼猪”是至约2月龄的猪。由于mhyo，劳森氏菌，pcv2和prrsv的高流行率，并且由于针对这些病原体中的一种或多种的疫苗的广泛使用，许多母猪对于针对mhyo，劳森氏菌，pcv2和prrsv中的一种或多种的抗体呈血清反应阳性。因此，从这些母猪中摄取初乳的幼猪将是mda+(母源抗体阳性)。这不妨碍根据本发明的组合疫苗的功效，因为它在mda+猪中也是有效的。因此，在根据本发明的疫苗接种方法的一个实施方案中，将根据本发明的组合疫苗施用于mda+猪。prrsv特异性地诱导成年猪中的呼吸道疾病。因此，在根据本发明的猪疫苗接种方法的一个实施方案中，将根据本发明的组合疫苗施用于成年猪。对于本发明，“成年猪”是从大约6月龄起的猪。根据本发明的组合疫苗的施用可以作为预防性或治疗性治疗或两者应用，因为其干扰mhyo，劳森氏菌，pcv2和prrsv的感染的建立和进展两者。根据本发明的组合疫苗的使用将有助于减少mhyo，劳森氏菌，pcv2和prrsv中的一种或全部在猪群，农场或地理区域中的猪中的感染。因此，在进一步方面，本发明涉及减少猪中的mhyo，劳森氏菌，pcv2或prrsv感染或相关的疾病体征的方法，其特征在于所述方法包括向所述猪施用根据本发明的组合疫苗。现将通过以下非限定性的实施例，进一步描述本发明。实施例1.组合疫苗的制备根据本发明的组合疫苗如下制备：2x浓度的油性乳剂每100g包含：聚山梨醇酯80(吐温80)：3.24g；角鲨烷：6.75克；dl-α-生育酚乙酸酯，7.94g；注射用水：82.07克。根据以下后续工艺步骤制备此油性乳液：-称出所需量的吐温80和角鲨烷，并在烧杯中组合；-在室温下，通过低能混合(磁力搅拌器)，将吐温80/角鲨烷混合物均质化；-称出所需量的dl-α生育酚乙酸酯，并添加到均质的吐温80/角鲨烷混合物中；-在室温下，通过低能混合，将组合的混合物再次均质化；-将混合物加热至65-75℃；-将注射用水加热至65-75℃；-通过具有n18棒的ultraturrax，使用高能混合将加热的油相和水预混合5-15分钟；温度从65℃降至55℃，-使预混物在800巴通过microfluidiser3次；使用冷却螺旋，将温度保持低于50℃，-通过过滤通过0.2微米过滤器(pall,ultipor™n66)，使微流化的油性乳液灭菌；过滤器已通过其双层壁预热至55-75℃。通过光学显微镜，检查最终的油性乳液(2x浓缩物)的完整性和均质化水平。进一步地，还检查了ph(7.34)和摩尔渗透压浓度(221mosm/kg)。颗粒大小测量显示：d100=300nm；d99=250nm；d90=200nm，且d50=130nm。通过取得所需量的每种非复制抗原制备水相(2x浓度)：mhyo：6％v/v的10x浓缩灭活培养物；劳森氏菌：2×10^9个灭活细胞；和pcv：50μgorf2。随后，通过在室温下的低能混合，将两种浓缩组合物(具有佐剂的油性乳液和具有抗原的水相)以50:50的体积比组合。这个疫苗混合物用于重悬porcilisprrs的安瓿，其中使用所需的体积以达到每2ml组合疫苗的全剂量prrsv(10^5tcid50)。最终的组合疫苗含有：3.375％w/v角鲨烷；3.97％w/v维生素e-乙酸酯和1.62％w/v吐温80，并且具有0.9913g/ml的密度。产品储存在2-8℃。2.杀病毒作用的测试将本发明的油性乳液与活prrsv样品一起孵育，以确定是否会发生任何杀病毒作用。简而言之：将porcilisprrsv的安瓿在pbs中重构至7ml的最终体积，以达到6log10tcid50/ml的滴度。将50μl的这种病毒悬浮液的样品与450μl的组合疫苗(如实施例1中制备)组合，所述组合疫苗不含活prrsv并包含：角鲨烷，维生素e-乙酸酯和聚山梨醇酯80，与mhyo，劳森氏菌和pcv2的非复制抗原在水中微流化。将prrsv的对照样品与450μlpbs混合。将两个样品都在室温下孵育1小时。随后，将孵育的样品滴定以测定prrsv的剩余滴度。滴定在1日龄的ma104细胞单层上完成。10行起始孔接收25μl孵育的病毒样品，通过7个后续孔将其以1:10稀释。2列未处理的细胞充当阴性对照。这一式两份地进行。随后，将板在37℃，5％co2气氛中孵育3天。最后，使用抗prrsv单克隆抗体和荧光标记的检测抗体，通过免疫荧光检测prrsv病毒复制。使用spearman-kaerber算法计算滴度。样品滴度(1)(log10tcid50/ml)组合疫苗(0.9x)4.6对照4.8(1)滴度是两次测定的平均值。随着发现为±0.2log10tcid50的滴定值差异，结果证明在根据本发明的0.9x浓缩的组合疫苗中孵育的活prrsv样品没有经历显著的滴度降低。3.接种-攻击实验3.1.简介在动物中测试如实施例1中制备的组合疫苗，所述组合疫苗不含活prrsv并包含：角鲨烷，维生素e-乙酸酯和聚山梨醇酯80，与mhyo，劳森氏菌和pcv2的非复制抗原在水中微流化。疫苗接种在3周龄时通过肌内途径以一次注射剂量给予。在疫苗接种后4周，通过攻击感染测试mhyo功效。比较了几种其他佐剂。3.2.研究设计本研究使用了84只spf仔猪。6个12只动物的组在3周龄(+/-3天)肌肉内疫苗接种一次。一个12只猪的组没有进行疫苗接种并用作攻击-对照组。在疫苗接种之前和疫苗接种疫苗后两天，测量直肠温度。此外，对于svea组，每周触诊检查注射部位的局部反应。疫苗接种后四周，使用毒性mhyo株感染所有动物。攻击后三周，对所有动物实施安乐死，并通过尸验，检查肺部病变。从所有动物，在疫苗接种前，攻击前和尸检时，采集血样。表1：实施例3的处理方案。组疫苗佐剂1爱菲金(amphigen)2svea3svea+al(oh)34mf59+dda5sp油(metastim)6vaxliants57无疫苗3.3.测试的佐剂测试了多种疫苗制剂，其仅在所用的制剂和佐剂的类型方面不同；抗原含量是相同的。测试了以下佐剂：·爱菲金：水包油的矿物油，具有卵磷脂；·svea：微流化的水包油乳液，具有角鲨烷，维生素e乙酸酯和吐温80；·svea+al(oh)3：svea和0.2％w/v氢氧化铝(与porcilispcvmhyo中相同)；·mf59+dda：mf59是水包油乳液，具有角鲨烯，聚山梨醇酯80和span85；dda是阳离子脂质：二甲基二十八烷基铵；·sp油：普兰尼克(pluronic)，角鲨烷和吐温，如wo2013/152086中所述；·vaxliant™s5：未知组成的专有佐剂。3.4.材料和方法攻击：攻击材料是mhyo，毒性野生株，在具有猪血清的friis培养基中的新鲜的3天培养物。连续两天，对每个动物在气管内施用10ml含有9ccu的培养物。所有动物均在兽医的常规监督下。疫苗接种：疫苗接种为三周，在动物仍与其母猪在一起时。剂量为3ml,，肌肉内给予，在颈部右侧。在4周龄断奶。在攻击前一周，将猪转移到攻击设施。血清学：在紧邻疫苗接种之前(t=0)，紧邻攻击之前(t=4)和尸检时(t=7)，采集血样(从颈静脉)。将样品保持在环境温度下，直至得到血清。根据标准程序，测定血清样品中针对pcv2(通过elisa)或针对劳森氏菌的相关抗体的存在。触诊：检查svea组的注射部位的局部反应：紧邻疫苗接种之前，疫苗接种后4小时，疫苗接种后每天(持续2天)和每周(持续5周)。对于疫苗接种后五周仍显示局部反应的动物，每周单独触诊直至局部反应消失。直肠温度和临床观察：测量直肠温度，并且在疫苗接种前一天，和紧邻疫苗接种之后，疫苗接种后4小时和一天和两天进行临床观察(0=正常；1=活性较低；2=呕吐；3=躺下)。尸检检查：在攻击后3周，本实验结束时，对所有猪实施安乐死。在个体动物中，研究注射部位的局部反应。根据goodwin&whittlestone评分，对每只猪单独地记录肺部病变评分百分比。3.5.结果表2：实施例3的结果(1)mhyolls=中值肺部病变评分。触诊和体温的结果：通过触诊疫苗接种部位监测并检查体温的组是接受具有svea佐剂的疫苗的组(组2)。这些显示在整个监测期间没有可检测的局部肿胀，并且没有观察到体温升高。3.6.结论表2证实难以实现组合疫苗的广泛功效；所测试的几种佐剂确实对一种或甚至两种病原体诱导可被确定为保护性的免疫；这可以是低mhyo肺病变评分，也可以是对pcv2和劳森氏菌的足够高的特异性抗体滴度。然而，仅对于svea佐剂的疫苗，保护对所有三种病原体都足够好。没有其他佐剂达到该广泛疗效的水平。来自实施例2的关于svea佐剂组合疫苗对活prrsv缺乏杀病毒作用的数据，预测具有svea佐剂的组合疫苗也将对prrsv有效。总之，这证实根据本发明的组合疫苗在免疫学上对病原体mhyo，劳森氏菌，pcv2和prrsv中的每一种都有效。此外，它对猪是安全的。4.四联接种-攻击实验进行进一步的疫苗接种-攻击实验，其中用根据本发明的四联组合疫苗对猪进行疫苗接种，并且在4个单独的实验中，测试这种疫苗的所有4种组分的功效：mhyo，劳森氏菌，pcv和prrsv。具体地，如实施例1和3中所述制备3联组合疫苗，其含有与包含mhyo和劳森氏菌的灭活抗原和pcv2-orf2的重组表达产物的的水相以1：1混合的，角鲨烷，维生素e乙酸酯和吐温8的亚微米乳液。随后，且在紧邻猪疫苗接种之前，使用这种3联疫苗溶解一安瓿的冷冻干燥的商业prrs疫苗，使用所需的体积达到每2ml动物剂量的四联联合疫苗，10^5tcid50的全剂量prrsv。通过肌内途径，向3周龄的猪给予作为一次性剂量的疫苗接种。通过对疫苗接种和对照的攻击感染，在单独的实验中进行四种疫苗抗原中的每一种的疫苗功效的后续分析，以允许关注对这些不同条件的感染和疾病的特定症状。然而，与上述实施例3中描述的结果相比，预期针对任何这些攻击感染的疫苗接种-效力的结果没有差异；就针对灭活抗原的保护而言，使用3联疫苗存在与4联疫苗相比的任何不同作用，是极不可能的。换言之，预期prrsv病毒在4联组合疫苗中的存在不影响该组合疫苗针对mhyo，劳森氏菌或pcv攻击感染中的任何一种的效力。此外，预期对活prrsv组分的存活力和功效没有影响，因为先前的实验已经表明，svea佐剂中的3联疫苗对prrs病毒的存活力没有显著影响。因此，由于prrs病毒没有通过混入3联疫苗而被杀死或而损害其感染性，因此没有其不能诱导有效保护的理由。这些期望确实通过下述4个攻击实验的结果得到证实：发现根据本发明的4联组合疫苗诱导针对感染和疾病体征的有效免疫保护，所述感染和疾病体征是通过使用来自其4种组分的每一种的病原体的攻击感染诱导的。此外，没有来自其组合的负面影响或干扰。4.1.猪肺炎支原体的功效使用porcilisprrs冷冻干燥的疫苗，制备4联组合疫苗，如上所述。实验大纲本研究使用了24只spf仔猪。1个12只动物的组在约3周龄肌肉内疫苗接种一次。一个12只猪的组没有进行疫苗接种并用作攻击-对照组。疫苗接种后四周，使用毒性mhyo株攻击-感染所有动物。攻击后三周，对所有动物实施安乐死，并通过尸验，检查肺部病变。从所有动物，在疫苗接种前，攻击前和尸检时，采集血样。实验细节攻击材料来自mhyo，毒性野生株，作为在具有猪血清的friis培养基中的新鲜的3天培养物。连续两天，对每个动物在气管内施用分别含有10和9ccu的10ml培养物。所有动物均在兽医的常规监督下。疫苗接种在三周龄，在动物仍与其母猪在一起时。剂量为2ml,，肌肉内给予，在颈部右侧。在4周龄断奶。在攻击前一周，将猪转移到攻击设施。在紧邻疫苗接种之前(t=0周)，紧邻攻击之前(t=4周)和尸检时(t=7周)，采集血样(从颈静脉)。将样品保持在环境温度下，直至得到血清。根据标准程序，通过elisa测定血清样品中针对pcv2或针对劳森氏菌的相关抗体的存在。数据分析：在攻击后3周，本实验结束时，对所有猪实施安乐死。根据goodwin&whittlestone评分(如上)，对每只猪单独地记录肺损伤评分百分比。结果表3：实施例4.1的mhyo和血清学数据的结果(1)mhyolls=肺部病变评分的中值。结论：用本发明的4联组合疫苗对猪进行疫苗接种有效地保护免于mhyo攻击感染诱导的感染和疾病体征。此外，对劳森氏菌和pcv2的保护得到了很好的发展，如通过血清学测量的。4.2.pcv2功效使用porcilisprrs冷冻干燥的疫苗，制备4联组合疫苗，如上所述。实验大纲&实验细节将仔猪分配给各10只仔猪的处理组。当仔猪大约五周龄时，对它们进行皮内或肌肉内疫苗接种：-一个组使用svea佐剂中的4联联合疫苗进行肌肉内疫苗接种：使用pcv2-orf2(2500au/ml)，mhyo(1.0pcvu/ml)，劳森氏菌(5000au/ml)和105tcid50/剂的prrsv配制的单一2ml剂量的疫苗。溶解prrs疫苗和疫苗接种之间的时间为1小时。-组2是阳性对照，并且使用市售疫苗porcilispcvid和porcillisprrsid对其进行疫苗接种，二者均通过皮内途径接种，但没有混合，并在猪背部的不同部位给予。-第三组中的仔猪没有进行疫苗接种(阴性对照组)，但受到攻击。在疫苗接种后3周(8周龄，疫苗接种后3周，样品日期[sd]22天)，使用5.0log10tcid50/ml的野生型pcv2b攻击病毒i12/11株攻击所有动物，其以每个鼻孔3毫升在鼻内接种。攻击后3周，对所有动物进行尸体剖检，并对腹股沟淋巴结，肠系膜淋巴结，扁桃体和肺进行取样，以用于pcv2检测，btqpcr和免疫组织化学。在疫苗接种后，每天观察所有仔猪的临床体征。在sd-1、sd0、sd0+4小时和sd1，取体温。从所有动物收集血清样品，针对抗pcv2，prrsv和劳森氏菌的抗体对其进行测试。从所有动物收集血清，组织，和粪便和鼻拭子样品，并通过qpcr检查pcv核酸。数据分析&结果：体温读数显示没有显著结果。组合的血清学结果呈现于下表4中。pcv2血清学：来自两个疫苗接种组的所有仔猪在样本日期22(疫苗接种后3周)已经达到抗pcv2抗体的100％血清转化。实际滴度在此之后有所增加，并从sd35达到稳定水平。没有疫苗接种的对照仅在攻击后发生血清转化，但从未达到超过20％的血清转化。pcv2ihc和qpcr：对淋巴结和扁桃体中pcv的体征进行免疫组织学筛选和评分。结果显示，在两个疫苗接种组中，评分平均为0.3，而在没有疫苗接种的对照组中，ihc评分平均为1.6。qpcr结果显示，在两个疫苗接种组中，猪在血清，鼻-或粪拭子，或组织样本(淋巴结，扁桃体和肺)中具有极少的pcv2存在。然而，对照组在攻击后对pcv2核酸变为强阳性。劳森氏菌血清学组1的劳森氏菌血清学显示滴度从sd22增加，而在对照组中劳森氏菌滴度显示稳定下降。prrsv血清学prrsv的血清学结果通常表示为sp(样品对阳性的)比率。当该比率高于0.4时，样品被认为是prrsv血清转化阳性。表4中prrsv的部分呈现了这些sp值。它们显示，阳性对照组2(通过id途径的prrsv疫苗)中的动物对prrsv血清转化呈强阳性；尽管如此，组1(通过im途径的4联组合疫苗)中的动物也达到了良好的血清转化率。没有疫苗接种的对照几乎没有显示prrsv的任何血清转化，因为没有发现超过0.05的sp比率。表4：实施例4.2的组合血清学结果。结论：用根据本发明的4联组合疫苗对猪进行疫苗接种有效地保护免于pcv2攻击感染诱导的感染和疾病体征。此外，对劳森氏菌和prrsv的保护得到了很好的发展，如通过血清学测量的。4.3.劳森氏菌功效使用primepacprrs冷冻干燥的疫苗，制备4联组合疫苗，如上所述。实验大纲使用4联组合疫苗对3个三周龄猪的组进行疫苗接种，并在5周后给予使用毒性劳森氏菌细菌的攻击感染。一个组接受完整的4联疫苗，另一组接受包含除劳森氏菌抗原之外的所有相同成分的对照疫苗。第三组接受对照疫苗，但没有攻击，因为在攻击时对其进行了尸体剖检，以确认兽群在攻击前中没有劳森氏菌感染。比较这些组，以测定单剂量的组合疫苗针对劳森氏菌攻击引起的疾病的功效：回肠炎，劳森氏菌对回肠的定植，脱落和对体重增加的影响。在疫苗接种后，每隔一天对所有猪进行局部和全身反应评估，持续21天，或者直至消退。收集粪便样品以确认在攻击前没有劳森氏菌的野外感染。在整个研究中收集血液样品，以评估对疫苗接种和攻击的抗体响应，还收集粪便样品用于劳森氏菌qpcr，并记录体重数据。在攻击后3周(11周龄)，对所有剩余的动物进行尸体剖检，并确定回肠的总体病变评分，并收集粘膜刮屑用于劳森氏菌定量pcr(qpcr)。还收集回肠切片用于免疫组织化学(ihc)和组织病理学。实验细节猪是混合性别的，并且是混合的美国yorkshire-landrace-duroc品种。提供水和适合年龄的饲料，自由取食。完整的4联疫苗每2ml动物剂量包含：2.0rp的mhyo抗原；6000elisa单位的劳森氏菌抗原/ml；5.7μg/ml的pcv2orf2抗原；和10^5tcid50的prrsv。在临攻击之前，对使用对照疫苗进行疫苗接种的2只猪进行尸体剖检，以确认在攻击前没有任何劳森氏菌感染。在疫苗接种后5周(约8周龄)，通过口服途径给予劳森氏菌攻击，其中每只动物接种4.610logtcid50的活毒性劳森氏菌。在切除并收集于10％缓冲福尔马林中的2.5cm回肠切片上进行回肠病变评分，其用于组织病理学检查，并且用于通过免疫组织化学检测劳森氏菌的存在。打开回肠的其余部分，并目测检查粘膜表面的与劳森氏菌相关的回肠炎病变(也称为猪增殖性肠炎或ppe)的存在，包括粘膜增殖与肠壁增厚，水肿，充血，淤血，坏死和出血。对总体病变给予范围从0(正常粘膜)到5(具有出血和/或坏死的严重ppe)的评分。还收集回肠刮屑并冷冻直至分析。数据分析：回肠炎的评分基于通过组织病理学的回肠炎的显微病变评分和回肠的总体病变严重性评分。基于显微镜ihc评分测定劳森氏菌感染(定植)。qpcr用于对直肠拭子和肠粘膜刮屑中的劳森氏菌的存在，以及对粪便中的脱落的评分。结果粪便脱落：在攻击后14天(dpc)，各组之间未发现显著差异。然而，在20dpc的粪便脱落结果显示，此时疫苗接种猪的劳森氏菌脱落显著少于安慰剂组(p=0.0134)，指示疫苗接种者的恢复较早。定植：在20dpc收集的回肠刮屑的qpcr显示，劳森氏菌在接受安慰剂疫苗的组中显著更多的定植(p=0.0094)。每日增重：攻击后，与接受安慰剂疫苗的组相比，4联疫苗接种的猪中的每日增重也显著改善(p=0.0337)。结论：用根据本发明的4联组合疫苗对猪进行疫苗接种有效地保护免于劳森氏菌攻击感染诱导的感染和疾病体征。4.4.prrsv功效如上所述制备4联组合疫苗，并且包含来自在疫苗接种前从primepac™prrs疫苗的安瓿重构的prrsv。实验大纲本研究的目的是通过三周龄猪的疫苗接种，并在4.5周后用毒性prrsv攻击，来评估根据本发明的组合疫苗的prrs级分的免疫原性。各25只健康猪的2个组(抗prrsv抗体和pcv2病毒血症阴性)，在3周龄时通过肌内途径，使用2ml剂量的4联组合疫苗或使用不含prrsv的安慰剂(3-联)疫苗进行疫苗接种。所有抗原均以估计的野外剂量水平存在。在大约7.5周龄时，用prrs病毒株nadc-20鼻内攻击猪。在整个攻击后期间，针对临床观察和临床评分对猪进行评估，并收集血液和鼻拭子样品。在攻击后第14天，对所有猪进行安乐死并进行尸体剖检。对肺的总体病变进行评分，并收集肺切片和淋巴结用于组织病理学和免疫组织化学(ihc)。评估结果以测定单剂量组合疫苗在攻击感染后减少呼吸道疾病，病毒血症和/或prrsv脱落的功效。在疫苗接种时，攻击时和试验结束时记录体重。实验细节使用每个鼻孔2ml稀释的攻击材料，通过鼻内施用prrsv攻击。在临施用前不久制备攻击病毒，并在使用前和使用期间保持在冰上。总的攻击剂量为每只动物大约4.2log10tcid50。完整的4联疫苗每2ml动物剂量包含：2.0rp的mhyo抗原；7000elisa单位的劳森氏菌抗原/ml；5.7μg/ml的pcv2orf2抗原；和10^5tcid50的prrsv。数据分析在临攻击之前和攻击之后，记录呼吸窘迫和嗜睡的临床观察结果。临床评分指示从0：正常，到3：受应激时，严重的呼吸困难和/或呼吸急促和/或突出的腹式呼吸，其中通过短暂地诱导猪的快速运动诱导应激。根据halbur等人(1995,vet.pathol.,vol.32,p.648-660[附录7，参考文件1])，应用肺部评分。对宏观肺部病变给予评分，以估计受肺炎影响的肺部百分比。对每个肺叶分配多个点，以反映由该肺叶代表的整个肺的近似体积百分比。对于右前叶，右中叶，左前叶的前部和左前叶的尾部，各分配10个可能的点(背侧5个，腹侧5个)。向副叶分配5个可能的点，并且向右尾叶和左尾叶各分配27.5个可能的点(背侧15个和腹侧12.5个)，以达到总共100个可能的点。将总体肺病变评分记录为反映受prrs相关的肺炎影响的肺叶近似体积百分比的点数。将每个肺的总肺病变评分计算为所有肺叶的总体肺病变评分的总和。从每只猪取肺样品用于组织病理学检查，具体为：左中叶的尖端，一片副叶和右尾叶的前部。此外，切片取自纵隔和支气管淋巴结。将组织固定在10％中性缓冲福尔马林中，用于组织病理学和ihc。进一步收集血清样品，用于检测抗prrsv抗体；鼻拭子，用于通过定量rt-pcr检测prrsv核酸；和组织样本，用于显微镜分析和ihc。在marc145细胞系上滴定prrsv样品。对于每个重复，将连续10倍稀释物添加到含有预先形成的细胞单层的96孔板中的10个孔，并将平板在5％co2，35-39℃孵育5天。然后，固定平板并用抗prrsv荧光抗体染色，并通过ift评分。通过分析攻击后时段的临床观察和临床评分，体温，体重，鼻脱落和通过pcr测定的病毒血症，以及攻击后14天的肺病变的宏观和显微镜分析，来评估疫苗接种效力的结果变量。通过宏观肺病变评分，来评估呼吸道疾病。功效的次要变量通过组织病理学和ihc的组织分析，最大病毒血症量，最大脱落量，攻击后的体重增加，攻击后的临床观察和攻击后的呼吸临床评分。结果肺病变评分的中值(以累及肺的%计)为：安慰剂疫苗组为20％，对比4联疫苗组为7％(p=0.0014)。三个收集的肺样品的组织病理学评分为0(正常)至4(严重间质性肺炎)的等级。最高评分对安慰剂疫苗组为3，相比对于4联疫苗组为2(p=0.0010)。将肺样品免疫组织化学评分为0(无prrsv-抗原阳性细胞)至4(每组织切片>100个阳性细胞)的等级。三个收集的肺样品的评分的最大值对于安慰剂疫苗组为2，相比对于4联疫苗组为1(p=0.0006)。结论：用根据本发明的4联组合疫苗对猪进行疫苗接种有效地保护免于prrsv攻击感染诱导的感染和疾病体征。当前第1页12当前第1页12